Exploitatie van de levende Imaging te Track kernen tijdens Myoblast differentiatie en Fusion

Zonder protocol is het mogelijk om het dynamische proces van myoblast differentiatie en myofibervorming te onderzoeken, met name nucleaire positionering door gebruik te maken van live celbeeldvorming. Live celbeeldvorming van myoblast met vreemde celkernen maken de studie van myoblast differentiatie in levende cellen en de automatische tracking van de kernen mogelijk. Visuele demonstratie helpt bij het begrijpen hoe primaire celisolatie te combineren met live imaging en imaging analyse.

Het aantonen van de procedure met Frederica Colombo, zal Giorga Careccia, een promovendus in ons laboratorium. Begin met het oogsten van de tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps, en triceps spieren van beide achterste ledematen van een volwassen muis in een petrischaaltje van PBS op ijs. Gebruik steriele schaar en pincet om zorgvuldig te verwijderen van de pezen en vet uit elke spier en de overdracht van de spieren in een lege petrischaal.

Met behulp van steriele gebogen schaar knippen en gehakt van de spieren tot een uniforme massa is verkregen en de overdracht van de spierstukken naar een 50 milliliter buis. Voeg vervolgens 10 milliliter spijsverteringsmedium toe aan de spierstukken voor een incubatie van 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius bij 250 rotaties per minuut. Aan het einde van de enzymatische spijsvertering, stop de reactie met 10 milliliter blokkeermedium.

En draai het monster door centrifugatie. Zet de buis op ijs en breng de supernatant in een nieuwe 50 milliliter buis. Centrifuge de supernatant weer.

En de pellet opnieuw op te schorten in een millimeter DMEM. Vul het aan met tien procent foetaal runderserum, of FBS, op ijs. Verteren de gereserveerde pellet in 10 milliliter vers spijsvertering medium zoals net aangetoond en combineer de verteerd pellet met de reserve cel suspensie, op ijs.

Zeef de getrokken cellen door een filter van 70 micrometer, gevolgd door een filter van 40 micrometer. En was de cellen in 15 millimeter verse DMEM, aangevuld met 10 procent FBS. Aan het einde van de centrifugatie, opnieuw opschorten de pellet in drie milliliter van rode bloedcel lyse buffer bij kamertemperatuur.

Het stoppen van de lysis na vijf minuten met 40 milliliter PBS en een extra centrifugatie. Stel de pellet opnieuw op in 20 milliliter DMEM aangevuld met 10 procent FBS en pre-plate de cellen in ongecoat petrischaal. Na een uur op 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide verzamelen de satellietcel met supernatant.

En pre-plate de cel suspensie nog twee keer zoals aangetoond. Na de laatste beplating, verzamel de satellietcellen door centrifugatie en opnieuw op te schorten de pellet in 40 milliliter van verse proliferatie medium. De splitsing van de cellen tussen twee collageen gecoate 150 milliliter Petri gerechten met een microgram per milliliter doxycycline per schotel te induceren H2BGFP expressie.

En breng de cellen terug naar de celkweek incubator voor twee of drie dagen. Wanneer de myoblasten de juiste experimentele dichtheid hebben bereikt, was de cellen in elk gerecht met vijf milliliter PBS en maak de cellen vijf minuten los van de plaatbodems met twee milliliters Trypsin per schaal bij 37 graden Celsius. Bevestig loslating door lichte microscopie en stop de reactie met vijf milliliter DMEM plus tien procent FBS per plaat.

Voor live cel beeldvorming, plaat twee keer tien tot de vijfde cellen in elke put van een 12 goed plaat bekleed met 350 microliters van differentiatie medium, aangevuld met kelder membraan matrix per put voor twee uur. Wanneer de cellen zich aan de onderkant van de plaat hebben gehouden, plaatst u de plaat in een 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide incubator op een confocale microscoopfase en gebruik een 20 keer droog doel om gezichtsvelden te verkrijgen met honderden cellen om 16-bits beelden te verwerven met 1024 bij 1024 pixels per frame elke zes minuten gedurende 16 uur. Voor elke verworven positie genereert u een multi frame dot tif-bestand en download en extrahert u de dot zip-software in een geselecteerde map.

