Name: In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Verken een in vitro differentiatiemodel voor B-geheugencellen naar plasmacellen met bio-informatica-analyse. Deze methode reproduceert sequentiële differentiatiestadia en transcriptieveranderingen voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Franse INCA (Institut National du Cancer) Instituut (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) en ITMO kanker (MM & TT).

Het protocol volgt de richtsnoeren overeenkomstig de verklaring van Helsinki en de overeenkomst van de Montpellier Universiteit ziekenhuis centrum voor biologische hulpbronnen.
1. in Vitro normaal Plasma cel differentiatie Model
Opmerking: PC's worden gegenereerd door middel van een vier-stappen cultuur11,12,13.
<ol><li>
Versterking van de b-cel en differentiatie
	<ol>
<li>Perifere bloedcellen van gezonde vrijwilligers voor geheugen zuivering van de B-cel gebruiken</li>
		<li>Verdun 7,5 mL bloed met 24,5 mL van RPMI 1640 medium.</li>
		<li>12,5 mL van kamertemperatuur dichtheid verloop (bijvoorbeeld densiteitgradiënt) toevoegen aan een steriele 50 mL conische buis. Zachtjes bedekken het verloop van de dichtheid met de 32 mL verdunde bloed. Minimaliseer het mengen van de twee fasen.</li>
		<li>Centrifugeer 20 min op 500 x g met de rem af. De PBMCs te verzamelen vanuit de kleurovergang verdunde plasma/dichtheid-interface en de cellen in een steriele 50 mL-buis te plaatsen en een volledige tot 45 mL met Henks evenwichtige zoutoplossing.</li>
		<li>De cellen gedurende 5 minuten bij 500 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant voorzichtig en houden de pellet.</li>
		<li>45 mL RPMI1640/10% foetaal kalfsserum (FCS) en centrifuge 5 min op 500 x gtoevoegen. Verwijder het supernatant voorzichtig en houden de pellet. Voeg 30 mL PBS/2% FCS.</li>
		<li>
Het verwijderen van CD2 + cellen met behulp van anti-CD2 magnetische kralen. 4 kralen voor een doelcel toevoegen. Incubeer 30 min bij 4 ° C.
		<ol>
<li>Afzonderlijke cellen van de kraal-gebonden uit niet-afhankelijke cellen met behulp van een magneet voor cel scheiding toepassing. Verzamelen van niet-afhankelijke cellen en de cel pellet met anti CD19 APC en anti-CD27 PE antilichamen Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C (2 µL van antilichamen tegen 106 cellen).</li>
			<li>Wassen tweemaal in PBS/10% geit serum.</li>
			<li>Verwijderen van contaminerende gebeurtenissen op zowel FSC als SSC percelen. Plot onderhemden op FSC-A vs FSC-H en WS-A vs DIE SSC-H percelen te verwijderen van puin en schakel de leukocyten van de totale bevolking. Selecteer geheugencellen B op CD19/CD27 en CD19+CD27+.</li>
			<li>Zuiveren MBCs sorteerder van een cel met een zuiverheid van 95%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voer alle stappen van de cultuur met behulp van IMDM en 10% FCS, aangevuld met 50 mg/mL menselijke transferrine en 5 mg/mL menselijke insuline.</li>
		<li>
Plaat gezuiverd MBCs in zes-well cultuur platen (1,5 x 105 MBCs/mL in 5 mL/putje), voor 4 dagen, met IL-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), en IL-15 (10 ng/mL).
		<ol>
<li>Toevoegen van Phosphorothioate apr ODN 2006, histidine-gelabelde recombinante menselijke oplosbare CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) en anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) voor MBCs activering (Figuur 1). Activering door sCD40L of ODN alleen met de dezelfde cytokine cocktail levert aan lagere amplificatie12. De combinatie van activering signalen beschreven hier gelode aan het maximale aantal geactiveerd B-cellen en PrePBs11,12 (Figuur 1).</li>
			<li>Voor gen expressie profilering, zuiveren CD38-/CD20- PrePBs, op dag 4, met behulp van een cel sorter (Figuur 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmablastic cel generatie
	<ol>
<li>Op dag 4, door de cellen te tellen.</li>
		<li>De cellen van de plaat in 12-well cultuur platen op 2.5 x 105/mL in 2 mL/putje.</li>
		<li>Induceren van differentiatie door verwijdering van CpG oligonucleotides en sCD40L en de toevoeging van een nieuwe kweekmedium met een nieuwe cytokine cocktail met inbegrip van IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) en IL-15 (10 ng/mL) (Figuur 1). Cultuur cellen voor 3 dagen (van dag 4 tot dag 7) bij 37 ° C.</li>
		<li>Voor gen expressie profilering, zuiveren CD38+/CD20- PBs, op dag 7, met behulp van een cel sorter (Figuur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vroege plasma cel generatie
	<ol>
<li>Op dag 7, door de cellen te tellen.</li>
		<li>Plaat van de cellen in 12-well cultuur platen op 5 x 10,5/mL in 2 mL/goed.</li>
