Name: Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Ontdek fluorescerende peptide zymografie voor het opsporen van protease-activiteit in biologische monsters. Deze modulaire methode maakt detectie van een breder scala aan proteasen mogelijk dan traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering verstrekt door The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering afdeling en de uitgebreide Cancer Center - Arthur G. James kanker ziekenhuis en Richard J. Solove Research Institute.

1. bereiding van de oplossing laag van Gel
<ol><li>Voorbereiden van een 10%-polyacrylamide oplossen van gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de Tetramethylethylenediamine (TEMED) en Ammonium Persulfate (APS) onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.</li>
	<li>Vul een lege 1,5 mm mini gel cassette halverwege (5 mL) met de 10%-oplossing voor oplossen gel.</li>
	<li>Een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) toevoegen aan de bovenkant van het polyacrylamidegel te produceren een niveau gel en luchtbellen voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 40 min).</li>
</ol>2. voorbereiding van de Azido-PEG3-maleimide Linker molecuul
<ol><li>Terwijl de eerste oplossen gel laag is actinemonomeren, de azido-PEG3-maleimide-kit ophalen uit de opslag van-20 ° C en laat de componenten tot kamertemperatuur. Er zijn twee componenten in elke kit. Flacon 1 bevat een maleimide-NHS ester, een gebroken wit naar grijs solide. Flacon 2 bevat azido-PEG3-amine, een lichtgeel olie. Opmerking: De auteurs suggereren met behulp van de 25 mg azido-PEG3-maleimide kit, zoals het alleen voor een korte periode van tijd (1-2 uur) kan worden opgeslagen bij-20 ° C na voorbereid voordat het begint te degraderen. 25 mg volstaat voor de productie van 10 peptide gels. Gebruik gels binnen 3 weken van voorbereiding.</li>
	<li>Los van de componenten van de flacon 2 in de fabrikant aanbevolen hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) en vortex voor 30 s om de vloeistoffen goed zijn gemengd.</li>
	<li>Breng de inhoud van de flacon 1 in een schone, droge 100 mL Rondbodemkolf met een roer-bar. Opmerking: Spoel de kolf met aceton en volledig drogen vóór gebruik om te voorkomen dat vocht uit te bemoeien met de reactie.</li>
	<li>Onmiddellijk invoegen een rubberstop tussenschot met een membraan die met een spuit in de mond van de kolf kan worden doorboord. Werk snel om te voorkomen dat vocht de kolf.</li>
	<li>Invoegen twee 18 meter syringe naalden in het middenrif en sluit een aan de gastank van een inert (bijvoorbeeld argon gas). Toestaan dat het inert gas te vullen de kolf gedurende 3 min. Mix de componenten van de flesjes 1 en 2 onder inert gas om te voorkomen dat ongewenste reactieproducten. Let op: De tweede naald van de spuit is bedoeld als een vent, waardoor de atmosferische lucht die deel uitmaakt van de kolf uit de kolf stromen als het vult met inert gas. Vergeet niet om op te nemen van een vent naald!</li>
	<li>Uitschakeling van het inert gas en het loskoppelen van de naald. Behulp van een spuit, injecteert de volledige inhoud van de flacon 2 in de kolf.</li>
	<li>Verwijder zowel naalden en spuiten en de Components wilt mengen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur tijdens het roeren.</li>
	<li>Verwijder de rubber tussenschot stop en de inhoud overbrengen in een centrifugebuis schone 5 mL. De azido-PEG3-maleimide-oplossing moet binnen 1 uur bij kamertemperatuur worden gebruikt.</li>
</ol>3. voorbereiding van de Peptide Gel laag oplossen
<ol><li>Zodra de eerste oplossen gel laag heeft polymeervorm, giet af de isopropanol-laag. Spoel de bovenkant van de gel door pipetting 1 mL gedeïoniseerd water op de bovenkant van de gel en giet uit het water.</li>
	<li>De thiol-matiemaatschappij fluorescerende peptide ophalen-80 ° C-opslag en laat ze ontdooien op kamertemperatuur. Opmerking: De thiol-matiemaatschappij peptide kan bereid worden zoals eerder beschreven11,12. Verkrijgbare peptiden kunnen ook worden gebruikt maar vereist de toevoeging van een terminal cysteine residu om de maleimide-thiol Klik op reactie. Los van de peptide tot een voorraad concentratie van 10 mM en opslaan bij-80 ° C in kleine (30 uL) porties te beperken van herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.</li>
	<li>Voorbereiden van een 10% oplossing van gel oplossing met het linker azido-PEG3-maleimide-molecuul en de fluorescerende peptide volgens tabel 1. Voeg de TEMED en de APS onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.</li>
	<li>Vul de helft van het resterende deel van de gel cassette (3 mL) met de peptide oplossen van gel oplossing. Opmerking: Een multi-layer oplossen gel aanpak vermindert de hoeveelheid peptide en linker nodig voor elke gel. De grootte van de peptide oplossen gel laag kan worden aangepast aan een grotere reeks molecuulgewichten zo nodig.</li>
	<li>Pipetteer een dun laagje van isopropanol (~ 500 µL) naar de top van het polyacrylamidegel te produceren een niveau gel en luchtbellen voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 40 min). Opmerking: De fluorescerende peptide is lichtgevoelig. Houd de gels bedekt met aluminiumfolie ter voorkoming van photobleaching tijdens de voorbereiding van het gel elektroforese, wassen en ontwikkeling.</li>
	<li>Giet af de laag isopropanol en spoel de bovenkant van de peptide oplossen van gel met gedeïoniseerd water zoals in stap 3.1.</li>
	<li>Als met behulp van de gels onmiddellijk, gaat u verder met stap 4, anders, dompel de bereid gels in 100 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C in een plastic doosje om te voorkomen dat de gels uitdrogen. Wikkel het vak in aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching. Gels, kunnen worden opgeslagen in PBS voor maximaal 3 weken voorafgaand aan gebruik.</li>
</ol>4. voorbereiding van de stapelvolgorde Gel
<ol><li>Bereid een 5% stapelen-gel oplossing volgens tabel 1. Voeg de TEMED en de APS onmiddellijk voorafgaand aan de gel gieten als hun toevoeging polymerisatie reactie initieert.</li>
	<li>Vul het resterende lege gedeelte van de gel cassette (~ 2 mL) met de stapelvolgorde gel-oplossing.</li>
	<li>Snel een 1,5 mm gel kam in de stapelvolgorde gel laag invoegen, om ervoor te zorgen geen luchtbellen blijven opgesloten onder de putten. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing voor het bijhouden van de voortgang van de polymerisatie-reactie. Wanneer de polyacrylamide in de buis is volledig verhard, is de reactie voltooid (~ 10 min).</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de kam en de tape vanaf de achterkant van de cassette van de gel.</li>
</ol>5. bereiding van biologische monsters voor elektroforese
<ol><li>Bereiden geconditioneerde cel media, cel lysates weefsel homogenates en MMP normen zoals elders beschreven onder niet-reducerende omstandigheden2. De monsters niet verhit.</li>
	<li>Bijvoorbeeld, bereiden geconditioneerde cel media als volgt:<ol>
