Interfacing Microfluidics met micro-elektrode Arrays voor het bestuderen van de neuronale communicatie- en axonale signaal vermeerdering
8 december 2018
Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.
Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe het gebruik van micro-fluidics te combineren met micro-elektrode arrays om het platform geschikt voor het bestuderen van neuronale communicatie en axonale signaal voortplanting te genereren. Hallo, ik ben Paulo Aguiar en ik ben de PI van de Neuro engineering and Computation Neuroscience Lab van INEB, gebruikt om code voor biomedische engineering aan de Universiteit van Porto, Portugal. Inzicht in informatieoverdracht in neurocircuits blijft een van de grootste uitdagingen in de neurowetenschappen.
Vandaag ga ik jullie laten zien hoe we individuele micro-actuatorarrays kunnen combineren met microvloeistoffen en softwaretools die hier in ons lab zijn ontwikkeld, om voortplantingsmogelijkheden te detecteren en te karakteriseren. We gebruiken deze opstelling in verschillende studies, namelijk neurale codering en decodering, en in communicatie tussen sensorische neuronen en andere celtypen. Wij zijn van mening dat de visuele demonstratie van dit protocol van cruciaal belang is.
Aangezien micro-vloeibare en micro-elektrode arrays assemblage is dat moeilijkheid bij het beheer, en moeilijk te reproduceren alleen door het reproduceren van protocollen. Voor de markt, cultaire verkoop op dit platform is niet eenvoudig, als de conventionele ABAs, en het vereist speciale aandacht voor de cel zitten spul, en cultuur magneten. Deze opstelling stelt ons in staat om verschillende communicatiegerelateerde eigenschappen te bestuderen, zoals voortplantingssnelheid en richting, in een goed gecontroleerde omgeving.
Hoewel de registratieprocedure eenvoudig is, vereist data-analyse kennis en het gebruik van de juiste rekentools. Op de dag voor de cel zitten, beginnen met de voorbereiding van de micro-vloeistofapparaten, door het reinigen van met vinyl tape. Druk de tape voorzichtig tegen het apparaat om alle gebieden van de microvloeistof te bereiken.
Luchtplasma reinigt de MEA gedurende drie minuten om het oppervlak schoon te maken en het hydrofieler te maken. In een laminaire stroomkap, dompel de micro-vloeistoffen onder in 70 procent ethanol. Laat ze drogen aan de lucht.
Plaats elke MEA in een petrischaaltje en steriliseer met 15 minuten uv-lichtblootstelling. Ga vervolgens naar het centrale gebied van MEA met 500 microliters pei-oplossing. Incubeer voor ten minste een uur.
In een laminaire stroomkap, aspirate de PEI coating oplossing van de MEA oppervlak. Was vervolgens de MEA's vier keer met een milliliter steriel water. Met behulp van een steriele microscoop, geplaatst in de laminaire stroomkap.
Centreer de MEA-chip en voeg een milliliter steriel water toe aan het centrale deel van de MEA. Plaats vervolgens het microvloeimiddelapparaat op het MEA-oppervlak en lijn het microgrooves-microactieve raster van de MEA zorgvuldig uit. Aspirate het overtollige water, en broeden 's nachts op 37 graden, om volledige gehechtheid mogelijk te maken.
Op de volgende dag, laad de putten met laminine, en uitbroeden weer. Na het verzamelen van de embryosusseds gaat u naar de prefrontale cortexdissectie. Begin met het zorgvuldig blootstellen van de hersenen, met behulp van een paar tangen.
Verwijder vervolgens voorzichtig de hersenen uit zijn holte. Bedek het met koude H-HBSS. Wanneer aanwezig, verwijder en gooi de reukbollen.
Ten slotte ontleedt u de prefrontale cortex. Zorg voor de volledige verwijdering van de hersenvliezen. Herhaal deze procedure voor beide hemisferen.
Voor het aantal hersenen dat nodig is voor uw studie. In een laminaire stroomkap, het verzamelen van de cortex fragmenten eerder ontleed in een totaal van vijf milliliter van H-HBSS. Breng deze fragmenten vervolgens over naar een steriele chronische buis van 15 milliliter.
Pipet, en hebben 2,3 milliliter vers bereide trypsine oplossing voor de buis met de cortex fragmenten. Meng de vering, en uitbroeden op 37 graden gedurende 15 minuten. Roer elke vijf minuten.
Gooi vervolgens de supernatant met de trypsine weg, voeg H-HBSS met FBS toe om de resterende trypsine te activeren. Zachtjes roeren. Laat de cortex fragmenten settelen, en gooi de supernatant.
