Lucifer geel-een robuuste Paracellulaire permeabiliteit marker in een Celmodel van de menselijke bloed-hersen barrière

Dit protocol is een robuuste techniek om de functionele integriteit van intercellulaire strakke knooppunten te bepalen in een celmodel van de menselijke bloed-hersenbarrière. Dit is een eenvoudig en vrij goedkoop protocol dat het mogelijk maakt de schijnbare doorlaatbaarheid in een kortere periode in plaats van het uitvoeren van een langere kinetische test. Deze methode kan ook worden gebruikt om de functionele integriteit van strakke knooppunten in de hersenen endotheelcellen doorfecteren met polymeer DNA nanodeeltjes te bepalen.

Om te beginnen cel beplating, plaats weefsel cultuur inserts met microporeuze membranen in een 24-well cultuurplaat. Voeg 400 microliter van 0,15 milligram-per-milliliter collageen type een in elke weefselcultuur insert. Dan incubeer voor een uur in een 37 graden Celsius, 5%kooldioxide incubator.

Rock de 24-well plaat voorzichtig om zelfs verspreiding van de collageenoplossing over het microporeuze membraan in de weefselkweek inserts mogelijk te maken. Verwijder na een uur de collageenoplossing en was het microporeuze membraan voorzichtig met 0,4 milliliter 1X PBS-buffer. Nu, plaat hCMEC/D3 cellen met een dichtheid van 50.000 cellen per vierkante centimeter in de cel inserts.

Plaats de 24-well plaat met weefselcultuur setup in de incubator om celbevestiging en proliferatie mogelijk te maken. Broed de plaat zeven dagen in om de cellen 100% samenvloeiing te laten bereiken. Verwijder het groeimedium om de andere dag en breng 0,5 milliliter voorverwarmde verse media over in de weefselkweekinserts.

Herhaal de beplatingsprocedure voor westerse blotting om veranderingen in ZO-1-expressie voor DNA-nanodeeltjestransfectie te bepalen, en voor de ATP-test om de levensvatbaarheid van cellen in transfected cellen te bepalen. Voor het bepalen van Lucifer Geel zichtbare doorlaatbaarheid, op elke dag na het zaaien, verwijder het groeimedium en voeg 1,5 milliliter voorverwarmde transportbuffer toe aan de basolaterale kant van de put. Voeg nu 58,3 microliter van 20-micromolar Lucifer Yellow oplossing toe aan de apicale kant van elke trans-well insert.

Bespaar 50 microliter van de oplossing voor fluorescentiemetingen. Na het volledig verwijderen van de resterende PBS-buffer van de apicale kant, voeg Lucifer Gele oplossing zo snel mogelijk om te voorkomen dat het drogen van de cellen. Zorg voor nauwkeurige volumes van Lucifer Yellow oplossing in de apicale kant.

Zorg ervoor dat u hetzelfde en nauwkeurige volume van Lucifer Yellow-oplossing in alle wisselplaten toevoegt. Werk snel om te voorkomen dat de cellen drogen. Incubeer de cellen in een roterende plaatshaker bij 100 RPM en 37 graden Celsius gedurende 60 minuten.

Verwijder vervolgens 30 microliter van het Lucifer Geel monster uit elk apical compartiment. Breng de 20-micromolar Lucifer Yellow oplossing en de apicale side samples over op voorgelabelde buizen. Verdun het monster nu vertienvoudigd met behulp van transportbuffer.

Verwijder 500 microliter uit elk basolateraal compartiment en breng het monster over naar vooraf gelabelde buizen. Bereid een reeks Lucifer Gele normen voor de standaardcurve voor. Voeg 100 microliter van elk standaard apicale en basolaterale monster toe aan elke put van een zwarte 96-put plaat in tweevoud.

Gebruik een fluorescentiemicroplatelezer om de Lucifer Gele fluorescentieintensiteit te meten en de schijnbare doorlaatbaarheid te berekenen, zoals beschreven in de manuscripttekst. Het effect van de culturingtijd op Lucifer Gele doorlaatbaarheid werd gebruikt om de schijnbare kinetiek van strakke verbindingsvorming te bepalen. De schijnbare doorlaatbaarheid waarden aanzienlijk gedaald op dag zeven in vergelijking met dag een, wat suggereert dat de barrière werd strakker.

De schijnbare doorlaatbaarheidswaarden stabiliseerden zich vervolgens tot dag 10. Dit impliceerde de barrièrevorming volledig en functioneel was, resulterend in verminderd Lucifer Geel paracellulair vervoer. Westerse blotting werd gebruikt om veranderingen in de expressie van het strakke verbindingseiwit ZO-1 in de loop van de tijd te detecteren.

De twee bands vertegenwoordigen de twee ZO-1 isoforms. Densitometrie analyse bleek dat de pixelwaarde van ZO-1 steeg van dag drie tot en met zeven na het zaaien, wat suggereert dat de strakke kruising eiwit ZO-1 voortdurend gevormd van dag drie tot zeven. Na de behandeling met calcium op dag zeven na het zaaien was de band van ZO-1 bijna niet op te sporen, wat aangeeft dat ZO-1 zich niet kon vormen bij afwezigheid van calciumionen.

Zoals blijkt uit de resultaten, kan westerse blotting van ZO-1 eiwit worden uitgevoerd om veranderingen in het expressieniveau van strakke verbinding eiwitten te bepalen, als aanvulling op de Lucifer Yellow-based functionele activiteit gegevens. We ontdekten ook dat de functionele activiteit van strakke verbindingen in menselijke hersenen endotheelcellen niet werd beïnvloed door DNA nanodeeltjes transfectie.