		<li>Onderscheiden van PB in vroege PC's verse kweekmedium met IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) en IFN-α (500 U/mL) voor 3 dagen bij 37 ° C. Voor gen expressie profilering, zuiveren CD20-/CD38+/CD138+ vroege PC's, op dag 10, met behulp van een cel sorter (Figuur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Langlevende plasma cel generatie
	<ol>
<li>Differentiëren vroege PCs in lang leefde PC's door het veranderen van de cultuuromstandigheden.</li>
		<li>Cultuur van de cellen in 12-well cultuur platen op 5 x 10,5/mL in 2 mL/goed of in 24-well cultuur platen in 1 mL/goed bij 37 ° C, met behulp van IL-6 en stromale cellen geconditioneerd medium en APRIL (200 ng/mL).</li>
		<li>Verkrijgen stromale cel-geconditioneerd medium door het kweken van stromale cellen voor 5 dagen met kweekmedium. Filter de stromale celcultuur supernatant (0,2 µm) en bevriezen.</li>
		<li>Elke week 50% van stromale cel-geconditioneerd media aan PC culturen met vernieuwing toevoegen. Gegenereerde langlevende PCs kunnen worden gehandhaafd voor maanden13. Overleving op lange termijn van PC's zouden kunnen worden verkregen met IL-6 en APRIL alleen als gerapporteerde13.</li>
		<li>Maatregel Ig secretie van stroom cytometry gesorteerd op PC's.</li>
		<li>PC's op 106 cellen/mL gedurende 24 uur cultuur en oogst supernatant van cultuur. IgG- en IgA met behulp van menselijke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits11,12,13te meten. De mediane IgG secretie varieerden van 10 pg/cel/dag op dag 10 tot en met 17 pg/cel/dag op dag 6013.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. moleculaire Atlas van B naar PC differentiatie
Opmerking: We bouwden een handige en open toegang bioinformatica tools om te halen en visualiseren van de meest prominente informatie uit Affymetrix GEP gegevens met betrekking tot PC differentiatie (GenomicScape)15. GEP zijn openbaar uit ArrayExpress database (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), met inbegrip van gezuiverde MBCs, PrePBs, PBs en Spoon: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 en E-MEXP-3034 en BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape is een vrij beschikbare webtool.
<ol><li>
Selectie van B naar PC dataset
	<ol>
<li>B Selecteer bij PC dataset in het menu Bladeren Data in GenomicScape open toegang bioinformatic tool (http://www.genomicscape.com) genaamd menselijke B cellen tot plasmacellen. Visualisatie van genexpressie profiel van unieke gen of een lijst met genen is beschikbaar met behulp van de Expressie-Coexpression rapportage in de Analysetools beschikbaar in de home page.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gecontroleerde analyse en voornaamste componenten analyse (PCA)
	<ol>
<li>Selecteer analysehulpmiddelen | webSAM voor het laden van de SAM tool.</li>
		<li>Kies de menselijke B cellen tot plasmacellen dataset en Selekteer de groepen van monsters om te vergelijken.</li>
		<li>Gebruik de verschillende filters die beschikbaar zijn om toe te passen van de filteropties van belang.</li>
		<li>Om te vergelijken gene expressieprofielen met SAM tool, wijzigen de filtering opties met inbegrip van Fold wijzigen, aantal PERMUTATIES, valse ontdekking tarief en het type vergelijking. GenomicScape zal berekenen de analyse en genen differentially uitgedrukte tussen de geselecteerde groepen.</li>
		<li>Belangrijkste componenten analyse uitgevoerd door Hoofdcomponentenanalyse in Analysis Tools menu te selecteren.</li>
		<li>Kies de menselijke B cellen tot plasmacellen dataset en Selekteer de groepen van belang.</li>
		<li>Een lijst van genen van belang of selecteer genen volgens de variantie plakken. Een lijst van genen plakken, selecteert u te analyseren van een lijst van genen/ncRNAs, klik hier... Genomicscape zal berekenen partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst die kon worden gevisualiseerd en gedownload.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
<li>Minnich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+the+transcription+factor+Blimp-1+in+coordinating+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation.</a> Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).</li>
<li>Klein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+IRF4+controls+plasma+cell+differentiation+and+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination.</a> Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).</li>
<li>Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressed-out+B+cells%3F+Plasma-cell+differentiation+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response.</a> Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).</li>
