Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Deze methode maakt het mogelijk om protonentransportactiviteit van respiratoirenzymen zoals cytochrome BO3 te bestuderen in een natuurlijke lipide bi-layer omgeving. De belangrijkste voordelen van deze enzymtechniek is de mogelijkheid om enzymatische reacties op elk moment te starten en te stoppen met behulp van elektrochemie. Met behulp van een glasspuit transfer 200 microliters van chloroform voorraad van lipide polaire extract uit Escherichia coli in glazen flesjes te maken vijf milligram aliquots.

Voeg 50 microliter van een milligram per milliliter ubiquinone 10 toe aan de lipiden om de uiteindelijke verhouding van één tot 100 ubiquinone 10 tot lipiden te maken. Om het mengsel toe te voegen 20 microliters van een milligram per milliliter lange golf lengte fluorescerende kleurstof gelabeld lipide afgekort FDLL. Homogenize de chloroform oplossing door korte vortexing en verdampen het grootste deel van de chloroform onder een zachte stikstof of argon stroom.

Verwijder de chloroforme sporen volledig door verdere verdamping onder vacuüm gedurende ten minste een uur. Voeg 312,5 microliter van 40 millimolar MOPS pH 7.4 buffer toe aan een aliquot lipiden ubiquinone 10 FDLL droge mix. Meng de vortex til de lipide film is volledig opnieuw opgehangen, gevolgd door twee minuten van de behandeling in een ultrasoon bad.

Voeg vervolgens 125 microliter van 25 millimolar HPTS toe, een pH-gevoelige fluorescerende kleurstof die in de liposomen wordt ingekapseld. Voeg nu 137,5 microliter van 250 millimolar OGP oppervlakteactieve. Na het mengen met behulp van vortex, sonicate het mengsel in een ultrasoon waterbad gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen alle lipiden zijn oplosbaar in oppervlakteactieve micelles.

Breng vervolgens de dispersie over in een plastic buis van 1,5 milliliter. Voeg de benodigde hoeveelheid cytochrome BO3 toe en voeg ultra zuiver water toe om een totaal volume van 50 microliter te maken. Broed het reconstitutiemengsel gedurende 10 minuten op een rolmixer op vier graden Celsius.

Vervolgens wegen 50 milligram polystyreen microbeads in elk van de twee 1,5 milliliter buisdoppen. Weeg vervolgens 100 milligram polystyreenmicrobeads in nog eens twee 1,5 milliliter buisdoppen. Sluit de doppen met paraffinefolie om drogen te voorkomen.

Voeg de eerste 50 milligram polystyreen microbeads in het reconstitutiemengsel door de dop met polystyreenmicrobeads op de 1,5 milliliter plastic buis met de voorbereide dispersie. Voer vervolgens een korte draai voor een paar seconden om microbeads te brengen aan de onderkant van de buis. Broed de suspensie bij vier graden celsius op een rolmixer zodat de polystyreenmicrobeads de oppervlakteactieve stoffen gedurende 30 minuten kunnen absorberen.

Herhaal de toevoegingen van polystyreen microbeads en incubaties als volgt. Voeg 50 milligram microbeads toe gedurende 60 minuten incubatie. Voeg vervolgens 100 milligram microbeads toe gedurende 60 minuten incubatie.

En tot slot, voeg 100 milligram microbeads toe voor 120 minuten incubatie. Scheid de proteoliposome oplossing van de polystyreen microbeads met behulp van een micropipet met een dunne punt. Verdun de dispersie in 90 milliliter MOPS-buffer in TI 45 ultracentrifugebuis.

Ultracentrifuge de dispersie met behulp van een type 45 TI rotor op 125, 000 keer G gedurende een uur om de proteoliposomes pellet. Na ultracentrifugatie, gooi de supernatant en spoel de pellets met MOPS buffer zonder resuspending de pellet. Na het weggooien van de spoelbuffer, opnieuw op te schorten de proteoliposomen in 500 microliter van MOPS buffer door pipet het heen en weer met een dunne getipte micropipet alvorens de schorsing over te brengen naar een 1,5 milliliter plastic buis.

Na centrifugatie gedurende vijf minuten op 12.000 keer G om het puin te verwijderen, breng je het supernatant dat de gereconstitueerde proteoliposom is, over in een nieuw flesje. Lijm tot negen glazen deksel slips op een verdampt gouden oppervlak met behulp van bi-component lage fluorescentie epoxy. Genees de lijm vier uur op 80 graden Celsius.

Vlak voor modificatie met een zelfgemonteerde monolaag, maak je de glazen afdekkingsbonnen los van de siliconenwafels met een mes. Vanwege de dunheid van de afdekplaten, zorg bij het losmaken van de cover slips niet te kraken of breken de glazen platen. Dompel de vers losgemaakte goudgecoate deksel in een 6-marcaptohexanol-oplossing en laat 's nachts op 20 tot 25 graden celsius de zelf geassembleerde monolaag vormen.

De volgende dag, verwijder de goudgecoate deksel glijdt uit de oplossing en was kort met water of methanol en vervolgens met isopropanol. Droog de goudgecoate deksel glijdt onder een zachte gasstroom. Monteer de met goud gecoate afdekslip in een spectro-elektrochemische cel zoals in het tekstprotocol is weergegeven.