Open het voorbeeld van de map segmentatietracking en klik op segmentatiepunt M doen om het opdrachtvenster in Matlab te openen. Wijzig de due segmentatie dot M-scripts, zodat het variabele bestandsnaamspoor de naam is van het tif-bestands- en padinvoerspoor de map waarin de punttif is opgenomen. Klik op uitvoeren om het script uit te voeren.

Het resultaat van de segmentatie wordt opgeslagen als een file dot mat, terwijl de segmentatie van de kernen kan worden gevisualiseerd in de uitvoer figuur. Als u de tracks wilt genereren, genereert u eerst met dubbele klik tracks dot M in dezelfde werkmap. Wijzig vervolgens de bestandsnaam in bestandsnaam punt het juiste puntmatbestand voor de gesegmenteerde kernen.

Klik op Uitvoeren om het script uit te voeren. Het resultaat van de tracking wordt opgeslagen als een ander dot mat-bestand en de gegenereerde tracks worden uitgezet. Om de kwaliteit van de sporen te evalueren.

Klik eerst op de controletrackingpunt M en wijzig de bestandsnaam naar de juiste naam dot tif. Klik vervolgens op het spoor van bestandsnaam om het puntmatbestand van de tracks te gebruiken en klik op uitvoeren. Gebruik in het figuurvenster de onderste schuifbalk om de kern te selecteren.

De geselecteerde kern wordt in het rood omcirkeld en de baan van de geselecteerde cel kan op tijd worden gevolgd met behulp van de bovenste schuifbalk. Groene kruizen geven de gedetecteerde kernen aan. Proliferatie en differentiatie zijn sterk aangetast in myoblasts gekweekt met Hoechst.

Vergeleken met myoblast's geïsoleerd van H2BGFP muizen en gekweekt met doxycycline of wild type, myosin zware keten gelabeld myoblasts. Live celbeeldvorming met primaire myoblasten die het H2BGFP-eiwit uitdrukken, maakt het mogelijk om de kernen tijdens differentiatie te volgen. Samengevoegde beelden van transmissie in GFP-kanalen op de eerste en laatste tijdstippen van de differentiatieperiode, maken de identificatie van myotubes en dus kernen mogelijk die uiteindelijk integreren in myotubes of die niet samensmelten in myobuizen.

Na beeldvorming door confocale fluorescentiemicroscopie, kunnen de kernen worden gesegmenteerd zoals aangetoond en kan de keerpunttransformatie worden gebruikt om nabijgelegen objecten te scheiden. Met deze aanpak worden de meeste kernen in het beeld geïdentificeerd, waardoor de kernbeweging kan worden gevolgd zoals aangetoond. Zo blijkt bijvoorbeeld dat de totale lengte van de trajecten iets hoger is voor cellen die met Hoechst zijn gekleurd.

Hoewel het verschil niet significant is. Echter, berekening van de totale verplaatsing tijdens een time lapse blijkt dat de totale verplaatsing van de cellen bevlekt met Hoechst is aanzienlijk kleiner dan die van niet-gekleurde cellen. Zoals voorspeld is de totale jaarlijkse variatie voor de niet-gekleurde cellen aanzienlijk kleiner in vergelijking met cellen bevlekt met Hoechst.

Het is belangrijk om het protocol precies te volgen zoals aangetoond in het bijzonder bij het combineren van de technische vaardigheden van de biologische stappen met de confocale microscoop en software gebruikte stappen. Om myoblast differentiatie en nucleaire positionering te bestuderen in een ander spiermodel van belang is het mogelijk om geïsoleerde myoblast over te dragen met fluorescerend nucleair eiwit. Deze techniek maakte de weg vrij om cellulaire en nucleaire dynamiek tijdens spierdifferentiatie te verkennen en defecten in deze processen verder te onderzoeken.

Onder verschillende pathologische aandoeningen zoals spierdystrofies.