<li>Plaat 40.000 cellen/cm2 cellen in een 6-well plaat in 10% foetale runderserum (FBS) voedingsbodems. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer (5% CO2 bij 37 ° C) voor 24 uur en laat hen tot 70-80% samenvloeiing. Opmerking: Als de cellen de gewenste confluentie na 24 uur niet hebben bereikt, hen in staat stellen om te groeien in 10% FBS voedingsbodems voor een aanvullende 24 uur.</li>
		<li>Spoel de cellen tweemaal met PBS en voeg toe 2 mL serum-vrije cultuur media. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer (5% CO2 bij 37 ° C) voor een aanvullende 24 uur.</li>
		<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, verzamelen de geconditioneerde media van elk putje. Centrifugeer de media van 1200 toeren per minuut gedurende 3 minuten aan elke cel puin te verwijderen. Neem het supernatant en concentreren met behulp van een 15 mL, 10 kDa molecuulgewicht cutoff centrifugaal filter eenheid. Centrifugeer de eenheden van de filter op 4.000 x g gedurende 15 min. in een swingende emmer rotor of 5000 x g gedurende 15 min. in een vaste hoek rotor. Opmerking: Deze stap is optioneel, maar de intensiteit van de Proteolytische bands in de peptide zymography gels kunt verbeteren.</li>
		<li>Het geconcentreerde filtraat overbrengen in een centrifugebuis verse 1,5 mL. Aliquot en winkel monsters bij-80 ° C gedurende maximaal drie bevriezen-ontdooien cycli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gehalte aan andere melkeiwitten met behulp van een standaard eiwit kwantificering assay kwantificeren (bijvoorbeeld BCA, de analyse van Bradford, enz.).</li>
</ol>6. de Elektroforese van biologische monsters in Peptide Zymography Gels
<ol><li>Ontbinden van monsters in conventionele zymography monster buffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% glycerol, 4% SDS, 0,01% bromophenol blauw). Voor cel- en weefseltransplantaties monsters, ~ 30 µg totaal eiwit per putje wordt aanbevolen, en 50-100 ng van eiwitten voor de MMP-normen.</li>
	<li>Voeg 400 mL 1 x Tris-Glycine SDS uitvoeren Buffer op de gel-apparatuur. Laad tot 35 µL van monster per putje. De monsters worden uitgevoerd op 120 V bij 4 ° C gedurende 1,5 uur of totdat de molecuulgewicht normen geven aan dat de proteasen van belang binnen de peptide oplossen van gel laag zijn (die heeft een zichtbare oranje kleur). Opmerking: De meeste MMP en hun varianten vallen binnen het bereik van 35-100 kDa. Wanneer de molecuulgewicht normen aangeven dat deze gewichten zijn binnen de peptide oplossen van gel laag, kan elektroforese worden gestopt. Hetzelfde principe kan worden toegepast op andere soorten proteasen met bekend molecuulgewicht. Als er belangstelling voor het opsporen van meerdere proteasen over een grotere reeks molecuulgewichten, verminderen van de grootte van het oplossen gel laag en het vergroten van de peptide oplossen gel laag.</li>
	<li>Na elektroforese, verwijder de gels uit de plastic cassette en wassen gels driemaal voor elke 10 min bij kamertemperatuur onder zachte agitatie in waterlopen buffer met 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2en 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.</li>
	<li>Gels voor overdracht aan een derde Bufferoplossing met 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 en 5 mM CaCl2 in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 voor 15 min. vervangen met de ontwikkeling van de verse buffer oplossing en incubeer gels bij 37 ° C onder zachte agitatie voor 24 uur , om ervoor te zorgen de gels zijn volledig onderdompelen in de oplossing.</li>
</ol>7. beeldvorming van Peptide Zymography Gels
<ol><li>Na 24 uur gel afbeelding gels met behulp van een TL scanner/imager met behulp van de geschikte filters voor excitatie en emissie. Bijvoorbeeld, de peptide gels in de representatieve resultaten weergegeven zijn geconjugeerd met fluoresceïne en werden beeld met behulp van een filter van de excitatie van 488 nm en een filter van de emissie van 521 nm. Met behulp van de juiste filters voor uw fluorophore zal het maximaliseren van de opsporing van proteolytic activiteit. Opmerking: Afbeeldingen kunnen ook worden genomen met een gel imager uitgerust met een UV-transilluminator, vaak gebruikt voor de beeldvorming van DNA gels gekleurd met ethidiumbromide. Afbeelding van de gels met behulp van de UV-transilluminator (365 nm) instelling en een filter van de emissie van 590 nm.</li>
	<li>Densitometric evaluatie van intensiteiten van de band met behulp van ImageJ zoals elders beschreven13uit te voeren.</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li>
<li>Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+zymography+as+a+sensitive+and+specific+technique+for+the+determination+of+subpicogram+levels+of+interstitial+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase.</a> Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).</li>
<li>Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+collagen+zymography+approach+for+evaluating+the+collagenases+MMP-1%2C+MMP-8%2C+and+MMP-13%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13.</a> BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).</li>
<li>Perera, H. K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Aspartic+Proteinase+Activities+Using+Gel+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Zymography%22%5BJournal%5D)">Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography.</a> Zymography. , 43-52 (2017).</li>
<li>van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).</li>
<li>Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOliver%2C+GW+%22Proteolytic+Enzymes.+Springer+Lab+Manual%22">Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).</li>
<li>Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proteolytic+activity+by+covalent+tethering+of+fluorogenic+substrates+in+zymogram+gels%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels.</a> BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).</li>
<li>Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proteolytic+activity+by+fluorescent+zymogram+in-gel+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays.</a> BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).</li>
<li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li>
<li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li>
<li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).</li>
<li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%E2%80%B2+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Huidige zymographic technieken, is afhankelijk van de opneming van een native substraten in polyacrylamide gels voor de detectie van proteolyse. Terwijl deze technieken hebt opgeslaen wijdverbreide gebruik, zijn ze nog steeds beperkt in het aantal proteasen die ze kunnen detecteren. Hier werd een protocol beschreven in welke TL, protease-afbreekbaar peptiden zijn opgenomen in de polyacrylamide oplossen van gel. Covalente koppelen met behulp van een azido-PEG3-maleimide linker molecuul in staat stelt de scheiding en opspo...

