Name: Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer een microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de ganglionaire eminentie van E13-muizenembryo's. Dit protocol levert hoge opbrengsten aan levensvatbare cellen voor neurogenese-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Instituut van Royan.

Alle chirurgische ingrepen en procedures op dier goedgekeurd door het dierenethiek Comité van het Instituut van Royan, Teheran, Iran.
1. bereiding van chirurgische instrumenten, wassen Buffer (HEPES-MEM), cel cultuurmedia en cel cultuur platen
<ol><li>Steriliseren de chirurgische instrumenten (schaar, scalpel blad handvat en forceps) in autoclaaf die hen gebaseerd op de richtsnoeren van de routine sterilisatie.</li>
	<li>Bereiden van een voldoende hoeveelheid HEPES-MEM buffer (ongeveer 100 mL is genoeg voor elke zwangere muizen). Hoge concentraties van antibiotica (penicilline/streptomycine 10%) toevoegen aan de HEPES-MEM-buffer. Deze concentratie van antibiotica is noodzakelijk om het risico van bacteriële besmetting.<ol>
<li>Ter voorbereiding HEPES-MEM buffer, 0.5958 g HEPES poeder toevoegen aan 100 mL MEM (minimale essentiële medium) en meng goed. Breng de pH op 7.3-7.4 en filteren het medium gebruik een 0,22 µm filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maken van NSC middellange met neurobasal medium (NB), aangevuld met 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% 100 x N2 supplement of 1% B27 aanvulling (zonder vitamine A), 1 U/mL heparine, 1% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuur (NEAA), 1% penicilline/streptomycine, en 0.1 mM β-mercaptoethanol.</li>
</ol>2. dierlijke chirurgie en Micro-dissectie
<ol><li>Een zwangere muis anesthetize op de 13th dag van de dracht (hier, gebruik BALB/c stam 4 maanden leeftijd) door intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine, 100 mg/kg en de 10 mg/kg door lichaamsgewicht respectievelijk.<ol>
<li>Diepe verdoving bevestigen door een pijnlijke prikkel (bijvoorbeeld snuifje met een tang) van het dier voet uit te oefenen en wanneer er geen pijn reflex, het dier te offeren door cervicale dislocatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schoon en desinfecterende de huid van de buik door het sproeien van 70% ethanol.</li>
	<li>Controle van de huid op de buik en snijd vervolgens de huid en de onderliggende fascia met een schaar te ontdekken van de buikholte en de baarmoeder horens.<ol>
<li>Verwijderen van de baarmoeder horens de embryo's bevattende schaar en ze vervolgens overbrengen naar een conische tube van 50 mL, met 25 mL koude HEPES-MEM-buffer.</li>
		<li>De conische buis onder de motorkap laminaire flow en het GLB onder de motorkap open. Breng de baarmoeder horens uit de buis en spoelen 3 keer met genoeg volume van de verse koude HEPES-MEM buffer om vuil en bloed te elimineren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De baarmoeder weefsel overbrengen in een 10 cm petrischaal met 7-10 mL koude HEPES-MEM-buffer. Open de baarmoeder horens fijne schaar en overdracht embryo's met een nieuwe schotel met 7-10 mL koude HEPES-MEM-buffer. Nu zetten de 10 cm schotel met embryo's onder de ontleden Microscoop voor de werking van de micro-dissectie.</li>
	<li>Buig het uiteinde van een naald van de spuit 25-27 G door het indrukken van de tip over een stalen scalpel blad handvat. Buig het uiteinde van de naald tot de tip is gebogen onder een hoek van 70-90°. Controleer het uiteinde van de naald onder de ontleden Microscoop om te zien de bocht op het puntje van de naald. Opmerking: Natuurlijk embryo's hebben een laterale positie in de schotel.</li>
	<li>Zonder dat hun positie, houden de nek en het lichaam van het embryo met een fijne Tang en voeg vervolgens het gebogen deel van de naald-tip in de frontale fontanelle, van de embryo's hoofd. Zou er kleine bloeding of er een bloedstolsel.<ol>
<li>Beweeg de naald tip oppervlakkig. Terwijl het gebogen deel binnen de Ardennen naar het voorhoofd en vervolgens naar de achterkant van het hoofd is, zorg ervoor om dwars door de huid en de schedel en niet naar de onderliggende hersenen beschadigen.</li>
		<li>Druk op de huid met het topje van de naald lateraal te ontdekken van de hersenen en steek de naald van de laterale kant van de huid naar het gebied onder de hersenen. Verwijder de hersenen van de schedel door duwen te komen van de ontleed schedel.</li>
		<li>Houd de hersenen gestage met behulp van de gebogen verlostang en snijd de cortex van elk halfrond met behulp van de micro-schaar om de ganglionaire eminentie bloot te stellen.</li>
