Indringende nicotinerge Acetylcholine Receptor functie in muis segmenten van de hersenen via Laser Flash fotolyse van Photoactivatable Nicotine

Deze techniek maakt gebruik van multi-photon laser-scanning microscopie in combinatie met laser-flash fotolyse van een fotoactiviteit nicotine molecuul. Het toestaan van nauwkeurige activering van nicotinic cholinerge receptoren. Deze techniek zorgt voor fijne spatiotemporale controle over nicotinische receptor agonistische toepassing, het verstrekken van een krachtig instrument voor de studie van receptor functionele expressie patronen en cholinerge synaptische of volumetransmissie.

Gebruik voor het begin van de procedure een programmeerbare pipettrekker om een glazen micropipet met een openingsdiameter van 20 tot 40 micrometer te trekken. Zeef ongeveer een milliliter opnameoplossing door middel van een 0,22-micron filter. En resuspend genoeg lyophilized fotoactivatable nicotine in de gefilterde opname-oplossing om een twee-millimolar uiteindelijke concentratie opleveren.

Vul de getrokken lokale toepassingsmicropipet met 50 microliters van het fotoactivatable medicijn en bevestig de pipet in een pipethouder die op een micromanipulator is gemonteerd. Sluit de pipethouder via een geschikte lengte van de slang aan op een drukuitwerpsysteem dat een langdurige lagedruktoepassing kan dragen. En gebruik de micromanipulator om de lokale toepassing pipet manoeuvreren in de extracellulaire opname-oplossing.

Plaats de pipet tip iets boven een muis hersenweefsel monster, ongeveer 50 micrometer van de cel van belang. En kort een tot twee pond per vierkante centimeter druk op de pipet. Er mag minimaal tot geen verplaatsing van de cel van belang zijn.

Na het bereiken van een stabiele hele-cel patch klem, zet de lage toepassing op de druk uitwerping apparaat, en verzadigen het weefsel rond de cel met fotoactivatable nicotine voor een tot twee minuten. Lokale toepassing introduceert extra complexiteit van het experiment. Maar het spaart verbinding en maakt het mogelijk hogere concentraties van PA-Nic te worden gebruikt.

Voor badtoepassing van de fotoactivatable nicotine, eerst oplossen genoeg van de lyophilized drug in een volume van de opname oplossing geschikt voor continue recirculatie naar een 100-micromolar uiteindelijke concentratie. En laad het resulterende mengsel in een perfusiesysteem. Begin dan met recirculatie van de fotoactivatable nicotineoplossing met een snelheid van 1,5 tot 2 millimeter per minuut, met behulp van buizen met een minimale binnendiameter en totale lengte om het vereiste recirculatievolume te minimaliseren.

Tijdens recirculatie, continu bellen de oplossing met carbogen, en handhaven van de badtemperatuur op 32 graden Celsius onder omstandigheden met weinig licht. Badtoepassing profiteert van de eenvoud en uniformiteit van PA-Nic doordronving van het weefsel. Maar het noodzakelijkerwijs maakt gebruik van lagere micromolar PA-Nic concentraties, en besteedt hogere totale hoeveelheden verbinding.

Voor live visualisatie van een mediale habenula neuron, gebruik uitgezonden licht of infrarood differentieel interferentie contrast optica en een videocamera om een stabiele, hele cel patch klem opname vast te stellen. Na het instellen van de celgevoegde configuratie met hoge weerstand, maar voordat u inbreekt, schakelt u de installatie en de software in de laserscanmodus. Na het inbreken, gebruik laser scanning om te controleren of de beeldvorming kleurstof van belang is passief vullen van het neuron door diffusie.

Laat de kleurstof om de cellulaire compartimenten te vullen voor ten minste 20 tot 30 minuten voor het gebruik van de live scan functie om het neuron en subcellulaire compartiment van belang te visualiseren. Selecteer beeldparameters die een nauwkeurige live visualisatie van de neuronale functies mogelijk maken, waarbij de juiste instellingen worden gemanipuleerd om de weergavevisualisatie, resolutie, signaal-ruisverhouding en de aankooptijd van het beeldframe zo nodig te beïnvloeden of te wijzigen. Open het venster van de opzoektafel en past de instellingen van de opzoektafel en plafond aan om het signaalcontrast te verbeteren.

Als u een interessegebied in het weefsel wilt vinden, selecteert u de optische zoom van 1x en gebruikt u de panning-besturingselementen. Gebruik het gereedschap Z-serie om een begin- en stoppositie te selecteren die de cel van belang bevat. Stel een stapgrootte in van één micrometer en selecteer een afbeeldingsgrootte die een afbeelding met de hoogste resolutie oplevert.

