Name: Colletotrichum fioriniae Ontwikkeling in Water en Chloroform gebaseerde Blueberry en Cranberry Floral extracten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Leer bioassays voor het monitoren van Colletotrichum fioriniae ontwikkeling met bloemextracten van bosbessen en cranberries. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van plant-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de William S. Haines, Sr. begiftigd Cranberry onderzoeksfonds en de New Jersey Blueberry en Cranberry Research Raad, Inc. voor steun. Wij danken ook Jennifer Vaiciunas (begeleiding en florale preparaten), Christine Constantelos (schimmel cultuur en florale preparaten), David Jones (floral preparaten en extracties), Langley Oudemans (floral voorbereiding, filmen/fotografie), Jesse Lynch (floral preparaten), Roxanne Tumnalis (algemene ondersteuning) en talrijke student/zomer stagiaires.

<ol><li>Pszczółkowska, A., Okorski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+anthracnose+disease+caused+by+Colletotrichum+fioriniae+on+blueberry+in+western+Poland%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland.</a> Plant Disease. 100, 2167(2016).</li>
<li>Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+fruit+rot+in+the+northeast%3A+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease.</a> Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).</li>
<li>Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Colletotrichum+acutatum+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Studies+in+Mycology%22%5BJournal%5D)">The Colletotrichum acutatum species complex.</a> Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).</li>
<li>Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+acutatum+var.+fioriniae+%28teleomorph%3A+Glomerella+acutata+var.+flioriniae+var.+nov.%29+infection+of+a+scale+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect.</a> Mycologia. 100, 353-374 (2008).</li>
<li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+fioriniae+comb.+%26+stat.+nov.%2C+resolving+a+nomenclatural+muddle%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li>
<li>Shivas, R. G., Tan, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+re-assessment+of+Colletotrichum+acutatum%2C+introducing+C.+fioriniae+comb.+et+stat.+nov+and+C.+simmondsii+sp+nov%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov.</a> Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).</li>
<li>Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Anales+del+Jard%C3%ADn+Bot%C3%A1nico+de+Madrid%22%5BJournal%5D)">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li>
<li>Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+and+necrotrophic+lifestyle+choice+during+postharvest+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).</li>
<li>Milholland, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilholland%2C+RD+%22Compendium+of+Blueberry+and+Cranberry+Diseases%22">Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases</a>. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).</li>
<li>DeMarsay, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anthracnose+fruit+rot+of+highbush+blueberry%3A+biology+and+epidemiology%22">Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).</li>
<li>Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 86, 864-874 (1996).</li>
<li>Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-topography+and+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).</li>
<li>Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+spore+release+by+Colletotrichum+acutatum+in+Michigan+blueberry+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields.</a> Phytopathology. 92, 86(2002).</li>
<li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li>
<li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li>
<li>Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+the+blueberry+floral+extracts+influence+secondary+conidiation+and+appressorial+formation+of+Colletotrichum+fioriniae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae.</a> Phytopathology. 108, 561-567 (2017).</li>
<li>Gager, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+influence+of+cranberry+floral+wax+on+appressorium+formation+in+Colletotrichum+fioriniae%22">The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).</li>
<li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li>
<li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community%3A+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li>
<li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De bioassays detecteren de C. fioriniae reactie op floral extracten (FEs) werden ontwikkeld met de bosbes en cranberry vruchten rot pathosystems maar kunnen gemakkelijk aangepast worden aan andere tuinbouwgewassen. Het protocol hierboven is waardevol in het verwerven van vele belangrijke verzamelingen van gegevens met inbegrip van, maar niet beperkt tot: FE effecten op meerdere isolaten van talrijke pathogenen, tijdsverloop informatie met betrekking tot de groei van zwammen stadia in de aanwezigheid van verschillende FEs, vergelijking van extractie technieken, inspectie van individuele chemische stoffen op de C. fioriniae groei en differentiatie, evaluatie van de individuele bloem orgel extracten, effecten van temperatuur op de C. fioriniae in aanwezigheid van FE, effecten van fenologie afhankelijke wax extracties en florale regenwater-effecten. Door het gebruik van deze technieken heeft gegevens gegenereerd ook een veel duidelijker begrip van C. fioriniae leven stadia en ten dele verklaart waarom de bloei periode zo belangrijk zijn voor de controle van veel fruit is, rotten van ziekteverwekkers.
In eerste instantie alle bloemen identiek zijn verwerkt op de actieve-FE, maar het extractieproces is verhuisd naar het gebruik van hele bloemen. Floral dissectie was tijdrovend en had weinig effect op de topicale van de resulterende Fez. Echter individuele floral organen kunnen en moeten zijn beoordeeld met behulp van dit protocol, maar grote zorg moet worden genomen om niet volledig maceraat de floral weefsels (aanvullende film 1, met de voorzorgsmaatregelen beschreven in stap 2.3), aangezien dit kan leiden tot vrijgegeven schimmels-giftig/static verbindingen in de FE die de microscopische evaluaties kunnen verstoren. Minder invasieve extracties zoals pass -zijn FE (aanvullende film 2) en rw-FE nu gunstiger vanwege hun gemak van acquisitie. Bovendien, vereisen deze extractie technieken alleen vacuüm filtratie te verwerven van biologisch actieve floral chemische signalen.
De bloemen gebruikt in alle extracties waren meestal gekoeld voor 0-3 dagen vóór de voorbereiding van het extract. Een uitdaging van dit protocol is tijdsbeheer van FE omzet (veld collectie door opslag van fragmenten). Dit werd verergerd door de talloze voorbeelden uit meerdere bronnen en datums. Bevroren bloemen zijn niet geëvalueerd in hoeverre elke echte, zoals ontdooide bloemen verslechterde en verkleurd verschijnen. Echter, zodra het FEs waterbasis zijn opgesteld, herhaald bevriezen en ontdooien blijkt geen effect op de topicale van de FE, dus zolang de FE zijn snel refrozen na bioassay voorbereiding (levensvatbare 3-jarige FE).
Chloroform gebaseerde extractie kan de onderzoek naar pathogeen reacties op driedimensionale bloemen/vruchten oppervlakte wassen in een twee-dimensionale vlak via ch-FE verdamping op glas coverslips. Het is echter onwaarschijnlijk dat de werkelijke kristallijnen structuren van wassen gestort van de ch-FE zijn identiek aan het oppervlak waaruit zij verzameld werden. Betekenis, aanvullende technieken moeten worden toegepast als schimmel reactie op specifieke wax structuren in vivo de belangrijkste focus van onderzoek zijn. Chloroform gebaseerde extracten nodig meer opslag onderhoud dan de extracties waterbasis. Naast het bijhouden van de ch-FE extracten in het donker, de cultuur van de cel van de PTFE bekleed tube caps en parafilm afdichten wrap moet regelmatig worden gecontroleerd voor de verdampingsemissie lekken en vervangen waar nodig.
Het concept van toezicht floral regenwater afvoer is geworteld in de idee van bevordering van site-specific ziekte controlehulpprogramma's. De stroomafname-inrichtingen van regenwater kunnen aangepast worden naar vele andere achitecturen van de plant, zolang het apparaat collectie vangt regenwater dat heeft aanloop van bloemen. Deze aanpak biedt informatie over wel of niet floral stimulatie is aanwezig in het veld op een bepaald moment en kan worden gecontroleerd gedurende het gehele seizoen. Anderzijds kunnen stroomafname-inrichtingen worden geïmplementeerd op meerdere locaties van de luifel om te bepalen hoe ver floral signalen zijn gewassen tijdens een gegeven bedplassen-event. In de toekomst experimenten, rw-FE zal dicteren waarop fungicide toepassingen moeten beginnen en wanneer zij veilig kunnen eindigen. Bovendien, door monitoring fenologie afhankelijke wax extracties (protocol sectie 9), is het belang van de bloei periode tot pathogen biologie geworden nog duidelijker. Dat gedeelte werd ook opgenomen om aan te tonen van de flexibiliteit van deze bioassays, verstrekken van methoden waarmee voor side-by-side vergelijking van host oppervlakte wassen die stoffelijk zijn gescheiden. De gegevens die zijn gegenereerd met de floral extractie technieken en bioassays vertegenwoordigen concrete indicatoren van pathogen stimulatie, specifieke chemische klassen moeten pathogen biologie, en doelstellingen voor de toekomstige bestrijdingsstrategieën.