Was twee keer met H-HBSS, verwijder de FBS en gooi de supernatant weer weg. Voeg aangevuld neurale basale medium, en mechanisch scheiden weefsels door langzaam pipetten op en neer. Gooi het resterende weefsel weg door de zoutsuspensie door een celzeef te filteren.
Meng vervolgens 20 microliter celsuspensie met 20 microliter trypanblauw. Breng 10 microliter naar een Neubauer kamer, en tel het aantal levensvatbare cellen. Onmiddellijk voor de cel zitten, verwijder laminine uit alle putten van de micro EF. Voeg vervolgens het kleine volume van het supernatant medium toe aan elke put van het axonale compartiment.
Langzaam zaad vijf microliters van cel suspensie naar de somal compartiment. Incubeer op 37 graden gedurende een uur om celbevestiging aan het substraat mogelijk te maken. Na een uur, vul zachtjes elke put met warme aangevuld medium.
Voeg kleine volumes toe om celloslating te voorkomen. Breng de micro EF vervolgens over naar een couveuse. Hier wordt getoond een cultuur op vijf dagen in vitro.
Na een week beginnen culturen spontane activiteit tentoon te stellen. Gebruik voor het uitvoeren van opnames een temperatuurregelaar om de voorversterkerbrandbasisplaat op te eten. Plaats vervolgens de micro EF op de voorversterker en sluit en sluit het deksel.
Open de experimentele software met meerdere kanalen om op te nemen. Stel de bemonsteringssnelheid in op 20 kilohertz. Sleep het filter en de opgenomen vakken en sluit ze achtereenvolgens aan om zowel ruwe als gefilterde gegevens op te nemen.
Start de gegevensverwerving om de signalen te visualiseren en snel op te nemen. De opgenomen gegevens kunnen snel worden onderzocht met behulp van multi-channel analyzer. Hier is de signaalvoortplanting langs de microgrooves al duidelijk.
Om deze voortplantende gebeurtenissen te identificeren en te karakteriseren, opent u uw opname in micro spike hunter. Klik op de knop bestandsinfo om toegang te krijgen tot de opname-instellingen en selecteer de set micro-elektroden voor analyse. Stel de drempel voor het verspreiden van gebeurtenisdetectie in.
En snel gegevens lezen. De software zal een lijst van alle gedetecteerde sequenties. De gebruiker kan dan de voortplantingssnelheid beoordelen als de informatie, tussen paren micro-elektroden, en op basis van hun inter distance en cross correlatie.
De chemo grafiek tool stelt de gebruiker in staat om handmatig schatten van de voortplantingssnelheid. Hier wordt een propagerende gebeurtenis getoond. Ontdekt langs vier micro-elektroden in een microgroove.
Deze gebeurtenissen kunnen worden vertegenwoordigd in een Rasser plot. Hier is de voortplanting activiteit langs 11 microgrooves voor de eerste twee minuten van de opname. De hoge en de lage activiteit microgroove zijn gekleurd in geel en rood, respectvol.
Let op synchronisatie van de activiteit langs de 11 microgrooves. De synchronisatie is onafhankelijk van de snelheid van activiteit. Zoals te zien is in de variaties van de momentane vuursnelheid van de twee microgrooves.
Microgrooves functioneren ook als axonale signaalversterkers, zoals te zien is in de doos en snorharen plot. We hebben je laten zien hoe je microvloeistoffen combineren met MEA's, en hoe je neuronen op hen verkreeden. Ook, hoe op te nemen en te extraheren zinvolle gegevens uit die opnames.
We hopen dat deze demonstratie nuttig is voor uw onderzoek, waarom u de communicatie in neurale circuits wilde bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert de integratie van micro-elektrodearrays met microfluïdische apparaten om de transmissie van actiepotentialen in neuronale culturen te bestuderen. De nadruk ligt op het belang van visuele demonstratie en het gebruik van een gebruiksvriendelijke computationele tool voor data-analyse.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neuroengineering
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van informatieoverdracht in neurale circuits is een grote uitdaging in de neurowetenschappen.
- Micro-elektrodenarrays maken het mogelijk om de elektrische activiteit van neuronen te registreren.
- Microfluïdische apparaten maken een precieze controle van de cellulaire omgeving mogelijk.
- Het combineren van deze technologieën kan de studie van neuronale communicatie verbeteren.
Doel van de studie
- Om een platform te creëren voor het bestuderen van neuronale communicatie en axonale signaalvoortplanting.
- Om voortplantende actiepotentialen in neuronale culturen te detecteren en te karakteriseren.