<li>Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+plasma+cells+is+regulated+by+crosstalk+between+endoplasmic+reticulum+stress+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling.</a> European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
<li>Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genetics+of+epigenetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer genetics of epigenetic genes.</a> Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+MMSET+regulates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination.</a> Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).</li>
<li>Le Gallou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2+requirement+for+human+plasma+cell+generation%3A+coupling+differentiation+and+proliferation+by+enhancing+MAPK-ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling.</a> Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).</li>
<li>Cocco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+long-lived+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of long-lived human plasma cells.</a> Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).</li>
<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
<li>Orlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteasome+inhibitors+cannot+ERADicate+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).</li>
<li>Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+and+CD40L+synergistically+promote+plasma+cell+differentiation+through+upregulation+of+Blimp-1+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells.</a> Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+promotes+immunoglobulin+production+during+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+and+galectin-8+have+redundant+roles+in+promoting+plasma+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation.</a> Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).</li>
<li>Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+1+modulates+plasma+cell+homeostasis+and+regulates+the+humoral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response.</a> Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+is+critical+for+plasmablast+survival+in+the+bone+marrow+and+poorly+expressed+by+early-life+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells.</a> Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).</li>
<li>Huard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+secreted+by+neutrophils+binds+to+heparan+sulfate+proteoglycans+to+create+plasma+cell+niches+in+human+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).</li>
<li>Ame-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+bone+marrow+and+lymphoid+organs+support+tumor+B-cell+growth%3A+role+of+stromal+cells+in+follicular+lymphoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis.</a> Blood. 109 (2), 693-702 (2007).</li>
<li>Ramachandrareddy, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL6+promoter+interacts+with+far+upstream+sequences+with+greatly+enhanced+activating+histone+modifications+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).</li>
<li>Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+BCL6-interacting+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).</li>
<li>McManus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax5+regulates+its+target+genes+by+recruiting+chromatin-modifying+proteins+in+committed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells.</a> The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).</li>
<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
<li>Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+in+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies.</a> Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
<li>Asangani, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+EZH2-MMSET+histone+methyltransferase+regulatory+axis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer.</a> Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT2+inhibitor+BIX-01294+induces+apoptosis+through+PMAIP1-USP9X-MCL1+axis+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells.</a> Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).</li>
<li>Santo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+activity%2C+pharmacodynamic%2C+and+pharmacokinetic+properties+of+a+selective+HDAC6+inhibitor%2C+ACY-1215%2C+in+combination+with+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma.</a> Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).</li>
<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