		<li>Houden van de hersenen en plaats de ontleed ganglionaire eminentie naar de 15 mL centrifugebuis met neurale stamcellen medium. De ganglionaire eminentie blijkt duidelijk met de Midden- en laterale delen.</li>
		<li>Herhaal deze procedure totdat alle de hersenen micro-ontleed zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Snijd de ontleed ganglionaire eminentie door het plaatsen van de pipet tip tegen de onderkant van de buis. Pipetteer de schorsing op en neer 4 tot 5 keer te breken van het weefsel voor de schorsing van een enkele cel.<ol>
<li>Centrifugeer de schorsing bij 110 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL trypsine-EDTA 0,05%.</li>
		<li>Incubeer de celsuspensie in een 37 ° C gedurende 10 minuten, en voegt u een gelijkwaardige hoeveelheid soja trypsine remmer (25 µg/mL) om te stoppen met de trypsine-activiteit. Pipetteer de celsuspensie omhoog en omlaag om ervoor te zorgen dat de trypsine totaal geïnactiveerd is geweest.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 110 x g voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL van volledige NSC medium en het aantal cellen tellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De cellen (2 x 105 cellen/mL) op de NSC middellange in de geschikte grootte weefselkweek kolf plaat. Breng 5 mL T25, 20 mL T75 en 40 mL tot T175 kolven. Opmerking: Neurospheres verschijnt na 3-daags cultuur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Na 6-7 dagen, de bollen moeten meten tussen 150-200 µm in diameter en klaar zal zijn voor subcultuur. Door het cultiveren van een miljoen primaire NSCs na zeven dagen zal het aantal cellen toenemen tot 3-4 miljoen.</li>
</ol>3. trypsinebehandeling en Passaging van Neurospheres
<ol><li>Naar subcultuur de neurospheres, het medium met de zwevende neurospheres overbrengen in de centrifugebuis, centrifugeer bij 110 x g gedurende 5 min en vervolgens Verwijder het supernatant. Voeg 1 mL trypsine-EDTA 0,05% en Incubeer bij 37° C gedurende 10 minuten.<ol>
<li>Inactivering van de trypsine met behulp van soja trypsine remmer en Pipetteer de neurospheres zachtjes op en neer aan make single hen cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 110 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL van NSC medium. Deze cellen zijn klaar voor de volgende subcultuur of cultuur op Laminin en Poly-L-Ornithine gecoate oppervlakken voor geavanceerde experimenten.</li>
	<li>Voor de volgende subcultuur, NSCs Pipetteer in het nieuwe vat (Volg stap 2.8) en cultuur van hen in het NSC-medium. Gecoate platen (figuur 1B) voor de inductie van de neuronale differentiatie cultuur, NSCs in het medium van de NSC in de afwezigheid van bFGF en EGF op Laminin en Poly-L-Ornithine.</li>
	<li>Voor de procedure van de coating, volledig jas het celoppervlak cultuur door genoeg volume van de verdunde oplossing van de poly-L-ornithine (25 µg/mL) toe te voegen aan de cel cultuur plaat en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.<ol>
<li>Gecombineerd de poly-L-ornithine en spoel het goed 2 x met PBS. Voeg genoeg volume van 5 µg/mL laminin volledig beslaan de oppervlakte van de cultuur en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 h. Aspirate de laminin voor de plating cellen of opslaan van de plaat bij 4 ° C totdat het nodig is.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Stroom Cytometry Assay
Opmerking: De expressie van specifieke markers van NSCs, zenuwcellen en gliacellen kan worden gemeten door stroom cytometry assay13. Het protocol is gebaseerd op Menon et al.,13 met kleine wijzigingen.
<ol><li>Distantiëren van de neurospheres of los gekweekte NSCs van gecoate platen door trypsinebehandeling te maken hen afzonderlijke cellen. 500 µL van fixatie buffer (2% paraformaldehyde (PFA) in PBS) toevoegen aan 100 µL van de celsuspensie (ongeveer 1 miljoen cellen zijn genoeg voor kleuring met elke antilichaam), en vervolgens uit te broeden de buizen op RT gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Wash cellen door 1 mL PBS toe te voegen aan de buis en centrifugeer bij 110 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van de cel, waardoor ongeveer 100 µL in de buis.<ol>
<li>Permeabilize cellen met Tween-20 (0,7% Tween-20 in PBS) door toevoeging van 500 µL van Tween-20 buffer aan 100 µL celsuspensie. Incubeer de buizen op RT gedurende 15 minuten op een roteerschudapparaat (100 rpm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal het centrifugeren en de PBS-wash. Verwijder het supernatant van de buizen volledig, alleen de pellet achterlatend. Voeg 100 µL van verdunde primaire antilichamen (konijn anti muis βtub-III, GFAP en Nestin van antilichamen bij 1:200 concentratie) in verdunning buffer met 1% bovien serumalbumine, 10% serum (geit serum) en 0,5% Tween-20 in PBS en zachtjes triturate te mengen. Incubeer de buizen op RT gedurende 30 minuten op een roteerschudapparaat.</li>