Colletotrichum fioriniae veroorzaakt een rot fruit van blauwe bes (Vaccinium corymbosum L.) zowel als de grote Amerikaanse Cranberry (V. macrocarpon Aiton)1,2. Deze ziekteverwekker werd onlangs afgebakend van de C. acutatum soorten complexe3,4,5,6 en is een causaal agens van blueberry anthracnose en een lid van de cranberry vruchten rot complex, naast talrijke andere plantaardige ziekten wereldwijd7veroorzaakt. C. fioriniae heeft een latent, hemibiotrophic levensstijl8, met infecties die zich voordoen tijdens de bloei en symptoom ontwikkeling niet merkbaar totdat de vruchten in de definitieve stadia van rijping9 zijn. In bosbessen en cranberry, wordt vruchten rot alleen afdoende beheerst met fungicide toepassingen gemaakt tijdens de bloei periode. Het pathogene agens overwintert in slapende blueberry floral bud schalen10 en sporulates tijdens de bloei. Conidiën worden verplaatst gedurende de luifel via11,12 van de versnippering van de regen-splash en entmateriaal opbouw heeft sterk is gecorreleerd aan de bloei periode13. Reactie van Colletotrichum soorten op host bloemen is niet uniek voor Vaccinium, zoals bloemen belangrijke onderdelen van citrus post bloei vruchten neerzetten zijn (PFD)14 evenals aardbei anthracnose15, in beide gevallen veroorzaakt het pathogene agens te sporulate. Al deze gevallen wijzen op de noodzaak van effectieve methoden om te evalueren van de temporele dynamiek van floral chemische signalen op C. fioriniae en andere pathogenen die tijdens bloei infecteren. De inzichten die geboden door de hier beschreven methoden worden steeds waardevoller.
Dit protocol gedetailleerd methoden van floral extract (FE) aanbestedingen en de evaluatie van C. fioriniae reacties op FE begeleidt via glas dekglaasje aan bioassays15,16. De bloemen extractie technieken zijn onderverdeeld in twee hoofdtypen; Watergebaseerde extracties (actieve-FE, passieve (pass -FE) en veld regenwater gebaseerde (rw-FE)), en op basis van chloroform (ch-FE)17 extracties. De watergebaseerde extracties toestaan voor inspectie van water gemobiliseerd floral chemische signalen. Deze gemobiliseerde aanduidingen zijn waarschijnlijk belangrijke onderdelen van het Hof van de infectie, aangezien er FE verhoogt de snelheid van infectie16, naast het verstrekken van het vocht nodig zijn voor de infectie optreden. Bovendien vertegenwoordigen ze een meer natuurlijke toestand als floral stimulatie worden in de luifel tijdens bedplassen-evenementen zoals eerder waargenomen in bosbessen en andere gewas systemen14,16 gewassen kan. Chloroform gebaseerde floral extracties (ch-FE) bieden ook waardevolle informatie met betrekking tot pathogen reactie op host oppervlak was17,18, ophelderen van de vroege groeistadia van conidiën eenmaal gestort op gevoelig de organen van de host (d.w.z. bloemen, eierstokken en ontwikkelende fruit). Pathogen reactie op seizoensgebonden veranderingen in host oppervlakte wassen kan ook worden gecontroleerd met behulp van dit protocol. Dienovereenkomstig, de bioassays zijn afgestemd op het werken met waterbasis FE of chloroform gebaseerde FE te verzachten van de inherente verschillen tussen deze twee materialen.
De gegevens die zijn gegenereerd uit de bioassays geopenbaard dat waterbasis extracties hogere niveaus van secundaire conidiation dan chloroform gebaseerde extracties stimuleren waar er een definitieve appressorial antwoord, dus we meerdere verbindingen aanwezig in de FE. Interessant, werden beide van deze groei antwoorden waargenomen wanneer met behulp van regenwater dat had uitgevoerd off van bosbessen en cranberry bloemen, met vermelding van meerdere stimulerend verbindingen kan worden gewassen van het oppervlak van de bloemen. Dus, voor floral stimulatie zal verschaffen inzicht in de kans op succes van de pathogen in een landbouwsysteem.
Het uiteindelijke doel van dit protocol is bedoeld als een methode voor het genereren basislijn biologische informatie over schimmel plant ziekteverwekkers in reactie op floral chemische signalen, evenals de initiatiefnemende methodologieën die kunnen gebruiken deze bloemen informatie om te helpen bij Sitespecifiek beheer en besluitvorming ziekteprocessen.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m pore size, acetate sterilizing filter</td><td>VWR</td><td>101102-280</td><td>Blueberry floral extract (FE) clarification&nbsp;</td></tr><tr><td>200-1000 &micro;l pipette with tips</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipment, any make within range will be adequate</td></tr><tr><td>40-200 &micro;l pipette with tips</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipment, any make within range will be adequate</td></tr><tr><td>5-40 &micro;l pipette with tips</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipment, any make within range will be adequate</td></tr><tr><td>Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter&nbsp;</td><td>Harbor Freight</td><td>97098</td><td>Blueberry rainwater (rw-)FE collection</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Amsco</td><td>3011</td><td>Equipment, media preparation</td></tr><tr><td>Bar mesh matting (plastic mesh sheet)</td><td>Winco</td><td>BL-240</td><td>Passive (pass)-FE collection</td></tr><tr><td>Benchtop timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-47</td><td>Equipment, FE preparation</td></tr><tr><td>Black pressure/vacuum hose</td><td>VWR</td><td>62994-795</td><td>Vacuum filter component</td></tr><tr><td>Buchner funnel</td><td>Coors