In de mens zijn PC zeldzame cellen met differentiatie etappes plaatsvinden in anatomische plaatsen die volledige biologische karakterisering in de weg staan. We hebben ontwikkeld, een in vitro B PC differentiatie model met behulp van scriptingregel cultuur systemen waar verschillende combinaties van moleculen van activering en cytokines worden vervolgens toegepast om te reproduceren de sequentiële celdifferentiatie optreedt de verschillende organen/weefsels in vivo11,1...

De differentiatie van B-cellen tot plasmacellen (PCs) is essentieel voor de Humorale immuniteit en beschermen van de host tegen infecties1. B bij PC differentiatie wordt geassocieerd met grote veranderingen in de transcriptie capaciteit en metabolisme geschikt voor tot antilichaam secretie. De transcriptiefactoren waarmee B naar PC differentiatie zijn uitvoerig bestudeerd en geopenbaarde exclusieve netwerken met inbegrip van B - en PC-specifieke transcriptie factoren (TFs)2. In de B-cellen zijn PAX5, BCL6 en BACH2 TFs de hoeders van de B-cel identiteit2,3. Inductie van IRF4, PRDM1 BLIMP1 en XBP1 PC TF-codering zal uitdoven van B-cel genen en veroorzaken een gecoördineerde antilichaam-afscheidende cellen transcriptionele programma3,4,5. Deze gecoördineerde transcriptionele veranderingen worden geassocieerd met de activering van de transcriptie van Ig genen samen met een verschuiving van de membraan-gebonden vorm naar de secreted vorm van de immunoglobuline zware ketting2,3, 4. B bij de differentiatie van de PC is verbonden met inductie van genen betrokken bij endoplasmatisch reticulum en Golgi-apparaat functioneert gelijktijdige met ongevouwen eiwitten reactie (UPR) activering bekend dat spelen een sleutelrol in de PC door tegemoet te komen aan de synthese van uitgescheiden immunoglobulinen6,7. De TF-XBP1 speelt een belangrijke rol in deze cellulaire aanpassing8,9,10.
B-cellen en PC's zijn de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit. Inzicht in de biologische processen die controle de productie en het voortbestaan van normale plasmacellen is cruciaal in therapeutische interventies die moeten zorgen voor efficiënte immuunrespons en autoimmuniteit of immuun-deficiëntie te voorkomen. PC zijn zeldzame cellen met vroege stadia van de differentiatie plaatsvindt in anatomische locaties die volledige biologische karakterisering, met name in de mens belemmeren. Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, hebben we een in vitro B gemeld aan PC differentiatie model. Dit model reproduceert de sequentiële celdifferentiatie en rijping die zich voordoen in de verschillende organen in vivo11,12,13. In een eerste stap, geheugencellen B zijn voor het eerst activeerde voor vier dagen door de combinatie van interactie CD40-ligand, oligodeoxynucleotides en cytokine en onderscheid maken in preplasmablasts (PrePBs). In een tweede stap, preplasmablasts om te differentiëren in plasmablasts (PBs) veroorzaakt door het verwijderen van CD40L en oligodeoxynucleotides stimulatie en de combinatie van cytokine te wijzigen. In een derde stap, worden plasmablasts veroorzaakt om te differentiëren in vroege PC's door het veranderen van de cytokine combinatie11,12. Een vierde stap werd geïntroduceerd om volledig volwassen PC's door het kweken van deze vroege PC's met beenmerg stromale cellen geconditioneerd medium of geselecteerde groeifactoren13. Deze volwassen PC's kunnen enkele maanden in vitro overleven en afscheiden van hoge bedragen van immunoglobuline (Figuur 1). Interessant is dat recapituleert ons in vitro model de gecoördineerde transcriptionele veranderingen en het fenotype van de verschillende stadia van de PC die gevonden in vivo11,12,13,14 worden kan B ,15. PC's zijn zeldzame cellen en onze in-vitro differentiatie-model maakt het mogelijk om de studie van de menselijke B naar PC differentiatie.

<table><tbody><tr><td>anti-CD2 magnetische kralen</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PB</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-PE</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histidine</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)</td><td>Sigma</td><td></td><td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T</td></tr><tr><td>human Transferin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human CD40L-hi</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human APRIL</td><td>R&amp;D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-10</td><td>R&amp;D Systems</td><td>217-IL-</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2 Protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro differentiatie model van menselijke normale b geheugencellen te langlevende plasmacellen

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Plasmacellen (PCs) grote hoeveelheid antilichamen afscheiden en ontwikkelen van B-cellen die zijn geactiveerd. PC's zijn van zeldzame cellen zich in het beenmerg of de mucosa en zorgen Humorale immuniteit. Vanwege hun lage frequentie en de locatie, de studie van PC's is moeilijk in de mens. We gemeld een B naar PC in-vitro differentiatie model met behulp van geselecteerde combinaties van cytokinen en activering moleculen die toestaan om te reproduceren de sequentiële celdifferentiatie optreedt in vivo. In deze in vitro model geheugen B cellen (MBCs) zal onderscheiden in pre plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), vroeg PC's en ten slotte in langlevende Kortbij PC's, met een fenotype hun tegenhangers in gezonde individuen. Ook bouwden we een open toegang bioinformatica tools voor het analyseren van de meest prominente informatie van GEP gegevens met betrekking tot differentiatie van de PC. Deze middelen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de menselijke B PC differentiatie en in de huidige studie, we onderzocht de expressie genregulatie epigenetische factoren tijdens menselijke B naar PC differentiatie.

