Name: High-throughput Nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden Cholesterol Efflux Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Leer een hoge-doorvoer NBD-cholesterol efflux-assay voor cardiovasculair risico-onderzoek met behulp van macrofaagcellen. Deze veilige methode vervangt radioactieve technieken en ondersteunt efficiënte screening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het onderzoek verleent FIS (PS12/00866) van het Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spanje; Fondo Europeo para el Desarrollo regionale (EFRO); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) en CERCA programma / Generalitat de Catalunya. De auteurs bedanken de Retrovirology en virale Immunopathologie laboratorium van het Institut d'Investigacions Biomèdiques augustus Pi I Sunyer (IDIBAPS). Wij danken T. Escribà, C. Rovira en C. Hurtado voor hun hulp en S. Cufí van de kennis en de technologie Transfer Office voor haar begeleiding bij de bescherming van de uitvinding.

Voor deze studie werd werden ethisch comité goedkeuring (Comitè Ètic d'Investigació Clínica; Hospital Clinic, Barcelona; goedkeuringsnummer HCB/2014/0756) en schriftelijke, geïnformeerde toestemming van alle onderwerpen verkregen.
1. NBD-cholesterol voorbereiding
<ol><li>Los van de NBD-cholesterol (MW 494.63; Zie Tabel van materialen) in pure ethanol om te verkrijgen van de voorraad (2 mM). Voor een flacon van 10 mg, Los de inhoud van het hele flesje in een volume van 10,1 mL ethanol te verkrijgen van een voorraad van 2 mM.</li>
	<li>Verdun de NBD-cholesterol uit de voorraad in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale boviene serum en 5% penicilline/streptomycine (R10 medium) tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM (b.v., 10 mL van NBD-cholesterol bij 5 μM eindconcentratie verkrijgen) door verdunning 25 μL van NBD-cholesterol voorraad (2 mM) in R10 medium. Dit volume is voldoende voor een 96-wells-plaat.</li>
</ol>2. cel cultuur en zaaien (dag-2)
<ol><li>Cultuur THP-1 cellen in R10 medium bij 37 ° C, 5% CO2. Aanpassen naar 0.3 x 106 cellen/mL elke 3 dagen.</li>
	<li>Zaad de cellen in een witte 96-wells-plaat met een platte, heldere bodem op 0,2 x 106 cellen per putje in R10 medium (100 μl per putje).</li>
	<li>Behandelen van de cellen met 100 nM phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA; uit een voorraad van 10 μM) gedurende 48-72 uur, incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 om te differentiëren THP-1 cellen in dmTHP-1. Opmerking: Het is aanbevolen om gebruik 5 μL van PMA voorraad (10 μM) in 500 μL van R10 medium. Voorafgaand aan deze, bereiden een 10 μM PMA voorraad door ontbinding van een flesje gelyofiliseerd 1 g in 10 mL dimethylsulfoxide (DMSO), hoeveelheid en voorraad bij-20 ° C.</li>
	<li>U kunt ook (suggestie) combineren stappen 2.2 en 2.3 voor betere homogenisering. Bereiden van 10 mL THP-1 cellen in een tube van 15 mL, voeg 200 l PMA voorraad (10 μM), meng zachtjes en onmiddellijk zaad 100 μl per putje op het bord. Incubeer de cellen zoals beschreven in stap 2.3.</li>
</ol>3. apolipoproteïne B uitgeput Serum (ABDS) voorbereiding (dag 2 of 3)
<ol><li>Ter voorbereiding van een oplossing van polyethyleenglycol (PEG), Verdun glycine in 10% PBS (met steriele H2O) een concentratie van 200 mM met een pH van 7,4. Voeg 40 mL 200 mM glycine à 10 g van PEG 8000 verkrijgen van PEG 20% (m/v). Meng de oplossing krachtig te homogeniseren.</li>
	<li>Toepassing 4 delen van 20% per 10 delen van serum/plasma op elk serum/plasma monster in de buis van een 1,5 mL PEG en laat het mengsel op het ijs voor 25 min17 (bijvoorbeeld 100 μl van plasma of serum, voeg 40 μL van 20% PEG oplossing).</li>
	<li>Centrifugeer het PEG-apolipoproteïne B neerslag bij 13.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Gooi de neerslag. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Opmerking: Het is raadzaam om de voorbereiding van de ABDS op dag 3 (verse). Als het niet mogelijk is, bereiden de ABDS op dag 2 en houden het bij 4 ° C's nachts.</li>
</ol>4. NBD-cholesterol cel laden (dag 2)
<ol><li>Negeren van de voedingsbodem van de dmTHP-1 en wassen van de cellen tweemaal met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Laden van de cellen met 5 μM NBD-cholesterol (100 μl per putje) in R10 medium en na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>5. incubatie met Cholesterol acceptanten (dag 3)
<ol><li>Negeren van het medium en wassen van de cellen tweemaal met PBS.</li>
	<li>Incubeer de cellen met 2-5% ABDS of de gewenste concentratie van gezuiverde lipide acceptor (HDL, ApoA, ApoE, etc.) verdund in kleurloze RPMI 1640 medium (100 μl per putje) gedurende 4-6 uur bij 37 ° C. Opmerking: Omvatten een negatieve controle (C-) bestaande uit kleurloze RPMI 1640 medium zonder Acceptanten en een positieve controle (C +) (bijvoorbeeld ABDS uit een pool van gezonde donoren) of gezuiverd HDLs. Opmerking dat de positieve controle geldt met name wanneer de patiënt monsters (ziekten) zijn geanalyseerd (aanvullende figuur 1).</li>
