In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen

Plasmacellen zijn zeldzame cellen met 30 differentiatiestadia die plaatsvinden in anatomische locaties die de volledige biologische karakterisering schaden, met name bij de mens. Ons in vitro B2 plasmaceldifferentiatiemodel reproduceert de sequentiële celdifferentiatie en rijping die in de verschillende organen in vivo voorkomen. Dit in vitro model recapituleert de gecoördineerde transcriptieveranderingen en het fenotype van de verschillende B2 plasmacelstadia die in vivo kunnen worden gedetecteerd.

We bouwden ook een open-access bio-informatica tools om de meest prominente informatie uit exploratie gegevens met betrekking tot plasmacel differentiatie te analyseren. Het aantonen van de procedure zal Hugues de Boussac, een postdoc uit mijn laboratorium. Om te beginnen, het verkrijgen van perifere bloedcellen van gezonde vrijwilligers voor geheugen B celzuivering.

Verdun 7,5 milliliter bloed met 24,5 milliliter RPMI 1640 medium. Voeg vervolgens 12,5 milliliter ruimtetemperatuurdichtheidsgradiënt toe aan een steriele conische buis van 50 milliliter. Voorzichtig overlay de dichtheid gradiënt met de 32 milliliter verdund bloed, zorg ervoor dat het mengen van de twee fasen te minimaliseren.

Centrifuge gedurende 20 minuten bij 500 keer zwaartekracht met de rem uit. Verzamel de perifere bloedmononucleaire cellen uit de verdunde plasma- en dichtheidsgradiëntinterface. Breng de cellen naar een steriele buis van 50 milliliter en vul de buis tot 45 milliliter met Hank's Balanced Salt Solution.

Centrifuge op 500 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en houd de pellet. Voeg vervolgens 45 milliliter RPMI 1640 medium toe, aangevuld met 10%FCS.

Centrifuge op 500 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en houd de pellet. Voeg 30 milliliter PBS toe, aangevuld met 2%FCS.

Gebruik anti-cd magnetische kralen om CD2-positieve cellen te verwijderen door vier kralen toe te voegen voor één doelcel. Incubeer op vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Met behulp van een magneet voor celscheidingtoepassing, scheidt u de kraalgebonden cellen van de niet-gebonden cellen.

Verzamel de niet-gebonden cellen en incubbateren ze met anti-CD19 APC en anti-CD27 PE antilichamen gedurende vijftien minuten op vier graden Celsius. Was de cellen twee maal in PBS met 10% geitenserum. Gebruik vervolgens de celsorteerder om de geheugen-B-cellen te zuiveren tot een zuiverheid van 95%.

Voeg hierna oplosbare CD40 ligand en anti-polyhistidine monoklonale antilichaam toe voor geheugen B-celactivering. Plaat de gezuiverde geheugen B cellen in zes-goed cultuur platen voor vier dagen met interleukine-2, interleukine-10 en interleukine-15. Voor genexpressieprofilering gebruikt u een celsorteerder om de CD38-negatieve CD20-negatieve preplasmablasten op dag vier te zuiveren.

Op dag vier, tel de cellen en plaat ze in 12-well cultuur platen op een celdichtheid van 250,000 cellen per milliliter door het toevoegen van twee milliliter van cel suspensie in elke put. Om differentiatie te induceren, verwijder je de CPG oligonucleotiden en oplosbare CD40 ligand en voeg je nieuw kweekmedium toe met een nieuwe cytokinecocktail met interleukine-2, interleukine-6, interleukine-10 en interleukine-15. Kweek de cellen drie dagen bij 37 graden Celsius.

Voor genexpressieprofilering gebruikt u een celsorteerder om de CD38-positieve, CD20-negatieve plasmablasten op dag zeven te zuiveren. Tel op dag zeven de cellen. Plaat de cellen in 12-well cultuur platen op een celdichtheid van 500,000 cellen per put, door het toevoegen van twee milliliter van cel suspensie aan elke put.

Onderscheid de plasmablasten in vroege plasmacellen met behulp van vers kweekmedium met interleukine-6, interleukine-15 en interferon-alpha gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius. Voor genexpressieprofilering gebruikt u een celsorteerder om de CD20-negatieve, CD38-positieve, CD138-positieve vroege plasmacellen op dag 10 te zuiveren. Ten eerste, cultuur stromal cellen voor vijf dagen met cultuur medium.