Gel zymography is een biologische techniek voor het meten van proteolytic activiteit binnen biologische monsters, zoals lichaamsvloeistoffen of cel voedingsbodems1,2,3. De monsters worden gescheiden door hun molecuulgewicht met elektroforese via een polyacrylamidegel ingebed met een afbreekbare substraat. Gemeenschappelijke afbreekbaar substraten omvatten gelatine, caseïne, collageen en elastine, die zijn gebruikt voor het meten van de activiteit van matrix metalloproteinasen (MMP) -1 -2, -3, -7, -8, -9, en -11, naast een verscheidenheid van cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. na elektroforese, de enzymen zijn renatured en toegestaan te degraderen de eiwit binnen de gel. In traditionele gel zymography, de gel is gekleurd met een eiwit kleurstof, zoals Coomassie Blue, en protease-activiteit wordt gedetecteerd als een verlies van signaal, dat wil zeggen, witte banden (afbraak van eiwitten) op een donker blauwe achtergrond.
Hier beschrijven we een protocol voor een alternatieve methode van gel zymography, waarin het afbreekbaar substraat een korte, fluorogenic peptide covalent opgenomen in het polyacrylamidegel (Figuur 1 is). De vervanging van synthetische peptides als de afbreekbaar substraten maakt detectie van een breder scala van proteasen in vergelijking met traditionele gel zymography met inheemse proteïnen9. Covalente koppeling van de fluorogenic peptide verhindert diffusie van peptide en migratie tijdens gelelektroforese waargenomen met vorige methoden9,10. Het gebruik van een substraat fluorogenic maakt bovendien direct opsporen van protease-activiteit zonder extra kleuring en -kleuring stappen. Het algemene doel van deze methode is het opsporen van protease-activiteit in biologische monsters via de covalente opneming van fluorogenic peptiden in zymogram gels.