	<li>Voorbereiden van een voorraad van 200 mL van de oplossing lysis van de cel 1 (50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, H2O). Meng de cellysis oplossing 1 op 1:1 (v: v) verhouding met pure ethanol te verkrijgen van de lysis oplossing 2.</li>
</ol>6. fluorescent signaal vangen (dag 3)
<ol><li>
Media NBD-cholesterol detectie
	<ol>
<li>Verwijder het medium van de cel aan de platen en verzamelen in een nieuwe witte 96-wells-plaat met een ondoorzichtige platte bodem.</li>
		<li>Voor een optimale fluorescentie signaal detectie in de media-monsters, voeg toe 100 μl van pure ethanol aan 100 μl van elk medium monster te verkrijgen van een 1:1 verhouding in de witte 96-wells-plaat.</li>
		<li>De plaat met de behandelde media houden voor verdere maatregel, wordt de intensiteit van de fluorescentie (FI) bij een golflengte van 463⁄536 nm (excitatie/emissie) in de luminometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detectie van intracellulaire NBD-cholesterol
	<ol>
<li>Wassen van de cellen tweemaal met PBS.</li>
		<li>Voor het verkrijgen van de intracellulaire cholesterol, lyse de cellen door ze aan het broeden met 100 μl van lysis oplossing 2 per putje en schud de plaat bij kamertemperatuur (RT) gedurende 25 minuten.</li>
		<li>Voor een optimale fluorescentie signaal detectie in de lysate celsteekproeven, vangen de intensiteit van de fluorescentie van de cel lysates in dezelfde witte 96-wells-plaat met duidelijk plat bodemplaat (de dezelfde waarin cellen werden zaadjes in stap 2.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>6.3 meet de intensiteit van de fluorescentie (FI) in de luminometer terwijl het aanpassen van de parameter van de gevoeligheid tot 50 in de software (Zie Tabel van materialen).</li>
</ol>7. resultaten analyse
<ol><li>Het cholesterol efflux tarief van een monster wordt uitgedrukt als een percentage berekend met de formule: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg">
</li>
	<li>De definitieve maatregel van cholesterol efflux (CE) verkrijgen door de CE van de negatieve controle (voorbeeld vol met NBD-cholesterol maar geïncubeerd met kleurloze RPMI 1640 medium, zonder cholesterol acceptanten) af te trekken van de CE van een gegeven monsters: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2018).</li>
<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
<li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Clinical+Cases%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).</li>
<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
<li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li>
<li>Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements%3A+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li>
<li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-cholesterol%3A+Is+it+really+good%3F+Differences+between+apoA-I+and+HDL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li>
<li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li>
<li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples%3A+Systematic+Review+of+the+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li>
<li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Probes+and+Tags+to+Study+Biomolecular+Function%3A+for+Proteins%2C+RNA%2C+and+Membranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li>
<li>Ostašov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells%3A+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li>
<li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li>
<li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li>
<li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li>
<li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+reporter+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li>
<li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanden+Development+of+a+Cell-Based%2C+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li>
<li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function%3A+implications+for+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li>
<li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sage+weed+%28Salvia+plebeia%29+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li>
<li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport%3A+Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li>
<li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity%2C+high-density+lipoprotein+function%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li>
<li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li>
</ol>