- Om onderzoek naar neurale codering en decodering te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Integratie van micro-elektrodearrays met microfluïdische apparaten.
- Gebruik van softwaretools ontwikkeld voor data-analyse.
- Visuele demonstratie van het protocol voor de duidelijkheid.
- Toepassing in diverse studies met sensorische neuronen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie en karakterisering van actiepotentialen.
- Verbeterd begrip van de mechanismen van neuronale communicatie.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol in onderzoekstoepassingen.
- Ontwikkeling van een gebruiksvriendelijke computationele tool voor data-analyse.
Conclusies
- Het gecombineerde gebruik van micro-elektrodearrays en microfluidica is effectief voor het bestuderen van neuronale activiteit.
- Deze aanpak kan het onderzoek in de neurowetenschappen en neuroengineering bevorderen.
- Visuele protocollen zijn essentieel voor de reproduceerbaarheid en het begrip.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit microfluïdische MEA-platform pakt een cruciale uitdaging in de drug discovery voor neurowetenschappen aan: het isoleren van axonale signaalvoortplanting van somatische ruis in neuronale culturen. Door hoogresolutie, langetermijnregistratie van spike-voortplanting met een verbeterde signaal-ruisverhouding mogelijk te maken, ondersteunt deze methode het mechanistische de-risking van targets die betrokken zijn bij neuro-ontwikkeling, neurodegeneratie en neuroregeneratie. Het biedt voorspellende zekerheid in vroege discovery-fasen door communicatie-gerelateerde fenotypes, zoals conductiesnelheid en vuurpatronen, te kwantificeren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door axonale signalering te isoleren, om zo padspecifieke communicatie in neuronale circuits te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele validatie van targets die de voortplantingssnelheid van actiepotentialen en geleidingsuitval moduleren.
- Voorspellende waarde: Kwantificeert anterograde transmissie van actiepotentialen en coderingsmechanismen om portfolio-triage te informeren op basis van functionele target-engagement.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde, gecompartimenteerde neuronale culturen voor op downstream evaluatie van verbindingen, met gecontroleerde axonale uitlijning en micro-elektrodekoppeling.
- Kwantitatieve output: Levert reproduceerbare, hoge-resolutiemetingen van voortplantingssnelheid, geleidingsuitval en vuursnelheid voor betrouwbare screening van verbindingen.
- Schaalbaarheid & hergebruik: Maakt platformstandaardisatie mogelijk over studies naar communicatie tussen sensorische neuronen en co-cultureconfiguraties, wat de overdraagbaarheid van de assay ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert neurodevelopmentele en neurodegeneratieve processen door de axonale signaalvoortplanting gedurende weken in vitro te volgen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door communicatie-fenotypen te kwantificeren die relevant zijn voor circuitdysfunctie en herstel.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen via objectieve metrieken voor neuroregeneratief potentieel en de getrouwheid van informatiecodering.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, en biedt functionele read-outs die fenotypische screening en mechanistische validatie in neuronale systemen overbruggen.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van pathways en biologische risicoreductie door axonale bijdragen aan netwerkactiviteit te isoleren in gecontroleerde micro-omgevingen.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare neuronale culturen met gestandaardiseerde elektrofysiologische read-outs voor de evaluatie van compound-effecten.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van condities mogelijk via metrieken voor propagatiesnelheid, conductiefalen en firing rate, afgeleid van spike-train analyse.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinisch werk door axonale communicatiedynamiek te modelleren die relevant is voor neurodegeneratie en neuroregeneratie.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van communicatie tussen sensorische neuronen en co-cultuursystemen over meerdere therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in neuronale signaalvoortplanting te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door een gecompartimentaliseerd culturedesign en stabiliteit op lange termijn.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets die betrokken zijn bij circuit-gebaseerde pathologieën mogelijk te maken.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering via kwantificeerbare axonale communicatiefenotypes die gekoppeld zijn aan ziektemechanismen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van microfluïdische apparaten, neuronale culturen en elektrofysiologische registratie.
- Afhankelijk van toegang tot micro-elektrodenarrays, plasmareinigers, laminaire flow-kappen en temperatuurgecontroleerde registratiesystemen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een consistente uitlijning van apparaten, celuitzaaiing en protocollen voor mediumverversing.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding naar verschillende neuronale typen of co-cultuurconfiguraties buiten culturen afgeleid van de prefrontale cortex.
- Praktische beperkingen omvatten de technische complexiteit van de microfluïdische-MEA-assemblage en de behoefte aan gespecialiseerde computationele tools voor de analyse van spike-propagatie.