	<li>Wassen van de cellen een keer met PBS en verwijder de bovendrijvende substantie van de buizen volledig, alleen de pellet achterlatend.<ol>
<li>Voeg 100 µL van verdunde secundair antilichaam (geit anti konijn FITC-geconjugeerd 1:500 concentratie) in PBS op de cel pellet en zachtjes triturate te mengen. Incubeer de buizen op RT gedurende 30 minuten op een shaker in het donker.</li>
		<li>Wassen van de monsters 2 x met PBS en daarna wassen met stroom buffer. Centrifugeren en resuspendeer de cellen in ongeveer 150 µL van stroom buffer voor flow cytometer analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Navarro Quiroz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+in+Neuronal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling in Neuronal Stem Cells.</a> Cells. 7 (7), (2018).</li>
<li>Choi, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Thrombin+Receptor+Restricts+Subventricular+Zone+Neural+Stem+Cell+Expansion+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9360(2018).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+novel+rat+neural+progenitor+clone+that+expresses+Dlx+family+transcription+factors+and+gives+rise+to+functional+GABAergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture.</a> Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+phenotypically+diverse+neural+culture+from+hESC+by+combining+adherent+and+dissociation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2018).</li>
<li>Dhara, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+progenitor+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures.</a> Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).</li>
<li>Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Biopsy+Method+for+Isolating+Neural+Stem+Cells+from+the+Subventricular+Zone+of+the+Adult+Rat+Brain+for+Autologous+Transplantation+in+CNS+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries.</a> Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li>
<li>Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerrari%2C+D+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22">Current Protocols in Stem Cell Biology</a>. , Chapter 2 Unit2D.6 (2010).</li>
<li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature Protocols. 7 (2012), (2005).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Number+is+a+Major+Contributor+to+Genomic+Structural+Variations+in+Mouse+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs.</a> Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).</li>
<li>Diaferia, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Chromosomal+Analysis+of+Cultured+Mouse+Neural+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines.</a> Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).</li>
<li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Neural+Stem+Cells+Achieve+Long-Term+Survival+and+Functional+Integration+in+the+Adult+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Protocols+for+Surface+and+Intracellular+Antigen+Analyses+of+Neural+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), 52241(2014).</li>
<li>Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnesium+lithospermate+B+promotes+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+in+vitro+and+enhances+neurogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo.</a> Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).</li>
<li>Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+as+positive+regulator+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation.</a> Neuroscience. 364, 107-121 (2017).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+differentiation+from+human+neural+stem+cells%3A+A+novel+role+for+c-Src%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src.</a> Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).</li>
<li>Palanisamy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxytocin+alters+cell+fate+selection+of+rat+neural+progenitor+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191160(2018).</li>
<li>Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+dynamic+synaptic+reorganization+after+GABAergic+precursor+cell+transplantation+into+adult+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).</li>
<li>Precious, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP1+marks+medium+spiny+neurons+from+precursors+to+maturity+and+is+required+for+their+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation.</a> Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).</li>
</ol>