De algemene procedure voor in-vitro differentiatie voor normale PC wordt afgebeeld in Figuur 1. Met behulp van het protocol hier gepresenteerd, kunnen wij voldoende hoeveelheid cellen die niet kon worden verkregen met ex vivo menselijke specimens genereren. Hoewel de rol van het complexe netwerk van transcriptiefactoren die betrokken zijn bij PC differentiatie heeft onderzocht, blijven de mechanismen tot regeling van de belangrijkste PC differentiatie transcr...

Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, wij brengen verslag een in vitro B-cel plasma cel differentiatie model.

In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Plasmacellen zijn zeldzame cellen met 30 differentiatiestadia die plaatsvinden in anatomische locaties die de volledige biologische karakterisering schaden, met name bij de mens. Ons in vitro B2 plasmaceldifferentiatiemodel reproduceert de sequentiële celdifferentiatie en rijping die in de verschillende organen in vivo voorkomen. Dit in vitro model recapituleert de gecoördineerde transcriptieveranderingen en het fenotype van de verschillende B2 plasmacelstadia die in vivo kunnen worden gedetecteerd.We bouwden ook een open-access bio-informatica tools om de meest prominente informatie uit exploratie gegevens met betrekking tot plasmacel differentiatie te analyseren. Het aantonen van de procedure zal Hugues de Boussac, een postdoc uit mijn laboratorium. Om te beginnen, het verkrijgen van perifere bloedcellen van gezonde vrijwilligers voor geheugen B celzuivering.Verdun 7,5 milliliter bloed met 24,5 milliliter RPMI 1640 medium. Voeg vervolgens 12,5 milliliter ruimtetemperatuurdichtheidsgradiënt toe aan een steriele conische buis van 50 milliliter. Voorzichtig overlay de dichtheid gradiënt met de 32 milliliter verdund bloed, zorg ervoor dat het mengen van de twee fasen te minimaliseren.Centrifuge gedurende 20 minuten bij 500 keer zwaartekracht met de rem uit. Verzamel de perifere bloedmononucleaire cellen uit de verdunde plasma- en dichtheidsgradiëntinterface. Breng de cellen naar een steriele buis van 50 milliliter en vul de buis tot 45 milliliter met Hank's Balanced Salt Solution.Centrifuge op 500 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en houd de pellet. Voeg vervolgens 45 milliliter RPMI 1640 medium toe, aangevuld met 10%FCS.Centrifuge op 500 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en houd de pellet. Voeg 30 milliliter PBS toe, aangevuld met 2%FCS.Gebruik anti-cd magnetische kralen om CD2-positieve cellen te verwijderen door vier kralen toe te voegen voor één doelcel. Incubeer op vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Met behulp van een magneet voor celscheidingtoepassing, scheidt u de kraalgebonden cellen van de niet-gebonden cellen.Verzamel de niet-gebonden cellen en incubbateren ze met anti-CD19 APC en anti-CD27 PE antilichamen gedurende vijftien minuten op vier graden Celsius. Was de cellen twee maal in PBS met 10% geitenserum. Gebruik vervolgens de celsorteerder om de geheugen-B-cellen te zuiveren tot een zuiverheid van 95%.Voeg hierna oplosbare CD40 ligand en anti-polyhistidine monoklonale antilichaam toe voor geheugen B-celactivering. Plaat de gezuiverde geheugen B cellen in zes-goed cultuur platen voor vier dagen met interleukine-2, interleukine-10 en interleukine-15. Voor genexpressieprofilering gebruikt u een celsorteerder om de CD38-negatieve CD20-negatieve preplasmablasten op dag vier te zuiveren.Op dag vier, tel de cellen en plaat ze in 12-well cultuur platen op een celdichtheid van 250,000 cellen per milliliter door het toevoegen van twee milliliter van cel suspensie in elke put. Om differentiatie te induceren, verwijder je de CPG oligonucleotiden en oplosbare CD40 ligand en voeg je nieuw kweekmedium toe met een nieuwe cytokinecocktail met interleukine-2, interleukine-6, interleukine-10 en interleukine-15. Kweek de cellen drie dagen bij 37 graden Celsius.Voor genexpressieprofilering gebruikt u een celsorteerder om de CD38-positieve, CD20-negatieve plasmablasten op dag zeven te zuiveren. Tel op dag zeven de cellen. Plaat de cellen in 12-well cultuur platen op een celdichtheid van 500,000 cellen per put, door het toevoegen van twee milliliter van cel suspensie aan elke put.Onderscheid de plasmablasten in vroege plasmacellen met behulp van vers kweekmedium met interleukine-6, interleukine-15 