Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Dit is een methode om elektromechanische stimulatie op cellen toe te passen. Het heeft meerdere toepassingen om de effecten ervan op een celpopulatie te bestuderen, voortraining voor in vivo levering en celrijping. Het voordeel is dat elektrische en mechanische stimuli individueel of gelijktijdig met hetzelfde apparaat kunnen worden toegepast terwijl steriele virale intact blijven.

Deze techniek is een indirecte benadering van onze therapie. Celtherapie wordt beschouwd als elektromechanisch gestimuleerd cellen kan een interessante cel populatie voor de behandeling van intro-myocardium. Deze methode behoort over het algemeen tot het cardiovasculaire veld, maar het kan ook worden toegepast op het zenuwstelsel.

Dit is een eenvoudige techniek die geduld vereist. Het moeilijkste deel zal werken met de kleine stukjes, en houd de steriliteit in. Er zijn weinig details van manipulatie die moeilijk uit te leggen zijn, dus de visuele demonstratie is echt nuttig.

Begin met het overbrengen van 12 gereinigde PDMS constructies naar steriele platen van 10 centimeter. Om volledige sterilisatie te verzekeren, stelt u de platen gedurende vijf minuten bloot aan UV-licht. Breng vervolgens elke constructie over naar een aparte 35 millimeter celkweekplaat, of 6-putplaten voor onmiddellijke celzaaien.

Om te beginnen met celzaaien, eerst wassen een confluent T75 fles cardiale ATDPCs met vijf milliliter van 1x PBS. Om de cellen los te maken, voeg een milliliter van 0,05% trypsin-EDTA. En vijf minuten lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens vijf milliliter volledig medium toe om de trypsine-EDTA te inactiveren. Verzamel alle losstaande cellen in een buis van 15 milliliter. Was het celglas twee keer met vijf milliliter PBS om de resterende cellen te verzamelen en voeg ze toe aan de buis van 15 milliliter.

Centrifuge op 230 g gedurende vijf minuten bij 22 graden Celsius. Verwijder de supernatant, en opnieuw opschorten de cellen in twee milliliter van volledige medium, en tel ze met de hemocytometer. Zaad 200 microliters van cardiale ATDCC's in elke plaat met de PDMS constructen om ongeveer 80% van het zaaioppervlak bedekt met cellen de volgende dag te verkrijgen.

Incubeer bij 37 graden Celsius, en 5%CO2. Voeg voorzichtig 2 milliliter voorverwarmd compleet medium per plaat toe. Incubeer de cellen met de constructen op 37 graden Celsius, en 5% CO2 's nachts.

Voordat u met deze procedure begint, wijst u zes van de twaalf constructies toe voor elektromechanische stimulatie en bewaar er zes voor niet-gestimuleerde controles. Gebruik 70% ethanol om de stimulatie-eenheid schoon te maken. Plaats de stimulatie-eenheid, steriele elektroden en pincet in de stroomkast.

Om de elektroden en constructies gemakkelijk te manipuleren, verwijdert u 90% van het medium uit elke celkweekplaat. Plaats de PDMS constructies in de juiste positie in de richting van de magneet om magnetische aantrekkingskracht tussen zowel vaste als mobiele magneten te verzekeren. Deze twee eerdere stappen waarin u de inzaaide PDMS-constructies van de cel manipuleert en de elektroden terwijl de steriliteit gedurende het hele proces behouden blijft, zijn het meest kritisch.

Sluit vervolgens de platinadraad aan op de elektrodeconnectoren. Oriënteer het PTFE-deel van de elektroden in hun aangewezen ruimten in de PDMS-constructies. Voeg 2,5 milliliter vers, voorverwarmd compleet medium toe aan elke constructie.

Zodra alle PDMS constructies zijn geplaatst en elektrisch verbonden met het platform, plaats het platform terug in de 37 graden Celsius, en 5% CO2 incubator. Sluit vervolgens de elektrische en mechanische bron aan. Om het stimulatieprogramma te configureren, specificeer u elektrische en mechanische stimulatieregimes via de gebruikersinterfaces van de elektrische stimulator en de toepassing, die de mechanische stimulatie regelt.

Als u het synchronisme wilt instellen, schakelt u de elektrische stimulator in en wacht u tot het hoofdmenu op het display verschijnt. Selecteer vervolgens optie twee, bewerk reeks, plus Enter. Als u het volgordemenu wilt bewerken, gebruikt u het tabblad Modus om huidige opties te selecteren door op plus te klikken en op Enter te drukken voor de periode. selecteer 1000"met plus/min en druk op Enter"En voor het tabblad triggermodus selecteert u Extern door software en drukt u op Enter"Voor het amplitude-tabblad, selecteer 1"met plus/min en druk op Enter"Vervolgens, terug in het hoofdmenu, selecteer optie 4 en genereer vervolgens volgorde en druk op Enter"In het gedeelte met mechanische stimulatie van het configuratietoepassingspaneel, schrijf eerst 1000"in het tekstbesturingselement plus.

Schrijf vervolgens 500"in de ON-tijd tekstregeling, om de mechanische pulsduur in te stellen. Tot slot, schrijf 2000"in de excursie tekst controle om een 10% construct rek te leveren. Verander de celmedia twee keer per week, door eerst de oude media te verwijderen en vervolgens warme, verse media toe te voegen aan de zijkanten van de PDMS-ondersteuning.

Op dag zeven, aan het einde van het experiment, verzamelen de monsters zoals beschreven in het manuscript. Elektromechanisch gestimuleerd cardiale ATDCC's versterkten hun cardiomyogene potentieel. Dit werd aangegeven door real-time PCR met verhoogde expressie van vroege en late cardiale genen met name de cardiale transcriptie factor GATA-4, de structurele marker beta-myosine zware keten, en het calcium gerelateerde gen Connexin43.

Phalloidine kleuring tegen actin vezels bleek dat de meerderheid van de cellen uitgelijnd volgens het verticale patroon. Connexin43 distributie was meestal in het cytoplasma, en op het plasmamembraan, bij te dragen aan intracellulaire communicatie via gap knooppunten. Mef2- en GATA-4-transcriptiefactoren bevonden zich op de kernen van cardiale ATDCC's.

Gata-4 werd echter niet gedetecteerd in onderhuidse APC's. De cytoplasmische markers SERCA2, en sarcomeric alpha-actinine, niet tonen een volwassen sarcomere organisatie typisch voor cardiomyocyten. En het slaan werd niet waargenomen in controle en gestimuleerde celbevolking.

Een gezonde celmonolaag aan het begin van dit protocol en het houden van de steriliteit gedurende de hele procedure zijn cruciaal. Na het verzamelen van monsters kunnen de standaard technieken voor genoomeiwitexpressie worden uitgevoerd. Deze techniek helpt om het effect van cele elektrische en/of mechanische stimuli beter te begrijpen.

Tot voor kort was het onmogelijk om hetzelfde apparaat te gebruiken voor beide stimulatie, wat de resultaten moeilijker te vergelijken maakte.