Maak contact met het goud met een platte draad buiten een gebied gedefinieerd door een rubberen O-ring en schroef de elektrochemische cel er stevig op. Voeg twee milliliter van de elektrolytbufferoplossing toe en plaats de referentie- en hulpelektroden in de cel. Ga verder met het controleren van de kwaliteit van de zelfgeassembleerde monolaag en voer lege plekken uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voeg proteoliposomen toe aan de elektrochemische cel met een concentratie van 0,5 milligram per milliliter en meng lichtjes met een pipet. Wacht 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur tot de absorptie van proteoliposomen op het elektrodeoppervlak is voltooid. Was de cel door de bufferoplossing minstens 10 keer te vervangen, maar vermijd het verlaten van het elektrodeoppervlak volledig droog.

Nu, uitvoeren elektrochemische impedantie spectroscopie op open cel potentieel om de zelf geassembleerde mono-laag op de gouden elektrode te bevestigen blijft ongewijzigd. Voer cyclische voltammogrammen uit met scansnelheden van 10 en 100 millivolt per seconde om catalatische ubiquinoloxidatie en zuurstofreductie door cytochrome BO3 bij het begin van elektrochemische quinonereductie waar te nemen. Wijzig de gouden elektrode als voorheen, maar met behulp van vijf microgram per milliliter proteoliposomen.

Voor enkel enzym studies verminderen de cytochrome BO3 tot lipide verhouding tussen 0,1 en 0,2%Plaats een druppel onderdompeling olie en vervolgens de elektrochemische cel op de 60 keer olie doelstelling van een omgekeerde fluorescentie microscoop. Met behulp van de juiste filters voor FDLL fluorescentie, focus op het elektrode oppervlak. Enkele liposomen moeten verschijnen als lichtpuntjes op de diffractielimiet van de microscoopdoelstelling.

Neem een beeld van FDLL florescentie. Schakel over naar een van HPTS-filtersets op de microscoop om te controleren of HTPS-florescentie duidelijk zichtbaar en te onderscheiden is vanaf de achtergrond. Verhoog de lichtintensiteit als dit niet het geval is.

Programmeer de microscoopsoftware om een getimede beeldverwerving uit te voeren door twee HTPS-filtersets af te wisselen. Stel hiervoor een belichting van één seconde in en navigeer vervolgens naar menutoepassingen. Definieer/voer ND-acquisitie uit en selecteer vervolgens twee HTPS-kanalen.

Stel de vertraging tussen afbeeldingsaanwinsten minimaal in. Gebruik in dit experiment 0,3 seconden vertraging en een totale duur van vijf minuten. Pas de instellingen van de potentiostat aan om het potentieel tijdens de afbeeldingsverwerving te wijzigen, zoals aangegeven in het tekstprotocol.

Voer nu tegelijkertijd de getimede beeldverwerving uit op de microscoop en de potentiële volgorde op de potentiostat door beide metingen tegelijkertijd handmatig te starten. Hier getoond zijn fluorescentie beelden van liposomen geabsorbeerd op de elektroden op drie verschillende dekkingen. De kleurstof met liposomen zijn zichtbaar op de beelden als lichtpuntjes.

Het centrale deel van het beeld werd foto-gebleekt om de achtergrond florescence niveau te onthullen. De beelden op twee HTPS-kanalen zijn super imposable wanneer de verhouding tussen de twee kanalen overeenkomt met een pH van 7,4 die in dit experiment wordt gebruikt. Een groter aantal liposomen zijn zichtbaar met het FDLL-kanaal, wat de aanwezigheid van liposomen aangeeft die geen HPTS hebben ingekapseld.

Het verschil tussen de HPTS en FDLL kanalen is meer uitgesproken bij hogere dekkingen. Mogelijk omdat bij hoge liposoom dekking, liposomen hebben meer kans om te barsten of zekering op het oppervlak. Hier wordt de verandering van een liposoom florescence op twee HTPS-kanalen weergegeven als een 3D-oppervlakperceel van het overeenkomstige gebied gedurende 300 seconden van het experiment.

Het reductieve potentieel werd toegepast tussen 60 seconden en 180 seconden. De overeenkomstige plot van de volumemetrische intensiteitsverhouding van twee HPTS-kanalen ten opzichte van de tijd wordt weergegeven. Hier worden de medianen van alle vesicle pH-veranderingen binnen een enkele afbeelding weergegeven wanneer cytochrome BO3-inhoud 1,3% is Een toename van de pH is duidelijk zichtbaar wanneer een potentieel tussen 0,1 en 0,3 volt wordt toegepast.

Wanneer cytochrome BO3-inhoud een veel lagere waarde van 0,1% is, worden de mediane curven bijna niet te onderscheiden van die van lege liposomen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de oppervlakteactieve stoffen volledig uit de liposoomsmeden worden verwijderd, omdat de resten de doorlaatbaarheid van de liposomen tot protonen kunnen verhogen. Deze methoden stellen ons in staat om specifieke vragen te stellen over het natuurlijke lipofiele quinone substraat in tegenstelling tot de vaak gebruikte in water oplosbare quinone analogen.

Verder identificeerden de enkelvoudige enzymexperimenten een voorheen onbekende lektoestand waarbij het eiwit fungeert als een protonkanaal waar protonen vrij naar achteren stromen.