USA</td><td>60240</td><td>Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks</td></tr><tr><td>Bunsen burner&nbsp;&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Calcium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>RC 5B Plus</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (50 ml)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>Equipment, rw-FE collection</td></tr><tr><td>Cheesecloth (grade 50)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS240</td><td>Equipment, FE preparation</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>Chemical, trichloromethane: assay grade, &ge; 99% pure, for molecular biology, peroxide-free</td></tr><tr><td>Corn Meal Agar (CMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp;Pre-mix media, isolate storage on slants</td></tr><tr><td>Cotton-blue stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>Lactophenol cotton-blue stain</td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>VWR</td><td>90004-032</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Drill-press</td><td>Delta</td><td>-</td><td>Equipment, rw-FE collection</td></tr><tr><td>EASYpure LF Ultrapure water</td><td>Barnstead</td><td>D738</td><td>Equipment, deionized water source</td></tr><tr><td>Ethanol (95%)</td><td>-</td><td>-</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Filter flask (500 ml)</td><td>Pyrex</td><td>No. 5340</td><td>Vacuum filter component</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td>Hamilton</td><td>-</td><td>Equipment, chloroform usage</td></tr><tr><td>Funnel (7 X 7 cm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60820-110</td><td>Cranberry rw-FE collection, FE preparation</td></tr><tr><td>Generic glass slide&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-101</td><td>Bioassay conductance</td></tr><tr><td>Generic plastic pump spray bottle</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>pass-FE collection, at least 250 ml capacity</td></tr><tr><td>Glass cell culture tubes</td><td>-</td><td>-</td><td>Storage of ch-FE</td></tr><tr><td>Glass coverslips (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>Bioassay conductance</td></tr><tr><td>Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)</td><td>-</td><td>-</td><td>Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)</td></tr><tr><td>Glass-pipette (1-100 &micro;l)</td><td>Hamilton Co. Inc.</td><td>#710</td><td>ch-FE bioassay</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Lactophenol cotton-blue stain</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Lactic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W261106</td><td>Lactophenol cotton-blue stain</td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>Equipment, sterile work environment</td></tr><tr><td>Metal probe (generic)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipment&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Aqueous treatment mixture storage and preparation</td></tr><tr><td>Microscope, Leica DMLB</td><td>Leica</td><td>020-519.010</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Mortar (ceramic)</td><td>Coors USA</td><td>60313</td><td>Vacuum filter component</td></tr><tr><td>Nitrile gloves&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td><td>Flower collection</td></tr><tr><td>Paper disks (cut paper towels)</td><td>Office Basics</td><td>KCC01510</td><td>humidity control in bioassay</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Plastic paraffin film&nbsp;</td></tr><tr><td>Pestle (ceramic)</td><td>Coors USA</td><td>60314</td><td>Vacuum filter component</td></tr><tr><td>Phenol crystals</td><td>Fisher Scientific</td><td>A92-100</td><td>Lactophenol cotton-blue stain</td></tr><tr><td>Plastic bags (~100 mm X 152 mm)</td><td>Uline</td><td>S1294</td><td>Equipment, flower refrigeration</td></tr><tr><td>Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>(Petri dish), bioassay conductance</td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td><td>Storage of ch-FE</td></tr><tr><td>Pyrex beakers (100 ml)</td><td>Pyrex</td><td>No. 1000</td><td>Preparation of ch-FE</td></tr><tr><td>Pyrex bread-pan</td><td>-</td><td>-</td><td>pass-FE collection</td></tr><tr><td>Pyrex graduated cylinder</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipment, FE preparation</td></tr><tr><td>Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Bioassay conductance</td></tr><tr><td>Sharp-pointed dissecting scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks</td></tr><tr><td>Stainless steel mesh strainer</td><td>VWR</td><td>470149-756</td><td>Preparation of ch-FE</td></tr><tr><td>Step drill bit (step-bit)</td><td>Dewalt</td><td>-</td><td>Equipment, rw-FE collection</td></tr><tr><td>Sterile loop (combi-loop)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-602&nbsp;</td><td>Culture preparation</td></tr><tr><td>Telephone wire (internal wires)</td><td>-</td><td>-</td><td>Blueberry rw-FE collection</td></tr><tr><td>Test tube basket&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket&nbsp;</td></tr><tr><td>V8 Juice</td><td>Campbell's Soup Company</td><td>-</td><td>Fungal media component</td></tr><tr><td>Vintage plastic mesh [strawberry] baskets</td><td>Donation</td><td>-</td><td>pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)</td></tr><tr><td>Vortex Genie (Vortex)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>Spore suspension preparation</td></tr><tr><td>Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Vacuum filter component</td></tr><tr><td>