en interferon-alpha gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius. Voor genexpressieprofilering gebruikt u een celsorteerder om de CD20-negatieve, CD38-positieve, CD138-positieve vroege plasmacellen op dag 10 te zuiveren. Ten eerste, cultuur stromal cellen voor vijf dagen met cultuur medium.Gebruik een 0,2-microliter filter om de stromale cel cultuur supernatant filter om stromal cel geconditioneerd medium te verkrijgen en bevriezen tot klaar voor gebruik. Vervolgens kweek je de vroege plasmacellen in 12-put kweekplaten, met behulp van het eerder verkregen stromalcellilmamedium met interleukine-6 en APRIL bij een celdichtheid van 500,000 cellen per put, door twee milliliter celsuspensie toe te voegen aan elke put. Incubeer bij 37 graden Celsius, het vernieuwen van de stromale cel geconditioneerd medium elke week.Meet vervolgens de immunoglobulineafscheiding uit door stroom cytometrie gesorteerde plasmacellen. Kweek de plasmacellen met een dichtheid van één miljoen cellen per milliliter gedurende 24 uur en oogst de cultuur supernatant. Met behulp van een ELISA kit, meet de immunoglobuline G, en immunoglobuline A.First, start de GenomicScape open access bioinformatica web tool.Selecteer in het menu browsegegevens de gegevensset met de naam menselijke B-cellen naar plasmacellen. Visualisatie van het genexpressieprofiel van een uniek gen of lijst van genen is beschikbaar met behulp van de tool Expression/Coexpression Report in de Analysis Tools. Selecteer vervolgens WebSAM Analysis Tools om het SAM-gereedschap te laden.Kies de gegevensset van menselijke B-cellen tot plasmacellen en selecteer de groep monsters die u wilt vergelijken. Gebruik de verschillende beschikbare filters om de filteropties van belang toe te passen. Als u genexpressieprofielen wilt vergelijken met het SAM-gereedschap, wijzigt u de filteropties, waaronder vouwwijziging, aantal permutaties, de false discovery rate en het type vergelijking.De software zal de analyse berekenen en genen differentieel tussen de geselecteerde groepen verstrekken. In deze studie worden de expressieveranderingen van de epigenetische factoren in normale plasmaceldifferentiatie onderzocht. Met behulp van multi-class SAM-analyse worden 71 genen significant verschillend uitgedrukt tussen de geheugen-B-cellen, de preplasmablasten, de plasmablasten, de vroege plasmacellen en de beenmergplasmacellen met een vals detectiepercentage van minder dan 5%De celfase van het geheugen B wordt gekenmerkt door de overbelasting van 23 epigenetische spelersgenen, waaronder 39,13% van de histonacetransferases, 30,43% van histone-methylases , 21,74% van histone demethylasen, 4,35% van de methylbindende eiwitten en 4,35% van histone deacetylasen.14 epigenetische spelersgenen worden aanzienlijk overuitgedrukt in het preplasmablast-stadium, waaronder 50% van histone methyltransferasen, 14,28% van de DNA-methyleften, 21,43% van de histonige deacetylasen, 7,14% van histone demethylases en 17,14% van zijn acetontyltransferases. Na deze procedure kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd om wijzigingen in de chromatinestructuur en architectuur tijdens deze B2-plasmaceldifferentiatie te identificeren en te begrijpen. Dit in vitro differentiatiemodel zal het mogelijk maken om voldoende cellen te genereren om deze moleculaire analyse te voltooien om zowel de paden die betrokken zijn bij deze hele modellering als hun downstream transcriptie-impact tijdens B2-plasmaceldifferentiatie te onthullen.Deze kennis die uit dit onderzoek wordt afgeleid, kan informeren en instrueren over diagnostische en therapeutische strategieën voor plasmacelaandoeningen, zoals in het geval van multipel myeloom, een kanker zonder definitieve genezing, waarvoor een betere prognose en verbeterde therapeutische strategieën kritisch nodig zijn. Het karakteriseren en begrijpen van de epigenetische remodellerende structurele en architecturale veranderingen die chromatine beïnvloeden tijdens B2 plasmaceldifferentiatie zal van bijzonder belang zijn. Dit kan worden gedaan met behulp van gen sequencing, ERRBS, ATAC sequencing, IC, en RNA sequencing.Een matige heterogeniteit kan worden waargenomen in het percentage geactiveerde B-cellen, preplasmablasten, plasmablasten en plasmacellen, afhankelijk van het bloed van gezonde donoren, dat wordt gebruikt voor geheugen B-celzuivering.