De auteurs willen verklaren dat ze de uitvinders van de octrooiaanvraag (EOB; 18382337.6-1118; 17 mei 2018) getiteld "Method for determining cholesterol efflux" op basis van deze methode.

TL-gelabelde cholesterol is een veelbelovende strategie om te analyseren en onderzoeken van de eigenschappen en het metabolisme van natuurlijke cholesterol in vitro. De belangrijkste voordelen zijn dat het kan worden overgenomen door cellen, toelaat voor intracellulaire en membraan distributie studies, en kan worden toegepast op cholesterol efflux assays zoals in dit protocol (Figuur 7). Aantal TL-gelabelde sterolen toestaan cholesterol bijhouden in vitro met inbegrip van BODIPY-cholesterol,...

Volgens de World Health Organization zijn de huidige belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd ischemische hartziekte en beroerte (accounting voor een totaal van 15,2 miljoen doden)1. Beide zijn cardiovasculaire aandoeningen (CVD) die kunnen worden voorafgegaan door atherosclerose en de breuk van atheroma plaques in de bloedvaten2,3.
Atherosclerose is een vaartuig muur ontstekingsziekte waarin macrofagen, T-cellen, mestcellen en dendritische cellen infiltreren het endotheel en uit het bloed, uiteindelijk de vorming van atherosclerotische plaques ophopen. Atherosclerotische plaques presenteren een lipide kern en cholesterol kristallen, blijkt uit de hoge resolutie B-modus Ultrasonografie metingen van de carotis intima media dikte4,5. In macrofagen, wordt cholesterol efflux naar lipide acceptor deeltjes uitgevoerd door middel van de ATP-binding cassette (ABC) receptoren ABCA1, ATP-binding cassette onderfamilie G lid 1 (ABCG1), en de scavenger receptor SR-BI. Het gebrek aan evenwicht van cholesterol toestroom en efflux in macrofagen wordt beschouwd als een belangrijke proces in atherosclerose Inleiding6. Cholesterol efflux wordt beschouwd als een belangrijke stap in de eliminatie van cholesterol uit perifere weefsel aan het plasma en de lever in een proces genaamd reverse cholesteroltransport (RCT). Cholesterol wordt overgebracht van macrofagen voornamelijk aan apolipoproteïne A1 (ApoA1) gevonden op het oppervlak van high-density lipoproteïne (HDL) deeltjes. HDLs vervoer dan cholesterol naar de lever voor uitscheiding en hergebruikt7,8,9.
Tritium (3H) radioactief gemerkte cholesterol is traditioneel gebruikt in cholesterol efflux10. Het signaal van de emissie van radio-isotopen is zeer gevoelige10; radioactief gemerkte cholesterol kampt echter voor de hand liggende handicaps zoals lange protocollen, risico van blootstelling aan ioniserende straling en de noodzaak van speciale radioactiviteit faciliteiten en apparatuur om ervoor te zorgen veilig omgaan met radioactieve emissies. Integendeel, is fluorescentie met succes overgenomen in diagnostische technieken vanwege zijn eenvoud in fluorescerende signaal detectie, de grote verscheidenheid van fluorophores beschikbaar en zijn veiligheid11. Verschillende TL-gelabelde Sterolen zijn gebruikt voor het bestuderen van cholesterol metabolisme met inbegrip van dehydroergosterol (met intrinsieke fluorescentie), dansyl cholesterol, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - cholesterol, en 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-Diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-cholesterol). NBD-cholesterol presenteert in het bijzonder een efficiënte opname in menselijke cellen12. Twee verschillende NBD geëtiketteerd-cholesterol zijn momenteel beschikbaar: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) en 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figuur 1). Cholesterol geëtiketteerd met 22-NBD deel kan best past bij cholesterol efflux studies, terwijl 25-NBD-cholesterol voornamelijk in cellulaire membraan dynamics onderzoek13,14 gebruikt wordt.
Cellijnen meestal gebruikt in in vitro cholesterol efflux testen zijn monocyt-achtige cellen zoals THP-1 voor menselijke leukemie-afgeleide cellen, lymfkliertest Raw 264.7 cellen15of J774.1. Al deze cellen kunnen worden onderscheiden in macrofagen in vitro met behulp van phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), maar THP-1-afgeleide macrofagen (dmTHP-1) beste weerspiegelen en de menselijke macrofagen16na te bootsen.
In de huidige studie, we optimaliseren en standaardiseren van een fluorescerende high-throughput methode om te bepalen de cholesterol efflux capaciteit van serummonsters op dmTHP-1, met behulp van 22-NBD-cholesterol als alternatief voor [3H]-cholesterol. Daarnaast vergelijken wij de geoptimaliseerde fluorescerende techniek met de standaard radioactieve analoge.