colletotrichum fioriniae ontwikkeling in water en chloroform gebaseerde blueberry en cranberry floral extracten

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

U wilt nauwkeurig controleren de fenologie van de periode van bloei en de temporele dynamiek van floral chemische signalen op schimmel vrucht rotten van pathogenen, werden floral extractiemethoden en dekglaasje aan bioassays ontwikkeld met behulp van Colletotrichum fioriniae. In bosbessen en cranberry, wordt deze ziekteverwekker optimaal beheerd door fungiciden toepassen tijdens de bloei periode vanwege de rol van de bloemen in de eerste stadia van de infectie. Het protocol hier gedetailleerd wordt beschreven hoe floral extracten (FE) werden verkregen met behulp van water-, chloroform en veld regenwater gebaseerde methoden voor later gebruik in overeenkomstige glas dekglaasje aan bioassays. Elke FE diende om een andere set van informatie: reactie van C. fioriniae aan gemobiliseerde floral chemische cues in water (waterbasis), pathogene reactie op bloem en vrucht oppervlakte wassen (chloroform-gebaseerd), en het veld gebaseerde bewaking van verzameld floral regenwater, in vitro opmerkingen naar een agrarische setting. De FE in grote lijnen beschreven als ofwel water of chloroform gebaseerde, met een passende bioassay beschreven om te compenseren voor de inherente verschillen tussen deze twee materialen. Regenwater dat bloemen had weggelopen was verzameld in unieke apparaten voor elk gewas, gezinspeeld op de flexibiliteit en de toepassing van deze benadering voor andere systemen gewas. De bioassays zijn snel, goedkoop, eenvoudig, en bieden de mogelijkheid voor het genereren van Spatio en site-specifieke informatie over de aanwezigheid van stimulerend floral stoffen uit verschillende bronnen. Deze informatie zal uiteindelijk beter informeren ziekte beheersstrategieën, zoals FE verminderen de tijd die nodig is voor infectie optreden, waardoor inzicht in veranderende risico's voor pathogen infectie gedurende het groeiseizoen.