in-vitro-differentiation-model-human-normal-memory-b-cells-to-long

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een methode voor het genereren van getransformeerde B cellijnen met behulp van Epstein-Barr virus. We hebben ook illustreren een nieuwe test die kan identificeren B-cellen die zijn bestemd om de transformatie te ondergaan al drie dagen na de infectie.

Oprichting van Epstein-Barr Virus Growth-getransformeerde lymfoblastoïde cellijnen

Synthese van humane monoklonale antilichamen is de eerste stap in studies die gericht zijn op het ontrafelen van de pathofysiologische mechanismen van auto-antilichaam-gemedieerde immuunresponsen. We hebben een protocol ontwikkeld om recombinante humane immunoglobuline G (IgG) monoklonale antilichamen te genereren van uit bloed gesorteerd B-cellen, inclusief B-cel isolatie, antilichaam klonen en in vitro synthese.

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Menselijk perifeer bloed wordt vaak gebruikt voor de beoordeling van de humorale immuunrespons. Hier worden de methoden beschreven voor het isoleren van menselijke B-cellen uit perifeer bloed, het differentiëren van menselijke B-cellen in antilichaam (Ab)-secreterende B-cellen (ASC's) in cultuur en het tellen van het totale aantal IgM- en IgG-ASC's via een ELISpot-assay.

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

Dit protocol beschrijft de reproduceerbare productie en fenotypering van mens veroorzaakte regulerende T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T-cellen in vitro. Verschillende protocollen voor FOXP3 inductie mogelijk maken voor de studie van specifieke iTreg fenotypes verkregen met de respectieve protocollen.

In vitro differentiatie van humane CD4 + FOXP3 + geïnduceerde regulatoire T-cellen (iTregs) van naïeve CD4 + T cellen met behulp van een TGF-β-bevattende Protocol

Een eenvoudige rode bloedcel lysis methode voor het vaststellen van B-LCL werd ontwikkeld met hoge efficiency immortalisatie, die een kleine hoeveelheid bloed en tijdsbesparing van initiatie tot cryopreservatie.

A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

Om de differentiatie en functie van CD8 T-cellen in vitro te bestuderen, kunnen CD8 T-cellen uit de muis worden geïsoleerd om langdurig te worden gekweekt met vooraf geïnfecteerde vaginale epiteelorganoïden van muis. Hier beschrijven we dit proces en beoordelen we de verwerving van residente geheugen T-celmarkers bij co-kweek.

In vitro Resident geheugen CD8 T-celdifferentiatie met behulp van het epitheliale organoïde-T-cel co-cultuursysteem

Verken een in vitro differentiatiemodel voor B-geheugencellen naar plasmacellen met bio-informatica-analyse. Deze methode reproduceert sequentiële differentiatiestadia en transcriptieveranderingen voor immunologisch onderzoek.

In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen

Meer video's verkennen