<table><tbody><tr><td>96-well verzamelplaat</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3912</td><td>witte 96-well plaat met ondoorzichtige heldere bodem</td></tr><tr><td>96-well kweekplaat</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3610</td><td>witte 96-well plaat met platte heldere bodem</td></tr><tr><td>Cholesterol Efflux Assay Kit (Cell-based)</td><td>Abcam</td><td>ab196985</td><td>commerciële hoogdoorvoerige op cellen gebaseerde testkit gericht op het bepalen van de cholesterol efflux</td></tr><tr><td>kleurloze RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640 zonder pehnol-rood</td></tr><tr><td>Gen5 Data Analysis Software</td><td>BioTek</td><td></td><td>Versie 2.0</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>Glycine, niet voor dierlijk gebruik</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>Multi-Detectie Microplaat Reader</td></tr><tr><td>Lysis Oplossing 1</td><td>in-house</td><td></td><td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl en H2O</td></tr><tr><td>Lysis Oplossing 2</td><td>in-house</td><td></td><td>Pure ethanol en Cell Lysis Oplossing 1:1 (v:v)</td></tr><tr><td>NBD-cholesterol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&beta;-Ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>Fosfaat-gebufferde&nbsp;zoutoplossing</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202452-250G</td><td>polyethyleenglycol</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td>Phorbol 12-merystaat B-acetaat.</td></tr><tr><td>R10</td><td>in-house</td><td></td><td>RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 5% Penicilline/Streptomycine.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640 met 2 mM L-glutamine bevattend 1,5 g/L natriumbicarbonaat en 4,5 g/L glucose</td></tr><tr><td>THP-1 cellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ATCC, #TIB-202</td><td>monocyte-achtige lijn afgeleid van leukemie van een baby van één jaar oud</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden cholesterol efflux assay

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Arteriosclerose leidt tot hart-en vaatziekten (HVZ). Het is nog onduidelijk of de concentratie cholesterol-HDL (cHDL) een oorzakelijke rol speelt in de ontwikkeling van atherosclerose. Echter, een belangrijke factor in de vroege stadia van de atheroma plaque vorming is cholesterol efflux capaciteit aan HDL (de mogelijkheid van HDL-deeltjes te accepteren van cholesterol van macrofagen) om te voorkomen dat schuim celvorming. Dit is een belangrijke stap bij het vermijden van de ophoping van cholesterol in het endotheel en een deel van reverse cholesteroltransport (RCT) om te heffen van cholesterol door de lever. Cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument dat kan worden gebruikt als biomerker voor atherosclerose. Traditioneel, [3H]-cholesterol is gebruikt in cholesterol efflux testen. In deze studie streven wij naar het ontwikkelen van een strategie van het veiliger en sneller met behulp van fluorescerende geëtiketteerd-cholesterol (NBD-cholesterol) in een cellulaire assay voor het traceren van het cholesterol opname efflux proces en in macrofagen THP-1-afgeleide. Tot slot, wij optimaliseren en standaardiseren van de NBD-cholesterol efflux methode en ontwikkelen van een high-throughput-analyse met behulp van 96-wells-platen.