De resultaten hier zijn een paar voorbeelden van de vele tests die kunnen worden uitgevoerd met gebruikmaking van deze methodiek. Figuur 1 is een geïllustreerde gids voor de bioassay FE waterbasis, en wordt aangevuld met Figuur 2 die op naar de chloroform gebaseerde FE bioassay volgt. Figuur 3 geeft een visuele gids voor wat kan worden verwacht op microscopische evaluatie van C. fioriniae op 24 h, in zowel water en chloroform-gebaseerde bioassays (ten opzichte van SDW controles). Figuur 4 details van een 24u-tijdsverloop studie met C. fioriniae in aanwezigheid van de cranberry verscheidenheid 'Stevens' ch-FE en geeft visuele verwijzing naar een resultaat van de import van dit onderzoek: FE daalde de tijd die nodig is om infectie ten opzichte van SDW. Figuur 5 biedt een voorbeeld van gegevens verzameld uit een dekglaasje aan bioassay met cranberry floral regenwater afvoer (CB "Flower" rw-FE). Figuur 6 is een ander belangrijk resultaat: floral eierstok ch-FE was veel meer stimulerend dan fruit ch-FE, het belang van bloom in de levenscyclus van C. fioriniae. De aanvullende foto's en films bieden belangrijke visuals van de bloemen gebruikt in de extracties en florale regenwater collectie apparaten/implementatie, naast films die de actief- en passief - extractie (visualiseren watergedragen) processen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Figuur 1 : Algemeen overzicht van de waterbasis floral extract (FE) bioassay. Deze bepaling werd gebruikt voor watergedragen floral extracten met zowel bosbes en cranberry bloemen: actieve -floral extracten (actieve-FE), passief -floral extracten (pass-FE) en florale regenwater afvoer (rw-FE). De - FE gedeelte vormt meestal de experimentele/variabele factor. Omgekeerd de - FE gedeelte kan constant blijven en tijd punten/uren na inoculatie kan worden geëvalueerd. Voorkeur geboekt 4 veld analyse bij 200 X vergroting. Afkortingen: Steriel gedeïoniseerd water, SDW; Oppervlakte per gezichtsveld, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Figuur 2 : Algemeen overzicht van de door de chloroform gebaseerde floral extract (ch-FE) bioassay. Deze bepaling werd gebruikt voor zowel bosbes en cranberry (bloemen, eierstokken en fruit). Slechts één soort waterige behandelingsmengsel werd gebruikt in deze test, 1 deel entsuspensie op 2 delen SDW (consistent te houden conidial concentratie als gevolg van verdamping van de ch-FE). Deze test kan worden gebruikt om meerdere ch-FE (wassen van verschillende plant oppervlakken), of meerdere tijd punten/uren na inoculatie met behulp van een enkele ch-FE te vergelijken. Afkortingen: Steriel gedeïoniseerd water, SDW; Van Tieghem [glas] cellen, Goodness. cel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Figuur 3 : Visuele vergelijking van Colletotrichum fioriniae in aanwezigheid van watergebaseerde FE en ch-FE. In deze bepaling blueberry 'Bluecrop' (actieve-FE, waterbasis) (schimmel isolaat: BB #10) en cranberry 'Stevens' chloroform gebaseerde (ch-FE) (schimmel isolaat: CB-PMAP182) floral extracten werden vergeleken met SDW besturingselementen. Een dramatische toename van de secundaire conidiation (ringen) en appressorium vorming (pijlpunten) werden waargenomen bij het vergelijken van conidiën in aanwezigheid van SDW (control) (A) aan actieve-FE (B) op 24 h na inoculatie. Secundaire conidiation was echter niet zo herkenbaar bij het vergelijken van de chloroform bioassay SDW controle (C) naar ch-FE (D); Integendeel, C. fioriniae groei verschoven naar de vorming van de appressorial. Komt te staan is een gemeenschappelijke reactie op elk type van extractie, watergedragen en chloroform gebaseerde, ongeacht host/bloemen soorten beschreven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Figuur 4 : Tijdsverloop studie (24 h) met Colletotrichum fioriniae in aanwezigheid van ch-FE. In deze test, zijn een SDW controle (A-D) en cranberry 'Stevens' ch-FE (E-F) visueel geïnspecteerd op 0, 6, 12 en 24 h na inoculatie (een voorbeeld van variabele tijd punten in plaats van het vergelijken van meerdere FE). Appressorium vorming (pijlpunten) begon op 6 h in de ch-FE en gestaag toegenomen hele latere tijdstippen. Deze resultaten ontsnapt aan een belangrijke factor voor pathogen biologie tijdens de periode van bloei: bloemen verminderen de tijd die nodig is om infectie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Figuur 5 : Grafische weergave van gegevens die zijn verzameld met behulp van rw-FE in een bioassay. Regenwater aanloop van cranberry bloemen (CB "Flower" rw-FE) en maagdelijke regenwater dat niet elke cranberry plantaardige weefsels ("Ground" rw-FE) uit een enkele bedplassen-event plus een standaard actief, cranberry waterbasis floral extract (CB actieve had aangeraakt -FE) (positieve controle) en SDW (negatieve controle) werden onderworpen aan een dekglaasje aan waterbasis bioassay en geëvalueerd voor C. fioriniae groei. CB "Flower" rw-FE had hetzelfde niveau van secundaire vorming op het gebied van conidiation en appressorium als de standaard CB actieve-FE op 24u na inoculatie, die aangeeft dat de stroomafname-inrichtingen effectief waren in het vastleggen van floral stimulerende middelen uitgebracht tijdens een bedplassen-event. Totale conidiën bestaat uit primaire (gedeponeerd), conidiën en nieuw gevormde secundaire conidiën. Brieven geven significante verschillen op p < 0.05 volgens Fischers minst Significant verschil testen (LSD); hoofdletters, totale conidiën; kleine letters, apressoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Figuur 6 : Cranberry fenologie gebaseerd ch-FE bioassay, visuele inspectie. Beheer van de ziekte voor vruchten rot schimmels vaak impliceert bloei tijd fungicide toepassingen. Cranberry chloroform gebaseerde uittreksels (ch-FE) uit meerdere groeistadia van cranberry ('Stevens') werden hier, visueel beoordeeld voor het effect van oppervlakte wassen op C. fioriniae op 24 h na inoculatie. Eierstokken verzameld in juni (A), onrijpe vrucht verzameld in juli en augustus (B, C), geoogst fruit verzameld in oktober (D), en een SDW controle (E) voor appressorial vorming (pijlpunten) werden geïnspecteerd. Eierstok ch-FE had de grootste omvang van de appressorial formatie, die aangeeft dat deze plant fenologie (waas) kritisch belangrijk de levenscyclus van C. fioriniae is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Aanvullende figuur 1: Blueberry bloeiwijze. Blueberry bloemen werden verzameld voor extracties tijdens volle bloei (April-mei in New Jersey, Verenigde Staten) (zie afbeelding 'Bluecrop'). Opmerking de overlapping van corollas/eierstokken uit aangrenzende bloemen en de algemene architectuur van de bloeiwijze vergeleken met aanvullende figuur 2 (cranberry rechtop). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Aanvullende figuur 2: Cranberry rechtop. Cranberry bloemen werden verzameld voor extracties tijdens volle bloei (juni-juli in New Jersey, Verenigde Staten) (zie afbeelding 'Stevens'). Opmerking de gevarieerde bloem etappes op een enkele cranberry bloeiwijze (rechtop), en de verslaafd, water druppel behoud van de vorm van de corolla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Aanvullende figuur 3: Blueberry regenwater implementatie (bloem). Blueberry floral regenwater collectie apparaat, geplaatst direct onder een cluster van bloeiwijzen voltooid. Opmerking de kunststof beklede draad gebruikt om het apparaat verticaal te oriënteren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Aanvullende figuur 4: Blueberry regenwater implementatie (stam). Voltooide blueberry floral regenwater collectie apparaat, halverwege de stengel tussen een bloeiwijze en de kroon van de struik geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Aanvullende figuur 5: Blueberry regenwater implementatie (kroon). Blueberry floral regenwater collectie apparaat, geplaatst aan de basis van de bush (kroon) voltooid. Opmerking plastic gecoate draden kunnen worden verwijderd indien niet nodig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Aanvullende figuur 6: Blueberry regenwater implementatie (grond). Voltooid Maagd regenwater collectie apparaat, grenzend aan de bosbes struiken geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Aanvullende figuur 7: Cranberry regenwater implementatie (close-up). Cranberry floral regenwater collectie apparaat, aangevuld met twee staanders verscholen onder de netjes gekruiste draad banden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Aanvullende figuur 8: Cranberry regenwater implementatie. Meerdere voltooid cranberry floral regenwater apparaten ingezet in een moeras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Aanvullende film 1: actieve, watergedragen floral extracten (actieve -FE). Aanvullende videosteun volgt 2.3-2.5.1. Blueberry 'Bluecrop' bloemen werden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> Aanvullende Movie 2: passieve, waterbasis floral extracten (pass-FE). Aanvullende videosteun volgende stap 3.3-3.4. Blueberry 'Bluecrop' bloemen werden gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Aanvullende Movie 3: implementatie van cranberry floral regenwater stroomafname-inrichtingen. Aanvullende videosteun volgende stap 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>