Geen belangenconflict verklaard.

Met behulp van een geschikte bron van neurale stamcellen is zeer belangrijk voor neurowetenschappers. Neurale stamcellen kan worden geoogst uit verschillende gebieden van de hersenen van embryo en ze kunnen het genereren van specifieke soorten zenuwcellen en gliacellen. Er zijn verschillende methoden voor de inductie van differentiatie van neurale stamcellen voor het opwekken van hen voor het genereren van volwassen zenuwcellen en gliacellen. Er zijn talrijke rapporten die aangeeft dat zij onder de voorwaarden van de spe...

Neurale stamcellen (NSCs) bevinden zich in verschillende regio's van de volwassene en embryo hersenen en ze hebben de neiging om het genereren van verschillende soorten neuronen en gliale cel1. De subventriculaire zones in de volwassen zoogdieren hersenen2 en ganglionaire eminentie in de hersenen embryo zijn NSC rijke regio's3. In de ontwikkelende hersenen levert de ganglionaire eminentie allermeest naar de corticale interneuronen en met name GABAergic interneuronen3. Er zijn ook minder invasieve methoden voor neurale stamcellen generatie vanaf embryonale stamcellen (SER's) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) die het verminderen van de vraag naar dier gebruiken. Ondanks het feit dat het genereren van NSCs van sociaal-economische raden of iPSCs mogelijk4,5 is, heeft het een aantal voordelen en nadelen vergeleken met het isolement van neurale stamcellen uit de volwassen of embryonale hersenen6,7, 8. De protocollen voor de differentiatie van SER's en iPSCs richting neuronale fenotypen inducerende zijn altijd tijd en kosten consumeren en het tarief van succes (70-80% Nestin positieve cellen)5 is lager in vergelijking met de directe isolatie van NSCs uit de dierlijke hersenen ( meer dan 99% Nestin positieve cellen)9. Bovendien verliezen stamcellen hun genetische stabiliteit en differentiatie neiging na verscheidene passages10,11. Hoewel er andere nieuwe rapporten over directe omzetting van somatische cellen in NSCs, deze cellen zijn genetisch gemanipuleerde en zijn niet gemakkelijk toegankelijk in elk lab12. Daarom, is er nog steeds een grote vraag voor isolatie van neurale stamcellen van de dierlijke hersenen; het is mogelijk om het verminderen van de hoeveelheid dierlijke gebruik door het verbeteren van de chirurgische technieken. Door verkorting van de chirurgische en verbetering van de technieken, is het mogelijk om te houden van de cellen uit de buurt van schade en het hoogste percentage van NSCs te verkrijgen van elk dier.
Hier introduceren we een vereenvoudigde en reproduceerbare techniek voor isolatie van neurale stamcellen van muis E13 embryo hersenen.

<table><tbody><tr><td>15 mL tubes</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps, 12 cm, Straight</td><td>WPI</td><td>14226</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>dish 10cm&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight</td><td>WPI</td><td>15908</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers, 11 cm, Straight</td><td>WPI</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody</td><td>Sigma</td><td>AP307F</td><td></td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Heparin&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>h3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>90909C</td><td></td></tr><tr><td>insulinsyringe with 25-27 gauge Needle&nbsp;</td><td>SUPA medical</td><td>A1SNL127</td><td></td></tr><tr><td>laminin</td><td>sigma&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NB medium</td><td>Gibco</td><td>21103-31</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acid (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS without Ca and Mg</td><td>Gibco</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/ Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>5140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;P4957</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti mouse GFAP antibody</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti mouse Nestin antibody</td><td>Sigma</td><td>N5413</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>WPI</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Scissors curve</td><td>WPI</td><td>14396</td><td></td></tr><tr><td>Scissors sharp straight</td><td>WPI</td><td>14192</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Roche</td><td>10109886001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flasks, T25</td><td>BD</td><td>353014</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flasks, T75</td><td>BD</td><td>353024</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors,&nbsp; 8 cm, Straight&nbsp;</td><td>WPI</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neurale stamcellen (NSCs) zijn multipotente en aanleiding kunnen geven tot de drie grote celtypes van het centrale zenuwstelsel (CNS). In vitro cultuur en uitbreiding van de NSCs zorgen voor een geschikte bron van cellen voor neurowetenschappers te bestuderen van de functie van neuronen en gliale cellen samen met hun interacties. Er zijn verschillende gerapporteerde technieken voor de isolatie van neurale stamcellen uit volwassen of embryonale zoogdieren hersenen. Tijdens de microchirurgische operatie te isoleren NSCs uit verschillende regio's van de embryonale CNS, is het zeer belangrijk ter beperking van de schade aan de hersencellen te verkrijgen van de hoogste verhouding van live en uitbreidbaar stamcellen. Een mogelijke techniek voor spanningsvermindering tijdens isolatie van deze cellen uit de hersenen van muis embryonale is de vermindering van de chirurgische tijd. Hier tonen wij een ontwikkelde techniek voor snelle isolatie van deze cellen van de E13 muis embryo ganglionaire eminentie. Chirurgische procedures omvatten E13 muis embryo's uit de baarmoeder, snijden de frontale fontanelle van het embryo met een gebogen naald tip, het uitpakken van de hersenen van de schedel, de microdissection van de geïsoleerde hersenen om te oogsten van de ganglionaire eminentie, oogsten dissociatie van het geoogste weefsel op NSC middellange tot het krijgen van een enkele celsuspensie, en ten slotte plating cellen in schorsing cultuur voor het genereren van neurospheres.

