Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering
December 8th, 2018
Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.
Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe het gebruik van micro-fluidics te combineren met micro-elektrode arrays om het platform geschikt voor het bestuderen van neuronale communicatie en axonale signaal voortplanting te genereren. Hallo, ik ben Paulo Aguiar en ik ben de PI van de Neuro engineering and Computation Neuroscience Lab van INEB, gebruikt om code voor biomedische engineering aan de Universiteit van Porto, Portugal. Inzicht in informatieoverdracht in neurocircuits blijft een van de grootste uitdagingen in de neurowetenschappen.
Vandaag ga ik jullie laten zien hoe we individuele micro-actuatorarrays kunnen combineren met microvloeistoffen en softwaretools die hier in ons lab zijn ontwikkeld, om voortplantingsmogelijkheden te detecteren en te karakteriseren. We gebruiken deze opstelling in verschillende studies, namelijk neurale codering en decodering, en in communicatie tussen sensorische neuronen en andere celtypen. Wij zijn van mening dat de visuele demonstratie van dit protocol van cruciaal belang is.
Aangezien micro-vloeibare en micro-elektrode arrays assemblage is dat moeilijkheid bij het beheer, en moeilijk te reproduceren alleen door het reproduceren van protocollen. Voor de markt, cultaire verkoop op dit platform is niet eenvoudig, als de conventionele ABAs, en het vereist speciale aandacht voor de cel zitten spul, en cultuur magneten. Deze opstelling stelt ons in staat om verschillende communicatiegerelateerde eigenschappen te bestuderen, zoals voortplantingssnelheid en richting, in een goed gecontroleerde omgeving.
Hoewel de registratieprocedure eenvoudig is, vereist data-analyse kennis en het gebruik van de juiste rekentools. Op de dag voor de cel zitten, beginnen met de voorbereiding van de micro-vloeistofapparaten, door het reinigen van met vinyl tape. Druk de tape voorzichtig tegen het apparaat om alle gebieden van de microvloeistof te bereiken.
Luchtplasma reinigt de MEA gedurende drie minuten om het oppervlak schoon te maken en het hydrofieler te maken. In een laminaire stroomkap, dompel de micro-vloeistoffen onder in 70 procent ethanol. Laat ze drogen aan de lucht.
Plaats elke MEA in een petrischaaltje en steriliseer met 15 minuten uv-lichtblootstelling. Ga vervolgens naar het centrale gebied van MEA met 500 microliters pei-oplossing. Incubeer voor ten minste een uur.
In een laminaire stroomkap, aspirate de PEI coating oplossing van de MEA oppervlak. Was vervolgens de MEA's vier keer met een milliliter steriel water. Met behulp van een steriele microscoop, geplaatst in de laminaire stroomkap.
Centreer de MEA-chip en voeg een milliliter steriel water toe aan het centrale deel van de MEA. Plaats vervolgens het microvloeimiddelapparaat op het MEA-oppervlak en lijn het microgrooves-microactieve raster van de MEA zorgvuldig uit. Aspirate het overtollige water, en broeden 's nachts op 37 graden, om volledige gehechtheid mogelijk te maken.
Op de volgende dag, laad de putten met laminine, en uitbroeden weer. Na het verzamelen van de embryosusseds gaat u naar de prefrontale cortexdissectie. Begin met het zorgvuldig blootstellen van de hersenen, met behulp van een paar tangen.
Verwijder vervolgens voorzichtig de hersenen uit zijn holte. Bedek het met koude H-HBSS. Wanneer aanwezig, verwijder en gooi de reukbollen.
Ten slotte ontleedt u de prefrontale cortex. Zorg voor de volledige verwijdering van de hersenvliezen. Herhaal deze procedure voor beide hemisferen.
Voor het aantal hersenen dat nodig is voor uw studie. In een laminaire stroomkap, het verzamelen van de cortex fragmenten eerder ontleed in een totaal van vijf milliliter van H-HBSS. Breng deze fragmenten vervolgens over naar een steriele chronische buis van 15 milliliter.