Het doel van de bepaling van de efflux cholesterol is om in vitro de cholesterol efflux capaciteit van een bepaalde serum, plasma of supernatant met HDL-deeltjes. De methode bestaat uit geëtiketteerd-cholesterol in een cultuur van een standaard macrofaag cellijn laden en inducerende contact met het testen monster in FBS-vrije media met de cellen worden verdund. Tot slot worden de fluorescerende niveaus van de NBD gemeten in de media en de cel lysate. Voor het optimaliseren van metingen, wordt de effluxed cholesterol uit ...

Meting van in vitro cholesterol efflux capaciteit serum of plasma in macrofaag cel modellen is een veelbelovend instrument als een biomarker voor atherosclerose. In de huidige studie, optimaliseren wij en een fluorescerende NBD-cholesterol efflux methode standaardiseren en ontwikkelen van een hoge-doorvoer-analyse met behulp van 96-wells-platen.

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Dit protocol is onze cel gebaseerde methode voor de cholesterol beëindiging van cholesterol reflux in ceramal plasma. Vooral in screenings. Dit kan worden toegepast om cardiovasculair risico te diagnosticeren, en om cholesterol lager onderhoud te identificeren of te evalueren.Deze techniek vermijdt het risico en de lasten als de veiligheid aan met het behandelen van uitgestraalde materialen door het verstrekken van resultaten met vergelijkbare kwaliteitsniveaus, aan die van Cholesterol reflux is gemeld om met zo te associëren, kan de plasma of ceramale cholesterolreflux van toegelaten worden vergeleken, aan onze verwijzingscontrole en kan het risico verstrekken om aan te lijden Deze methode zal ook op de cellijnen worden toegepast , net als andere menselijke cellijnen of zelfs primaire macrofasen. Macro fasen of en door de mens veroorzaakte spray knop stamcellen. Los om met deze procedure te beginnen het NPD-cholesterol in zuivere ethanol om een voorraadoplossing te verkrijgen met een uiteindelijke concentratie van twee micromolar.Verdun 25 microliter van de NBD cholesterolvoorraad in AR 10 medium om een uiteindelijke concentratie van vijf micromolar te bereiken. Kweek thp-1 cellen in ons 10 medium op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Elke drie dagen pas de celdichtheid aan op 300000 cellen per milliliter.Dan krijg je een 96-put plaat met een platte heldere bodem. Voor een betere homogenisatie, bereid een 10 milliliter thp-1 cellen in een 15 milliliter buis, en voeg 200 microliter pma voorraad. Meng voorzichtig en zaad 100 microliter van het mengsel in de plaat putten op 200,000 cellen per put.En incubeer bij 37 graden celsius met 5%kooldioxide gedurende 48 tot 72 uur om de thp-1 cellen te onderscheiden in DM thp-1 cellen. Verdun glycine eerst in 10%PBS met steriel water, tot een concentratie van 200 micromolar bij pH 7.4. Voeg 40 milliliter verdunde glycine toe aan 10 gram peg 8000 om een 20%peg-oplossing voor te bereiden en meng krachtig om te homogeniseren.Breng vervolgens vier delen van 20% per 10 delen van het monster aan op elk serum of plasmamonster in een buis van 1,5 ml. Laat het mengsel 25 minuten op ijs staan. Centrifuge de pin apolipoproteïne B neergeslagen op 13000 keer G, en op vier graden celsius gedurende 15 minuten.Gooi het neerslag weg en breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Haal de plaat met de gedifferentieerde thp-1 cellen. Verwijder en gooi het kweekmedium weg en was de cellen twee keer met 1X PBS.Voeg 100 microliter van 5 micromolar MVD cholesterol in AR-10 medium aan elke put. Incubeer 's nachts bij 37 graden celsius met 5%kooldioxide. De volgende dag weggooien, gooi het medium.Was de cellen twee keer met PBS, en voeg vervolgens 100 microliters ABDS, of gezuiverde lipide acceptor verdund