Nieuwe reeks ontdekking door subtractieve Genomics

Ons protocol is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om genomische sequenties te identificeren die niet kunnen worden geïsoleerd van co-zuiverende sequenties, die zelf slechts gedeeltelijk bekend kunnen zijn. De belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het goedkoop is, met behulp van meestal gratis software die kan worden gedownload en flexibel. Je het toepassen op veel biologische vragen.

Mogelijke toepassingen zijn het identificeren van bacteriële vaccindoelen en het identificeren van virussen waarvan de sequenties zeer verschillend zijn van bekende microben. Deze methode kan worden toegepast op elk systeem waarin het onbekende niet experimenteel kan worden gescheiden, zolang de referentiesequentie zonder het genomische doel beschikbaar is. Deze techniek vergt wat trial and error, dus geduld is belangrijk.

Het kan nodig zijn om problemen te schieten de programma's. U programma's gebruiken die verschillen van de programma's die we hier beschrijven. Gebruik de gebruikershandleidingen zoveel mogelijk.

Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat rekenwerk afhankelijk is van een basiskennis van hoe command line programming is gestructureerd. Gebruik om te beginnen Trimmomatic 0.32 om illuminaadapters en lage kwaliteitsbases te verwijderen. Gebruik Pear-versie 0.9.11 om samengevoegde reads van hoge kwaliteit te maken op basis van met aangepaste uitvoer met standaardparameters.

Gebruik vervolgens Reptile versie 1.1 om fout te corrigeren de leest geproduceerd door Pear. Gebruik ten slotte Trinity versie 2.4.0 in de standaardmodus om de gecorrigeerde sequenties te monteren. Gebruik voor strengspecifieke bibliotheken de parameter SS_lib_type.

De uitvoer is een FASTA-bestand dat wordt geplaatst in een nieuwe directory genaamd trinity_output. Maak een BLAST-database van de referentiereeks nucleotide_reference. fasta op de commandolijn.

BLAST heeft de query gekoppeld aan de referentiedatabase. Gebruik BLAST_results om een uitvoerbestand te verkrijgen. txt Om tabelvormige uitvoer te genereren die nodig is voor subsequence-verwerkingsstappen met Python-scripts, gebruikt u outfmt 6 Voor verhoogde stringentie, gebruikt u eiwitsequenties uit de assemblage als de BLAST-query met vertaalde nucleotide BLAST, die zeswegvertaling van de nucleotide-database uitvoert.

Voer de TransDecoder uit om eiwitsequenties voor de query te verkrijgen. De opdracht Long0rfs om de langste open leesframes van geassembleerde querysequenties te identificeren. Nu lopen tblastn.

Zorg er indien nodig voor dat de juiste genetische code wordt geselecteerd voor het organisme dat wordt bestudeerd met behulp van de db_gencode met de juiste codeoptie. Als er een hoogwaardige eiwitreferentie beschikbaar is, gebruik dan eiwit-eiwit matching met blastp in plaats van tblastn Maak een BLAST-database van de eiwitreferentie. Zorg ervoor dat u het resultaat opslaat als een bestand voor downstreamverwerking en gebruik tabelvormige uitvoer om ervoor te zorgen dat de Python-scripts ze correct kunnen ontleden.

Gebruik nu het subtractieve Python-script om overeenkomende sequenties te verwijderen. Als u de reads op de assemblage wilt toewijzen, gebruikt u BWA-MEM-versie 0.7.12 of bowtie 2 om de gedownloade ruwe leest op de queryassemblage in kaart te brengen. Eerst indexeren van de montage, dan in kaart de leest.

De uitvoer wordt SAM-formaat. Voer het Python-script removeUnmapped uit. py met behulp van het SAM-bestand als invoer.

Hiermee worden de namen van queryreeksen aangegeven zonder dat er een overeenkomend artikel wordt gelezen en wordt deze opgeslagen in een nieuw tekstbestand. De uitvoer van de vorige stap is een lijst met sequenties namen in een txt-bestand. Haal een FASTA-bestand met deze sequenties.

De uitvoer zal een fasta-bestand zijn. Gebruik Genius om optimale primersequenties handmatig te bepalen. Markeer een kandidaat-reeks van 21 tot 28 basisparen voor de voorwaartse primer, waarbij runs van vier of meer van elke basis worden vermeden.