Pipet, en hebben 2,3 milliliter vers bereide trypsine oplossing voor de buis met de cortex fragmenten. Meng de vering, en uitbroeden op 37 graden gedurende 15 minuten. Roer elke vijf minuten.
Gooi vervolgens de supernatant met de trypsine weg, voeg H-HBSS met FBS toe om de resterende trypsine te activeren. Zachtjes roeren. Laat de cortex fragmenten settelen, en gooi de supernatant.
Was twee keer met H-HBSS, verwijder de FBS en gooi de supernatant weer weg. Voeg aangevuld neurale basale medium, en mechanisch scheiden weefsels door langzaam pipetten op en neer. Gooi het resterende weefsel weg door de zoutsuspensie door een celzeef te filteren.
Meng vervolgens 20 microliter celsuspensie met 20 microliter trypanblauw. Breng 10 microliter naar een Neubauer kamer, en tel het aantal levensvatbare cellen. Onmiddellijk voor de cel zitten, verwijder laminine uit alle putten van de micro EF. Voeg vervolgens het kleine volume van het supernatant medium toe aan elke put van het axonale compartiment.
Langzaam zaad vijf microliters van cel suspensie naar de somal compartiment. Incubeer op 37 graden gedurende een uur om celbevestiging aan het substraat mogelijk te maken. Na een uur, vul zachtjes elke put met warme aangevuld medium.
Voeg kleine volumes toe om celloslating te voorkomen. Breng de micro EF vervolgens over naar een couveuse. Hier wordt getoond een cultuur op vijf dagen in vitro.
Na een week beginnen culturen spontane activiteit tentoon te stellen. Gebruik voor het uitvoeren van opnames een temperatuurregelaar om de voorversterkerbrandbasisplaat op te eten. Plaats vervolgens de micro EF op de voorversterker en sluit en sluit het deksel.
Open de experimentele software met meerdere kanalen om op te nemen. Stel de bemonsteringssnelheid in op 20 kilohertz. Sleep het filter en de opgenomen vakken en sluit ze achtereenvolgens aan om zowel ruwe als gefilterde gegevens op te nemen.
Start de gegevensverwerving om de signalen te visualiseren en snel op te nemen. De opgenomen gegevens kunnen snel worden onderzocht met behulp van multi-channel analyzer. Hier is de signaalvoortplanting langs de microgrooves al duidelijk.
Om deze voortplantende gebeurtenissen te identificeren en te karakteriseren, opent u uw opname in micro spike hunter. Klik op de knop bestandsinfo om toegang te krijgen tot de opname-instellingen en selecteer de set micro-elektroden voor analyse. Stel de drempel voor het verspreiden van gebeurtenisdetectie in.
En snel gegevens lezen. De software zal een lijst van alle gedetecteerde sequenties. De gebruiker kan dan de voortplantingssnelheid beoordelen als de informatie, tussen paren micro-elektroden, en op basis van hun inter distance en cross correlatie.
De chemo grafiek tool stelt de gebruiker in staat om handmatig schatten van de voortplantingssnelheid. Hier wordt een propagerende gebeurtenis getoond. Ontdekt langs vier micro-elektroden in een microgroove.
Deze gebeurtenissen kunnen worden vertegenwoordigd in een Rasser plot. Hier is de voortplanting activiteit langs 11 microgrooves voor de eerste twee minuten van de opname. De hoge en de lage activiteit microgroove zijn gekleurd in geel en rood, respectvol.
Let op synchronisatie van de activiteit langs de 11 microgrooves. De synchronisatie is onafhankelijk van de snelheid van activiteit. Zoals te zien is in de variaties van de momentane vuursnelheid van de twee microgrooves.
Microgrooves functioneren ook als axonale signaalversterkers, zoals te zien is in de doos en snorharen plot. We hebben je laten zien hoe je microvloeistoffen combineren met MEA's, en hoe je neuronen op hen verkreeden. Ook, hoe op te nemen en te extraheren zinvolle gegevens uit die opnames.