Bioassays ontworpen om te controleren van de ontwikkeling van een schimmel pathogeen, Colletotrichum fioriniae, in aanwezigheid van bosbessen of cranberry floral extracten op glas coverslips worden hier beschreven. Water-, chloroform en veld regenwater - gebaseerd floral extractie technieken zijn gedetailleerd en inzicht in hoe deze informatie kan worden toegepast.

Colletotrichum fioriniae Ontwikkeling in Water en Chloroform gebaseerde Blueberry en Cranberry Floral extracten

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Dit protocol biedt een goedkoop en aanpasbaar systeem om de temporele dynamiek van fluorchemische signalen op Colletotrichum fiorniae en andere plantenpathogenen die term bloei infecteren evalueren. Nieuwe vloer regenwater opvangapparaten stellen de gebruiker in staat om natuurlijke stimulerende middelen en omstandigheden die pathogene ontwikkeling te controleren in een bijna real-time site-specifieke manier. Begin deze procedure met een cultuur van Colletotrichum fiorniae van een natuurlijk geïnfecteerde gastheer zoals beschreven in het tekstprotocol.Wanneer kolonies beginnen te sporuleren, streep conidia op een andere V 8 Juice agar met celkweek schotel om een hoge dichtheid sporulating cultuur te produceren. Gebruik na zeven dagen groei een standaard steriele lus om een kleine hoeveelheid conidia uit de high-density cultuur te verzamelen door de lus licht aan te raken op de conidiale massa. Roer dit door in een 15 milliliter centrifugebuis met 10 milliliter steriel gedeïioniseerd water.Vortex dit monster voor 10 seconden. Met behulp van een standaard pipet, duik op en neer vele malen om verder te mengen het monster. Plaats vervolgens een druppel van het vortexed monster op de hemocytometer en schat sporenconcentraties.Pas de concentratie aan op 0,1 miljoen conidia per milliliter steriel gedestilleerd water met een eindvolume van vijf milliliter. Dit wordt aangeduid als de sporenschorsing en wordt alleen gemaakt onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik in een van beide bioassay. Om op chloroforme bloemenextractie uit te voeren, reinigt u alle componenten met 95% ethanol twee maal.Reinig de componenten vervolgens twee maal met chloroform om verontreiniging voor elke extractie te voorkomen. Maak de PTFE gevoerde doppen niet schoon met chloroform, omdat deze beschadigd zijn. Zet de onderdelen na het reinigen opzij om ondersteboven te drogen.Combineer een deel verwerkte bloemen tot negen delen chloroform in een bekerglas door het toevoegen van bloemen en vervolgens chloroform. Draai voorzichtig gedurende 30 seconden en stam door een roestvrij stalen scherm in het tweede bekerglas. Giet het extract op basis van chloroform uit het tweede bekerglas in de glazen kweekbuis en breng de PTFE-dop aan.Wikkel de dop met parafilm om verdamping te voorkomen. Bewaar het resulterende chloroform-gebaseerde bloemenextract in duisternis om lichte degradatie bij vier graden Van Celsius tot experimenteel gebruik te verminderen. Herhaal extracties met meerdere monsters om replica's te bieden.Als u een verzamelapparaat wilt maken voor elke geselecteerde locatie, gebruikt u een stap bit bevestigd aan een boorpers om een gat te boren aan de onderkant van een spuitbeker. Snijd vervolgens een rechte lijn van de bovenkant van het gat naar de mond van de spuitbeker. Boor nu vier gelijke gaten groot genoeg om de plastic gecoate draad draad aan de mond van de spuitbeker.Bevestig het ene uiteinde van de met plastic gecoate draden en laat het ene uiteinde vrij. Boor een gat groot genoeg om de verfspray of bekeradapter in een deksel van 50 milliliter centrifuge te rijgen. Sluit de adapterdraden af met parafilm om lekken te voorkomen.Bevestig dit aan zowel de centrifuged als het schroefdraadgedeelte van de spuitbeker. Bevestig vervolgens de gedekte 50 millimeter centrifugebuis. Maak vier verzamelapparaten per bemonsteringslocatie.Implementeer apparaten op geselecteerde locaties door sproeibekers te buigen om op stengels te passen. Oriënteer de snijzijde van de spuitbeker naar boven met behulp van de plastic gecoate draden die aan andere stengels zijn bevestigd. Dit zorgt ervoor dat water dat over de bloemen gaat wordt gevangen.Om regenwater van cranberrybloemen te verzamelen, verwarmt u eerst acht gelijke gaten rond de mond van de trechter met behulp van een metalen sonde. Steek twist banden in vier van de gaten. Bevestig de andere uiteinden aan de tegenovergestelde locatie van dat gat en vormt een nette kruisingspatroon.Wikkel de trechter af met parafilm en zet apart. Boor een gat groot genoeg om de trechter in te voegen stam in een 50 milliliter centrifuge dop met een stap bit. Steek de voorbereide trechter in de centrifuged.Na regenval of luchtirrigatie, verwijder en vervang het onderste buisgedeelte van de centrifugebuis. Het regenwater opvangbuizen moeten snel worden veranderd na bevochtiging gebeurtenissen als ze gevoelig zijn voor afbraak van natuurlijke verontreinigingen gemobiliseerd in de afvoer, zoals bacteriën en andere schimmels. Plaats twee lagen papierschijven in kweekschalen en geniet van twee milliliter steriel gedestilleerd water.Meng vervolgens gelijke