Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Deze methode is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om grote hoeveelheden volledig gedifferentieerde osteoclasten in vitro te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het stabieler en veiliger is en isoleert beenmerg in minder tijd en met minder inspanningen in vergelijking met de traditionele procedure. Deze techniek kan een stabiele bron van osteoclasten, die het belangrijke object van bot metabole ziekte, met inbegrip van osteoporose, parodontitis, en periprosthetische osteolyse.

Met kleine wijzigingen kan dit protocol ook geschikt zijn voor het verkrijgen van verschillende soorten beenmerg afgeleid van de cellen bij ratten of andere dieren. Om te beginnen plaatst u geëuthanaseerde dieren op een gedesinfecteerd bord in een supinepositie. Met behulp van steriele schaar, maak een incisie ongeveer een centimeter in lengte op het proximale dijbeen om de huid te schillen.

Ontleed vervolgens de femurs en scheenbeen. Snijd voorzichtig en voorzichtig de bilaterale verbindingsdelen rond de heup-, knie- en enkelgewrichten om de scheenbeen en femurs te isoleren. Snijd een deel van de weefsels rond het bot, zorg ervoor dat grondig.

Plaats vervolgens de gereinigde botten in een schaal met vijf milliliter van compleet kweekmedium. Gebruik steriele schaar af te snijden van het lange bot. Gebruik een een milliliter spuitnaald om de mergholte zorgvuldig door te spoelen met 10 milliliter complete media totdat de mergholte wit wordt.

Breng deze celsuspensie over naar een buis van 50 milliliter en filter deze met een zeef van 70 micrometer om het resterende weefsel te verwijderen. Voeg vijf milliliter rode bloedlyse buffer, en incubeer de cellen op ijs gedurende acht minuten. Daarna, centrifugeren de cellen op 250 keer G gedurende vijf minuten om de cel pellet opleveren.

Aspirate de supernatant en resuspend de cellen in 10 milliliter van volledige media. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen en bereken de tijd die wordt besteed aan de acties die voor deze methode zijn ondernomen. Plaats eerst geëuthanaseerde dieren op een gedesinfecteerd bord in een supinepositie.

Met behulp van steriele schaar, maak een incisie ongeveer een centimeter in lengte op het proximale dijbeen om de huid te schillen. Ontleed vervolgens de femurs en scheenbeen. Snijd de delen van de weefsels rond het bot af, maar het is niet nodig om het weefsel volledig te verwijderen.

Spoel de scheenbeen en femurs met 12 milliliter PBS en snijd ze vervolgens doormidden. Plaats de geknipte scheenbeen en femurs in een voorbereide een milliliter pipettip en plaats dit in een bereide microcentrifugebuis. Centrifuge de buis drie keer op 1.000 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 45 seconden.

Verwijder hierna de pipettip met het bot uit de buis, waardoor het beenmerg in de buis achterblijft. Voeg 200 microliter PBS aan de buis toe en pipet herhaaldelijk op en neer om het merg grondig te desintegreren. Breng deze celsuspensie over naar een buis van 50 milliliter en filter deze met een zeef van 70 micrometer om de resterende weefsels te verwijderen.

Gebruik vervolgens een hemocytometer om de cellen te tellen en de tijd te berekenen die wordt besteed aan de stappen die in deze sectie zijn genomen. Voeg zes milliliter celscheidingsoplossing toe aan een steriele gesilificeerde centrifugaalbuis. Voeg de verdunde celsuspensie toe aan de buis.

Na toevoeging van de suspensie verschijnt er een duidelijke limiet tussen de cellaag en de scheidingsoplossing. Vervolgens, hechten een pipet tip aan het binnenoppervlak van de buis in een hoek van 45 graden. Centrifugeren de gelaagde oplossing in een horizontale centrifuge op 500 keer G gedurende 30 minuten.

Daarna de troebele tweede laag aanzuigen die de doelcellen van boven naar beneden bevat. Breng de doelcellen over naar een nieuwe buis. Voeg vijf milliliter PBS toe om de cellen te wassen en centrifuge vijf minuten op 250 keer G.

Herhaal dit wasproces door PBS en centrifuging toe te voegen voor een totaal van drie wasbeurten. Resuspend de cel pellet met beenmerg inductie medium. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.

Voeg vervolgens vijf tot acht milliliter beenmerginductiemedium toe om een definitieve celoplossing van 300.000 cellen per milliliter te verkrijgen. Voeg een milliliter van deze cel oplossing aan elke put van een 24 put plaat. Na het uitbroeden van de cellen op 37 graden Celsius gedurende 24 uur, zachtjes aspirate uit het medium en voeg een milliliter van osteoclast inductie medium aan elke put.