Probeer een regio te targeten met een vrij uniforme combinatie van alle basisparen. Een enkele G of C op drie Prime End is gunstig, helpen om de primer te verankeren. Klik op het tabblad Statistieken aan de rechterkant van het scherm om de geschatte smelttemperatuur van die reeks weer te geven terwijl het kandidaat-gebied wordt gemarkeerd.

Streef naar een smelttemperatuur tussen 55 en 60 graden Celsius, terwijl het vermijden van herhalingen, en lange runs van G C.Kies een omgekeerde primer op dezelfde manier, gelegen 150 tot 250 basisparen drie primer van de voorwaartse primer. Hoewel de primerlengtes niet hoeven overeen te komen, moet de voorspelde smelttemperatuur zo dicht mogelijk bij die van de voorwaartse primer liggen. Zorg ervoor dat u de volgorde omkeren door met de rechtermuisknop in Genius te klikken terwijl een reeks wordt gemarkeerd in een menuoptie.

Een alternatieve methode is het gebruik van de functie Primer Design, die wordt gevonden in de bovenste werkbalk in het venster Reeks. Voeg de regio in om te versterken onder Doelgebied. Voeg onder het tabblad kenmerken de gewenste grootte, smelttemperatuur en procent G C in en klik op OK om primers te laten genereren.

Om kwantitatieve PCR-validatie van de resterende reeks uit te voeren, moet u eerst een reactiemengsel voor elke sjabloon in drievoud bereiden, met onze SYBR Green Master Mix, voorwaartse en omgekeerde primers en water, voor een totaal volume van 25 microliter. Voer een qPCR-programma uit dat wordt geïnformeerd door de eerder gevalideerde temperatuur- en verlengingstijd. Definitieve denaturerende curven moeten ten minste worden gegenereerd de eerste keer dat de primers worden gebruikt in qPCR om de versterking van een enkel DNA-product te valideren.

Meet de qPCR SYBR Groene signalen ten opzichte van Actin by Ct Voor alle gevallen, bereken het gemiddelde, en de standaarddeviatie van twee tot de Ct ten opzichte van Actin. Voer eindpuntgele elektroforese uit om de juiste detectie van de productgrootte door qPCR te bevestigen. Hier, lopen 25 microliter van de qPCR product gemengd met vijf microliter 6X Glitterol kleurstof op een 2%TAE Agarose gel op 200 volt gedurende 20 minuten.

Als uw qPCR aangeeft dat u de doelsequenties niet hebt geïdentificeerd, herhaalt u de hele cyclus met een nieuwe referentie, die kan worden verkregen uit een online database. Het subtractieve project begon in dit geval met het sequencing van het RNA van kiemgelijnd weefsel van mannelijke en vrouwelijke volwassen zebravink. Uiteindelijk werden 935 somatische genen geïdentificeerd die niet eerder in de hele genoomannotatie waren opgenomen.

Na computationele filtering kan kwantitatieve PCR een negatief resultaat opleveren waarbij er geen verschil was in detectie tussen vogelweefsels. Omgekeerd wordt een positief resultaat dat de identificatie van een True Target Sequence vertegenwoordigt bevestigd wanneer genomic DNA qPCR statistisch grotere detectie in het weefsel van belang toont, ten opzichte van de referentie. Hier werd het alfa snap-gen gevalideerd om kiembaan-beperkt te zijn omdat het was uitgeput in somatisch weefsel ten opzichte van testees DNA waar het aanwezig was dat niveaus gelijk aan Actin.

Het is belangrijk om te onthouden om de juiste ingangen te gebruiken tijdens elk van de computationele stappen. Het kan zijn dat u meerdere keren door de cyclus moet gaan om de doelsequentie of sequenties te verkrijgen. Een verscheidenheid aan fylogenetische, structurele en functionele analyse kan worden uitgevoerd op de ontdekte genen.

Deze aanvullende methoden geven inzicht in de evolutionaire en functionele rollen van de genen. We identificeerden het eerste gen op een kiembaan-beperkt zangvogel chromosoom, dat de interesse in dit verrassende genomische element verbreedde. Het verdere werk toonde gelijkaardige chromosomen in vele zangvogelsoorten die vele extra genen bevatten.