Micro-dissectie, cel isolatie en Neurosphere cultuur. Hier voorgesteld hebben we een snelle en efficiënte methode voor muis E13 hersenen microchirurgie en isolatie van neurale stamcellen. Dit artikel toont dat het mogelijk is om het hele brein van een muis voor E13 met de schedel embryo door middel van een mooie breuk in de frontale fontanelle is. Met deze methode de hersenen verdraagt minder schade en het is mogelijk om te isoleren van cellen uit ve...

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Het doel van dit videoprotocol is het vaststellen van een bron en efficiënt protocol voor embryonale muis neurale stamcelisolatie en -cultuur. Hallo, ik ben Maryam Sadeghi-Zadeh. Ik ben een master student cellulaire en moleculaire biologie in Royan Institute.Vandaag willen ik en mijn collega je laten zien hoe je neurale stamcel oogsten van 13 embryomuis ganglionic eminentie. Hallo, ik ben Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Ik ben een master student voor cellulaire en moleculaire biologie in de stemcel afdeling van Royan Instituut voor Biotechnologie.Hallo, ik ben Reza Dehghani-Varnamkhasti. Ook studeer ik cellulaire en moleculaire biologie aan het Royan Instituut. Chirurgische ingrepen omvatten het oogsten van elke 13 muisembryo's uit de baarmoeder.Het snijden van de voorkant van fontanel van embryo met een gebogen naald tip het extraheren van de hersenen uit de schedel. Micro-dissectie van geïsoleerde hersenen om de ganglionic eminentie te oogsten. Dissociatie van het geoogste weefsel in een neurale stamcel medium om een enkele cel suspensie te krijgen.En tenslotte, plating cellen in een suspensie cultuur om zenuwcellen te genereren. Reinig en ontsmettingsmiddel de huid van de buik geb

isolation-and-culture-of-embryonic-mouse-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de methode die wordt gebruikt voor het isoleren van neuroprecursors uit de ontwikkelingslanden cortex van embryonale muizen. De procedure voor het verwijderen van embryo's uit de baarmoeder, het ontleden van de corticale weefsel, en verteren de geïsoleerde cerebrale cortex wordt weergegeven.

Cultuur van Mouse Neurale Stem Cell Voorlopers

Deze video toont protocol de toepassing van de neurosphere test voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen van het ganglionisch eminenties van embryonale dag 14-hersenen van muizen.

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

Een alternatieve manier van isoleren van muis embryonale motorneuronen van het ruggenmerg wordt beschreven. De methode houdt rekening met het feit dat de lectine kan binden aan de lage affiniteit zenuw groeifactor receptor p75NTR. Deze lectine-based preplating kan een zuivering vergelijkbaar met die met een specifiek antilichaam tegen de p75NTR.

Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik...

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The video demonstrates the process of isolating and culturing neural stem cells from the mouse brain's subcallosal zone. It involves dissecting tissue, enzymatic dissociation, and culturing them with differentiation factors to develop into mature neural cells.

Isolation and Culturing of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.

Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek

Het opzetten van cultuursystemen voor de expansie van volwassen neurale stamcellen (aNSCs) maakt het mogelijk om aNSCs te onderzoeken en toe te passen voor therapie. De subcallosale zone (SCZ) is onlangs herkend als een nieuwe neuroblastvormende regio in volwassen muizen. Hier worden methoden beschreven voor de isolatie, expansie en differentiatie van SCZ-aNSCs.

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Leer een microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de ganglionaire eminentie van E13-muizenembryo's. Dit protocol levert hoge opbrengsten aan levensvatbare cellen voor neurogenese-onderzoek.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Meer video's verkennen