Roer de plaat voorzichtig en breng deze terug naar de couveuse. Elke 48 uur, verwijderen en vervangen 0,8 milliliter van osteoclast inductie medium van elke put. Roer de plaat voorzichtig voordat u deze terugplaatst naar de couveuse.

Om te beginnen met de voorbehandeling van de botplakken, gebruik een micro-elektrische zaag om de verse boviene femorale botschors te snijden in twee centimeter dikke plakjes langs de lengteas. Na het snijden en malen van de plakjes, was de plakjes door ze onder te dompelen in een beker van gedeïsiseerd water en ze te onderwerpen aan echografie op 100 hertz gedurende een uur. Herhaal dit wasproces drie keer.

Dompel de gewassen plakjes twee uur onder in 75%alcohol. Dan, aspirate uit de alcohol en bloot elke dia van plakjes aan ultraviolet licht voor een uur op een schoon platform. Om te beginnen toluidine blauwe vlekken, plaats de voorbehandelde bot plakjes in de putten van de 24 put plaat.

Voeg hierna cultuurmedium toe aan de 24 putplaat om de botschijfjes twee uur onder te dompelen. Plant en induceer de cellen zoals eerder aangetoond. Nadat osteoclasten zijn verschenen op vier tot zes dagen, was de plakjes met een milliliter van 0,25 molaire ammoniumhydroxide.

Sonicate de plakjes drie keer gedurende vijf minuten elk om de levende cellen te verwijderen en om voor de analyse van de resorptie putten op de bot plakjes mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de ammoniumhydroxide en bevlek de plakjes met een milliliter van 1%toluidine blauwe oplossing per schijf gedurende twee minuten. Was de vlekken plakjes met PBS.

Selecteer willekeurig vijf weergaven en gebruik een beeldanalysesoftware om een semi-kwantitatieve analyse van het resorptiegebied uit te voeren. Ten eerste, prefix de botplakken met een milliliter van 2,5%glutaraldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Soniceer de vooraf vastgestelde plakjes drie keer gedurende drie minuten elk met een molaire ammoniumhydroxide om de cellen te verwijderen.

Verwijder vervolgens de ammoniumhydroxide en was de botschijfjes drie keer met PBS, waarbij elke was 12 minuten duurt. Bevestig de gewassen botplakjes met 1%osmisch zuur gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Voer ethanolgradiënt uitdroging uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Vervang hierna de ethanol gedurende 15 minuten door isoamylacetaat. Bestrijk de plakjes met goudpalladium en analyseer ze door elektronenmicroscopie te scannen. In deze studie werden grote aantallen osteoclast precursoren geïsoleerd, gezuiverd en met succes geïnduceerd tot osteoclasten.

Door aan te vullen met M-CSF en RANKL, gigantische osteoclasten worden gezien op dag vijf tot zes. De vorming van deze osteoclasten wordt met succes geïdentificeerd door val vlekken. Grote en paarse cellen worden beschouwd als TRAP positieve cellen met meerdere kernen.

Door middel van deze methode, het is typisch voor het verkrijgen van 800 osteoclasten met maar liefst 30 kernen per osteoclast in een 24 goed plaat. In vergelijking met de traditionele methode bespaart deze verbeterde methode ongeveer 20 minuten tijdens het hele isolatieproces. Het gebruik van botsegmenten om de activiteit van botresorptie te beoordelen is een typische in vitro-methode.

Door toluidine blauwe vlekken wordt het resorptiegebied gevisualiseerd als lichtgroen. De structuur en kenmerken van de botputten kunnen duidelijk worden waargenomen door elektronenmicroscopie te scannen. CTR, een van de osteoclasten specifieke cel markers, is van cruciaal belang om osteoclasten te identificeren en de studie van de vorming van osteoclasten in het bot.

De positieve expressie van CTR identificeert osteoclasten duidelijk en onderscheidt ze van macrofaagpolylekaryons. CTR wordt duidelijk aangegeven in de immunofluorescentietesten door een groene kleur, terwijl het blauw de celkernen aangeeft. Zorg ervoor dat u de femurs en de scheenbeen niet breekt om te voorkomen dat beenmerg verloren gaat.

Een persoon die nog nooit heeft uitgevoerd deze techniek voor kan worstelen bij het helpen van de cellen operatie oplossing. De pipetpunt moet aan het binnenoppervlak van de buis worden vastgehouden en in een hoek van 45 graden naar het binnenoppervlak worden gehouden.