We hopen dat deze demonstratie nuttig is voor uw onderzoek, waarom u de communicatie in neurale circuits wilde bestuderen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol toont de integratie van microelektrode arrays met microfluïdische apparaten om de overdracht van actiepotentialen in neuronale culturen te bestuderen. Het benadrukt het belang van visuele demonstratie en het gebruik van een gebruiksvriendelijke computationele tool voor gegevensanalyse.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Neuroengineering
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van informatieoverdracht in neurale circuits is een grote uitdaging in de neurowetenschap.
- Microelektrode arrays maken het mogelijk om elektrische activiteit van neuronen op te nemen.
- Microfluïdische apparaten maken nauwkeurige controle van de cellulaire omgeving mogelijk.
- Het combineren van deze technologieën kan het onderzoek naar neuronale communicatie verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Een platform creëren voor het bestuderen van neuronale communicatie en axonaal signaalpropagatie.
- Propagerende actiepotentialen in neuronale culturen detecteren en karakteriseren.
- Onderzoek naar neurale codering en decodering vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Integratie van microelektrode arrays met microfluïdische apparaten.
- Gebruik van softwaretools ontwikkeld voor gegevensanalyse.
- Visuele demonstratie van het protocol voor duidelijkheid.
- Toepassing in verschillende onderzoeken met sensorische neuronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie en karakterisering van actiepotentialen.
- Verbeterd begrip van neuronale communicatiemechanismen.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol in onderzoekstoepassingen.
- Ontwikkeling van een gebruiksvriendelijke computationele tool voor gegevensanalyse.
Conclusies
- Het gecombineerde gebruik van microelektrode arrays en microfluïdica is effectief voor het bestuderen van neuronale activiteit.
- Deze aanpak kan onderzoek in neurowetenschap en neuroengineering bevorderen.
- Visuele protocollen zijn essentieel voor reproduceerbaarheid en begrip.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic-MEA platform addresses a key challenge in neuroscience drug discovery: isolating axonal signal propagation from somatic noise in neuronal cultures. By enabling high-resolution, long-term recording of spike propagation with improved signal-to-noise ratio, the method supports mechanistic de-risking of targets involved in neurodevelopment, neurodegeneration, and neuroregeneration. It provides predictive confidence in early discovery by quantifying communication-related phenotypes such as conduction velocity and firing patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal signaling to clarify pathway-specific communication in neuronal circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of targets modulating spike propagation velocity and conduction failure.
- Predictive Value: Quantifies anterograde spike transmission and coding mechanisms to inform portfolio triage based on functional target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated, compartmentalized neuronal cultures for downstream compound evaluation with controlled axonal alignment and microelectrode coupling.
- Quantitative Outputs: Delivers reproducible, high-resolution measurements of propagation velocity, conduction failure, and firing rate for reliable compound screening.
- Scalability & Reuse: Enables platform standardization across studies of sensory neuron communication and co-culture configurations, supporting assay transferability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neurodevelopmental and neurodegenerative processes by tracking axonal signal propagation over weeks in vitro.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by quantifying communication phenotypes relevant to circuit dysfunction and repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through objective metrics of neuroregenerative potential and information coding fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing functional readouts that bridge phenotypic screening and mechanistic validation in neuronal systems.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating axonal contributions to network activity in controlled microenvironments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal cultures with standardized electrophysiological readouts for compound effect evaluation.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via propagation velocity, conduction failure, and firing rate metrics derived from spike train analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal communication dynamics relevant to neurodegeneration and neuroregeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying sensory neuron communication and co-culture systems across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuronal signal propagation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through compartmentalized culture design and long-term stability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in circuit-based pathologies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable axonal communication phenotypes linked to disease mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, neuronal culture, and electrophysiological recording.
- Depends on access to microelectrode arrays, plasma cleaners, laminar flow hoods, and temperature-controlled recording systems.
- Necessitates cross-team standardization for consistent device alignment, cell seeding, and medium exchange protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types or co-culture configurations beyond prefrontal cortex-derived cultures.
- Practical limitations include the technical complexity of microfluidic-MEA assembly and the need for specialized computational tools for spike propagation analysis.