in rpmi 1630 medium aan de gewenste concentratie aan elke put. Neem een negatieve controle op die geen cholesterol acceptoren bevat in een positieve controle, zoals beschreven in het tekstprotocol, en uitbroeden bij 37 graden Celsius gedurende vier tot zes uur. Bereid ondertussen een voorraad van 200 milliliter voor van cellyseoplossing zoals beschreven in de tekst.Meng deze oplossing met ethanol, met een één-op-één volumetric ratio om ook lyse-oplossing te verkrijgen. Voor media en BD cholesterol detectie, verwijder de cel medium van de platen in verzameld in een nieuwe witte 96-put plaat met een ondoorzichtige platte bodem. Voeg 100 microliter pure ethanol toe aan 100 microliter van elk medium monster om een één-op-één verhouding in de nieuwe plaat te verkrijgen.Met behulp van een illuminometer meet u de intensiteit van de fluorescerende bij een excitatie van 463 nanometer en een emissie van 536 nanometer. Voor intracellulaire NBD cholesterol detectie, was de cellen twee keer met PBS. Voeg 100 microliter lyse-oplossing ook toe aan elke put en broed bij kamertemperatuur in, terwijl u 25 minuten schudt.Meet hierna de intensiteit van de fluorescerende en stel de gevoeligheidsparameter aan op 50 in de software. Bepaal vervolgens de cholesterolleflux in de uiteindelijke maat van cholesterolflux zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdunnen NBD cholesterol in pure ethanol produceert de hoogste fluorescerende intensiteit waarden, terwijl een hoog gehalte in waterige oplossing, verlaagt de intensiteit.Dit suggereert dat de emissie van dit molecuul sterk afhankelijk is van het medium, waarin het zich bevindt. Bij het gebruik van een mengsel van media en ethanol bij een een-op-een verhouding, de tl-intensiteit lijkt proportioneel te verhogen, met een concentratie van de cholesterol analoog, wat suggereert dat de sonde zich geschikt gedraagt onder deze omstandigheden. Om te bepalen hoeveel tijd nodig is om de geladen cellen met cholesterol acceptoren uit te broeden, worden celmedia geoogst op verschillende tijdstippen.De cholesteroluitstroom evolueerde lineair van nul tot zes uur, waarbij het maximale signaal zes uur na ABDS aan de cellen wordt opgevangen. De verzadigingsdrempel en het dynamisch bereik worden getest door de cholesteroluitloop te meten bij verschillende percentages HDL-bevattende media. In het hoge doorvoermiddel evolueert de efflux lineair van één naar 7%ABDS en bereikt de piek van de cholesterolefluxcapaciteit met 7%Bij concentraties hoger dan 7% neemt de intensiteit van de fluroescent af in een omgekeerde relatie met het ABDS-percentage.De prestaties van de fluorescentie gebaseerde methode wordt vervolgens geëvalueerd door het te vergelijken met de standaard radio gelabelde techniek. Beide technieken zijn sterk gecorreleerd bij het gebruik van verschillende concentraties abds. De beschreven methode is gevoelig voor een toename van acceptorconcentraties binnen cholesterolfluxwaarden tussen de vijf en 15%Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de celluarizer geen aggregaten bevat.Kritiek punt is om een aggregaat ethanol bevattende omgeving te beoordelen, om de fluorescentie te meten in een homogene, en optimaal gewicht. Na deze procedure kan naamtechnische cholesterol worden gemeten en kan het effect van geneesmiddelen in de cholesterolefluxroute worden bepaald. Ook de school uiteindelijk worden gebruikt als een diagnose om cardiovasculaire risico's te nemen.Wij zijn van mening dat deze methode veel gemakkelijker en veiliger is dan de radioactieve standaardmethode. Nochtans is het nog celafhankelijk. Houd er rekening mee dat ethanol ontvlambaar is en dat deze moet worden opgeslagen en dienovereenkomstig moet worden behandeld.