volumes steriel gedestilleerd water en bloemenextract op waterbasis in twee milliliter microcentrifugebuizen. Voeg vervolgens een gelijk volume van de sporensuspensie toe aan de bereide twee milliliter microcentrifugebuizen. Het resulterende preparaat wordt aangeduid als een waterig behandelingsmengsel.Voor de controle, weglaten van de florale extract gedeelte en vervangen door steriele gedestilleerd water om de conidial concentraties consistent te houden. Plaats nu pre-schoongemaakte glazen coverslips op de top van de geweekte papieren handdoeken binnen de cel cultuur schotel. Plaats een druppel van 40 microliter van waterig behandelingsmengsel op het midden van een coverslip.Herhaal dit voor de gewenste behandelingen, waaronder de controle. Sluit dan het celkweekgerecht. Zodra alle behandelingen en repliceert zijn afgegeven, plaats alle gerepliceerde celkweek gerechten in een verzegelde plastic container en uitbroeden op 25 graden Celsius in het donker.Voeg op vooraf bepaalde tijdstippen 10 microliter van een fixatief toe aan de druppels die de groei stoppen en de berg semi-behouden. Zodra een fixatief is toegevoegd, voorzichtig omkeren de coverslips plaatsen elk van hen druppelkant naar beneden op een glazen microscoop dia om microscopisch onderzoek te vergemakkelijken. Wanneer alle coverslips zijn op de glazen microscoop dia's, laat ze te vestigen en gedeeltelijk droog in de flow hood gedurende 20 minuten.Tel alle conidia aanwezig op de coverslip met inbegrip van primaire conidia, ontkiemde conidia, en nieuw gevormde secundaire conidia, evenals appressoria. Werk op 400 keer vergroting of 200 keer in totaal een oppervlakte van 3.808 vierkante millimeter. Voeg in een laminaire stroomkap twee gelijke volumes steriel gedestilleerd water en één volume sporensuspensie toe aan een twee milliliter microcentrifugebuis.Zet dit waterige behandelingsmengsel opzij voor chloroform-gebaseerde florale extract bioassays. Plaats in een rookkap een Van T Cell op een glazen kaplip in het bereide plastic celkweekgerecht. Doe 33 microliter van gewenst chloroform-gebaseerde bloemenextract in het midden van de cel en laat drogen.Raak de wanden van de cel niet aan. Voor de controlebehandeling, voeg maagd chloroform. Zodra het bloemextract op basis van chloroform is gedroogd, moet u 99 microliter van het bereide waterige behandelingsmengsel met een standaardpipet in het midden van de Van T Cell uitdelen.Sluit dan alle celkweekgerechten en incubbate. Voeg op vooraf bepaalde tijdstippen 15 microliter van een fixatief toe aan de Van T Cell en laat deze minstens vijf minuten zitten om voldoende schimmelkleuring te garanderen. Verwijder na die tijd voorzichtig de Van T Cell.Voer coverslip-inversie- en gegevensverwervingsstappen uit als voorheen. Na microscopische evaluatie van C.fiorniae op 24 uur na de inenting, vergelijking van conidia in aanwezigheid van steriel gedestilleerd water versus water-based bloemenextract onthult een dramatische toename van de secundaire conidatie en appressorium vorming. Bij de vergelijking van de chloroforme bioassay steriele gedestilleerde waterbeheersing met extracten op basis van chloroforme water was het echter niet zo duidelijk dat deze vergelijkbaar was.Integendeel, C.fiorniae groei verschoven naar appressorial formatie. In deze test werden een steriele gedestilleerde watercontrole en cranberrychloroform-gebaseerde bloemenextracties visueel geïnspecteerd bij nul, zes, 12 en 24 uur na de inenting. Appressoriumvorming begon om zes uur in het bloemextract op basis van chloroform en nam gestaag toe gedurende de daaropvolgende tijdstippen.Dit resultaat ondersteunt de bevinding dat bloemen de tijd die nodig is om infectiestructuren te vormen verminderen. Ziektemanagement voor fruitrottende schimmels gaat vaak om bloom time fungicide toepassingen. Hier werden extracten op basis van veenbeschlorform uit meerdere groeistadia van cranberry visueel geëvalueerd op de effectieve oppervlaktewas op C.fiorniae na 24 uur na inenting.Eierstokken verzameld in juni, onvolwassen fruit verzameld in juli, en in augustus, geoogst fruit verzameld in oktober, en een steriele gedestilleerde watercontrole werden geïnspecteerd voor appressorial vorming. Extracten op basis van eierstokchloreren hadden de grootste omvang van appressoriale vorming die het belang van bloei in de levenscyclus van C.fiorniae aangeeft. De ziekteverwekker is de belangrijkste component van dit protocol.Schimmels moeten routinematig naar verse media worden verplaatst om de consistentie tussen de proeven te behouden. Alle werkzaamheden met chloroform moeten om veiligheidsredenen in een rookkap worden uitgevoerd. Dit omvat de bereiding van materialen en glaswerk, extractieprocedures en geleiding van de op chloroform gebaseerde bioassay.Combinaties van tijdpunten, ziekteverwekkers, bloemen regenwater collecties, of gastheer extracties kunnen worden gebruikt om verschillende gastheer-ziekteverwekker interacties te evalueren. De regenwateropvangapparaten en bijbehorende bioassays zullen anderen in staat stellen om te werken met gastheer-stimulerende middelen gemobiliseerd tijdens regen evenementen in tal van pad systemen.