Gebruik een 0,2-microliter filter om de stromale cel cultuur supernatant filter om stromal cel geconditioneerd medium te verkrijgen en bevriezen tot klaar voor gebruik. Vervolgens kweek je de vroege plasmacellen in 12-put kweekplaten, met behulp van het eerder verkregen stromalcellilmamedium met interleukine-6 en APRIL bij een celdichtheid van 500,000 cellen per put, door twee milliliter celsuspensie toe te voegen aan elke put. Incubeer bij 37 graden Celsius, het vernieuwen van de stromale cel geconditioneerd medium elke week.

Meet vervolgens de immunoglobulineafscheiding uit door stroom cytometrie gesorteerde plasmacellen. Kweek de plasmacellen met een dichtheid van één miljoen cellen per milliliter gedurende 24 uur en oogst de cultuur supernatant. Met behulp van een ELISA kit, meet de immunoglobuline G, en immunoglobuline A.First, start de GenomicScape open access bioinformatica web tool.

Selecteer in het menu browsegegevens de gegevensset met de naam menselijke B-cellen naar plasmacellen. Visualisatie van het genexpressieprofiel van een uniek gen of lijst van genen is beschikbaar met behulp van de tool Expression/Coexpression Report in de Analysis Tools. Selecteer vervolgens WebSAM Analysis Tools om het SAM-gereedschap te laden.

Kies de gegevensset van menselijke B-cellen tot plasmacellen en selecteer de groep monsters die u wilt vergelijken. Gebruik de verschillende beschikbare filters om de filteropties van belang toe te passen. Als u genexpressieprofielen wilt vergelijken met het SAM-gereedschap, wijzigt u de filteropties, waaronder vouwwijziging, aantal permutaties, de false discovery rate en het type vergelijking.

De software zal de analyse berekenen en genen differentieel tussen de geselecteerde groepen verstrekken. In deze studie worden de expressieveranderingen van de epigenetische factoren in normale plasmaceldifferentiatie onderzocht. Met behulp van multi-class SAM-analyse worden 71 genen significant verschillend uitgedrukt tussen de geheugen-B-cellen, de preplasmablasten, de plasmablasten, de vroege plasmacellen en de beenmergplasmacellen met een vals detectiepercentage van minder dan 5%De celfase van het geheugen B wordt gekenmerkt door de overbelasting van 23 epigenetische spelersgenen, waaronder 39,13% van de histonacetransferases, 30,43% van histone-methylases , 21,74% van histone demethylasen, 4,35% van de methylbindende eiwitten en 4,35% van histone deacetylasen.

14 epigenetische spelersgenen worden aanzienlijk overuitgedrukt in het preplasmablast-stadium, waaronder 50% van histone methyltransferasen, 14,28% van de DNA-methyleften, 21,43% van de histonige deacetylasen, 7,14% van histone demethylases en 17,14% van zijn acetontyltransferases. Na deze procedure kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd om wijzigingen in de chromatinestructuur en architectuur tijdens deze B2-plasmaceldifferentiatie te identificeren en te begrijpen. Dit in vitro differentiatiemodel zal het mogelijk maken om voldoende cellen te genereren om deze moleculaire analyse te voltooien om zowel de paden die betrokken zijn bij deze hele modellering als hun downstream transcriptie-impact tijdens B2-plasmaceldifferentiatie te onthullen.

Deze kennis die uit dit onderzoek wordt afgeleid, kan informeren en instrueren over diagnostische en therapeutische strategieën voor plasmacelaandoeningen, zoals in het geval van multipel myeloom, een kanker zonder definitieve genezing, waarvoor een betere prognose en verbeterde therapeutische strategieën kritisch nodig zijn. Het karakteriseren en begrijpen van de epigenetische remodellerende structurele en architecturale veranderingen die chromatine beïnvloeden tijdens B2 plasmaceldifferentiatie zal van bijzonder belang zijn. Dit kan worden gedaan met behulp van gen sequencing, ERRBS, ATAC sequencing, IC, en RNA sequencing.

Een matige heterogeniteit kan worden waargenomen in het percentage geactiveerde B-cellen, preplasmablasten, plasmablasten en plasmacellen, afhankelijk van het bloed van gezonde donoren, dat wordt gebruikt voor geheugen B-celzuivering.