high-throughput-nitrobenzoxadiazole-labeled-cholesterol-efflux-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De cholesterol test is ontworpen om de snelheid van cholesterol efflux uit gekweekte cellen en de capaciteit van plasma acceptoren cholesterol afgegeven door de cellen te accepteren kwantificeren. De test bestaat uit het etiketteren van cellen met cholesterol, evenwicht van cholesterol tussen de intracellulaire zwembaden en het vrijgeven van cholesterol aan een extracellulaire acceptor.

Cholesterol efflux Assay

Proteoliposomen worden gebruikt om gezuiverde kanalen en transporteurs te bestuderen die gereconstitueerd zijn in een goed gedefinieerde biochemische omgeving. Er wordt een experimentele procedure geïllustreerd om efflux gemedieerde door deze eiwitten te meten. De stappen om proteoliposomen voor te bereiden, de opnames uit te voeren en gegevens te analyseren om de functionele eigenschappen van het gereconstitueerde eiwit kwantitatief te bepalen worden beschreven.

Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal<sup&gt; -</sup&gt; Kanalen en Transporters

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Hier beschrijven we een fluorimetrische cel-vrije biochemische bepaling voor bepaling van de HDL-lipide peroxidatie. Deze snelle en reproduceerbare kwantitatieve analyse kan worden gebruikt om te bepalen van HDL functie in grootschalige studies en kan bijdragen aan ons begrip van HDL functie in ziekten bij de mens.

Cel-vrije biochemische fluorimetrische enzymatische Assay voor High-throughput meting van lipide peroxidatie in High Density lipoproteïne

Het doel van deze studie was om te evalueren in vitro lipide-verlagende drug effecten bij het moduleren van de morfologie van cholesterol deeltjes. Vergelijking van lipide-verlagende geneesmiddelen toonde variaties in hun effect bij het moduleren van de morfologische kenmerken van cholesterol deeltjes.

Differentiele effecten van lipide-verlagende geneesmiddelen bij het moduleren van de morfologie van Cholesterol deeltjes

Dit protocol biedt een efficiënte aanpak voor het meten van LDL cholesterol opname met real-time toestroom tarieven met behulp van een levende cel imaging systeem in verschillende celtypen. Deze techniek biedt een platform voor het scherm van de farmacologische activiteit van verbindingen op het gebied van LDL toestroom terwijl monitoring voor cel morfologie en vandaar potentiële cytotoxiciteit.

LDL Cholesterol opname Assay met behulp van levende cellen Imaging analyse met mobiele gezondheidsmonitoring

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

Dit protocol beschrijft een in vitro test voor het meten van de cellulaire lipideopname in endotheelcellen na stimulatie met BODIPY-C12 en BODIPY-C16 fluorescerende analogen van verzadigde vetzuren met lange en zeer lange ketens. Deze methode is efficiënt en kan worden aangepast aan andere celtypen en biedt een nuttige benadering voor het bestuderen van het lipidenmetabolisme.

Kwantificering van de opname van endotheliale vetzuren met behulp van fluorescerende vetzuuranalogen

Hierin beschrijven we de protocollen om de hoeveelheid fluorescerende fosfolipide te meten die specifiek uit lipidedonordeeltjes wordt verwijderd door lipoproteïne met hoge dichtheid (HDL) die aanwezig is in volledig menselijk plasma of serum. We hebben aangetoond dat deze metriek van HDL-functionaliteit incidentele hart- en vaatziekten voorspelt.

Lipoproteïne-specifieke fosfolipide-effluxtest met hoge dichtheid

Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

Leer een hoge-doorvoer NBD-cholesterol efflux-assay voor cardiovasculair risico-onderzoek met behulp van macrofaagcellen. Deze veilige methode vervangt radioactieve technieken en ondersteunt efficiënte screening.

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-geëtiketteerden Cholesterol Efflux Assay

Meer video's verkennen