colletotrichum-fioriniae-development-water-chloroform-based-blueberry

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Een push-pull-methode voor het verzamelen van planten vluchtige stoffen wordt beschreven. De methode zorgt voor een vergelijking van de vluchtige stoffen veroorzaakt door herbivore voeden, exogene methyljasmonaat, en mechanische beschadigingen. Deze techniek wordt ook gebruikt om de volatiele reactie van onbeschadigd takken om de blootstelling aan vluchtige stoffen te onderzoeken van herbivoor-beschadigde takken binnen de bosbes planten.

Herbivoor-geïnduceerde Blueberry Vluchtige stoffen en Intra-plant Signaling

Methoden worden beschreven voor dunne-laag chromatografie (TLC) scheiding van plantenextracten en contact bioautografie antibacteriële metabolieten te identificeren. De methoden worden toegepast op de screening van rode klaver fenolen remmen hyper-ammoniak-producerende bacteriën (HAB) thuishoren in de runder pens.

Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

We presenteren hier een protocol om modellen te construeren en valideren voor niet-destructieve voorspelling van totaal suiker, totaal organisch zuur en totaal anthocyanine gehalte in individuele bosbessen door middel van near-infrared spectroscopie.

Bouw van modellen voor destructieve Voorspelling van Ingredient Inhoud in Bosbessen door Near-Infrared Spectroscopy Op basis van HPLC Metingen

In dit werk wordt een stap-voor-stap methode beschreven om polyphenolrijke extracten uit gevriesdroogd bessenpoeder te bereiden. Daarnaast biedt het een grondige beschrijving van hoe deze polyphenol-rijke extracten in celkweek kunnen worden gebruikt in aanwezigheid van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van het peptidehormoon-angiotensine II (Ang II).

Extractie en zuivering van polyfenolen uit bevroren gedroogde bessenpoeder voor de behandeling van vasculaire gladde spiercellen<em&gt; In Vitro</em

Een headspace vaste fase micro-extractie-gas-chromatografie platform wordt hier beschreven voor snelle, betrouwbare en semi-geautomatiseerde vluchtige identificatie en kwantificering in rijpe zwarte bessenvruchten. Deze techniek kan worden gebruikt om de kennis over fruitaroma te vergroten en cultivars met verbeterde smaak te selecteren voor het doel van veredeling.

Profilering van vluchtige stoffen in zwarte bessenfruit met behulp van Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Hier wordt een methode beschreven om plantenweefsels transparant te maken met behoud van de stabiliteit van fluorescerende eiwitten. Deze techniek vergemakkelijkt diepe beeldvorming van geklaarde plantenweefsels zonder fysieke doorsnede.

Optische clearing van plantenweefsels voor fluorescentiebeeldvorming

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Dit protocol beschrijft het gebruik van een op polyol gebaseerde microgolf-ondersteunde extractiemethode voor het extraheren van fenolische verbindingen en natuurlijke antioxidanten, wat een praktische en ecologisch duurzame benadering vertegenwoordigt voor de ontwikkeling van kant-en-klare extracten.

Microgolf-geassisteerde extractie van fenolische verbindingen en antioxidanten voor cosmetische toepassingen met behulp van technologie op basis van polyol

Er werd een bioassayprotocol met losstaande bladeren opgesteld voor het massaal kweken van chilitrips met behulp van een aangepaste methode met vrijstaande bladeren in agarhoudende glazen containers, wat een hoge overleving en gesynchroniseerde ontwikkeling garandeert. Dit systeem maakt een efficiënte screening van entomopathogene schimmelvirulentie tegen 2e instar-larven mogelijk en biedt een betrouwbare tripsvoorziening voor laboratorium-, kas- en veldevaluaties.

Opzetten van een kweeksysteem voor chilitrips (Scirtothrips dorsalis hood) voor virulentiescreening van entomopathogene schimmels

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer bioassays voor het monitoren van Colletotrichum fioriniae ontwikkeling met bloemextracten van bosbessen en cranberries. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van plant-pathogeen interacties.

Colletotrichum fioriniae Ontwikkeling in Water en Chloroform gebaseerde Blueberry en Cranberry Floral extracten

Meer video's verkennen