Vaak 1, 024 bij 1, 024 pixels per regel. Dan achtereenvolgens beeld van het neuron in elk Z-vlak dat de cel bevat. Om de laserstimulatie te kalibreren, start u het scannen van het systeem met een laservermogen dat groter is dan minimaal en verfijnen u de objectieve focus op de dunne rode markerfluorescentielaag.

Selecteer een gebied binnen het fluorescentieveld vrij van vuil en gelijkmatig bedekt met markering, en open het menu gereedschappen, kalibratie en uitlijning om de niet-kwaderende galvocalibratiefunctie te selecteren. Volg de brandplek tutorial voor de ruimtelijke kalibratie van de tweede galvanometer spiegel paar, het selecteren van de 405-nanometer laser, een laser stimulatie vermogen van 400, en een stimulatie duur van 20 milliseconden. Om gaten met een diameter van één tot vijf micrometer in de rode markering op te leveren.

Selecteer bijwerken om de afbeelding te stimuleren en te vernieuwen nadat de middelste vlek is verbrand en verplaats de ronde rode indicator naar de werkelijke pleklocatie van het midden, rechtscentrum en lager middelpunt om een raster van negen plekken te verkrijgen. Als u de kalibratie wilt testen, opent u het venster markeringspunten en activeert u handmatig de stimulatieparameters van de gedefinieerde vlekken in een nieuw gebied van het monster, waarbij u ervoor wilt zorgen dat het juiste laatste kalibratiebestand in het venster markpunten wordt geladen. Breng vervolgens een testpuls toe om de juiste kalibratie te verifiëren.

Als u het subcellulaire interessegebied kort wilt beelden en lokaliseren, selecteert u live scannen en gebruikt u de optische zoom vergroten om eventuele kleine structuren zo nodig te visualiseren. Plaats het markeringspunt crosshairs direct naast het celmembraan en stel de fototimulatieparameters in op een duur van één tot 50 milliseconden, een laservermogen van één tot vier milliwatt en ten minste één proef. Selecteer vervolgens markeringspunten om het markeringspuntenprotocol te starten en observeer de gegevensverwerving van elektrofysiologie in realtime.

Fotoactivatable nicotine 2PE fluorescentie van een-millimolar PA-Nic is gemakkelijk gedetecteerd tijdens druk uitwerping van een lokale toepassing pipet zoals aangetoond. Terwijl de levering van de belangrijkste fotochemische producten van de fotoactiviteitbare nicotinefotolysereactie geen fluorescerend signaal bij dezelfde concentratie en opwindingskracht en golflengte genereert. Het aantonen van de specificiteit van de fotoactivatable nicotineresultaten.

Beeldvorming van de fotoactiviteitbare nicotine toegepast op het hersenweefsel zoals aangetoond onthult de aanwezigheid van het geneesmiddel binnen 100 tot 200 micrometer van de lokale toepassing pipet. Bevestigen dat fotoactiviteitbare nicotine effectief kan worden geleverd aan het hersenweefsel via lokale toepassing. Hier worden beelden van hoge kwaliteit getoond waarbinnen de neuronale morfologie compleet lijkt te zijn, het geluid wordt geminimaliseerd en het puin de interpretatie van de cellulaire morfologie niet verstoort.

Deze beelden zijn echter van een lagere kwaliteit. Als gevolg van een lagere signaal-achtergrond verhouding en aanzienlijke puin. Het koppelen van twee-foton laser scanning microscopie van mediale habenula neuronen in de hersenen plakjes met laser flash fotolyse van PA-Nic zoals aangetoond, zorgt voor de verzoening van elektrofysiologische reacties met cellulaire morfologie.

Single-spot fotolyse uitgevoerd met intervallen van 10 seconden zorgt voor een voldoende hersteltijd voor de basislijn holding stroom. Terwijl een kortere interval van één seconde leidt tot een geleidelijke toename van de holdingstroom naarmate het protocol vordert. Wat suggereert dat de nicotine niet genoeg tijd heeft om zich met de kortere intervallen van het systeem af te schunken.

Bij het ontwerpen van experimenten die gebruik maken van fotoactivatable moleculen, is het belangrijk om te onthouden om fluorescerende indicatoren te selecteren en fluoroforen te rapporteren met compatibele excitatie emissiespectra. PA-Nic is compatibel met de meest voorkomende fluoroforen vanwege de korte golflengte fotolyse piek. Bij het kiezen van de meest geschikte PA-Nic toepassingstechniek is het belangrijk om zorgvuldig na te denken over de functionele expressie, fysiologische activiteit van de nicotinische receptoren in de neuronen van belang.

Ervaren gebruik van deze techniek zorgt voor fijne spatiotemporale controle van nicotine toepassing, die spannende nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de kinetiek van inheemse nicotinische receptor betrokkenheid, subcellulaire lokalisatie, en modulatie van neuronale activiteit door nicotinische receptor activering mogelijk maakt.