<table><tbody><tr><td>1.5 mm Empty Gel Cassettes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS Solution</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x Zymography Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Tissue Culture Plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Ammounium Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimide Kit</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Hypodermic Needles</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Flask (100 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>Septum Rubber Stopper</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

opsporen van protease-activiteit door fluorescerende peptide zymography

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Het doel van deze methode is voor het meten van de proteolytic activiteit van complexe biologische monsters. De monsters worden gescheiden door molecuulgewicht met behulp van elektroforese via een oplossen gel ingebed met een afbreekbare substraat. Deze methode verschilt van de traditionele gel zymography daarin een gehard fluorogenic peptide covalent is opgenomen in het oplossen gel in plaats van volledige lengte eiwitten, zoals gelatine of caseïne. Gebruik van de fluorogenic peptiden kan directe detectie van proteolytic activiteit zonder extra kleuring stappen. Enzymen in de biologische monsters klieven de gehard fluorogenic peptide, resulterend in een verhoging in fluorescentie. De fluorescerende signaal in de gels is dan beeld met een standaard TL gel scanner en gekwantificeerd aan de hand van densitometrie. Het gebruik van peptiden als het afbreekbaar substraat sterk breidt de mogelijke proteasen aantoonbaar met zymographic technieken.

Met behulp van de methode beschreven hier, twee fluorescerende protease-afbreekbaar peptiden werden ingelijfd bij polyacrylamide gels: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (afgekort als QGIW in de gehele tekst en cijfers) en GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (afgekort als LACW in de gehele tekst en cijfers). ↓ geeft aan de site van decollete. QGIW is een collageen-ik afgeleid reeks ontworpen voor het opsporen van cellulaire collagenases14. LACW is een reeks ...

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een gewijzigde zymographic techniek waarin fluorescerende peptides worden gebruikt als het afbreekbaar substraat in plaats van de inheemse proteïnen. Elektroforese van biologische monsters in fluorescerende peptide zymograms maakt detectie van een breder scala van proteasen dan vorige zymographic technieken.

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Huidige zymografische technieken detecteren een beperkt aantal proteasen. Fluorescerende peptide zymografie maakt gebruik van fluorescerende peptiden als het afbreekbare substraat dat het meten van een groter bereik van proteasen mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze methode is het modulaire ontwerp.De volgorde van het fluorescerende peptide bepaalt welke proteasen worden gedetecteerd en het fluorescerende peptide kan gemakkelijk worden verwisseld met een peptide van een andere sequentie, een vermogen om andere proteasen te detecteren. Deze techniek kan helpen bij het ontwerp van peptiden's gebruik als afbreekbare cross-linkers in gemanipuleerde biomaterialen zoals die worden gebruikt voor de levering van geneesmiddelen of weefsel engineering toepassingen. Integratie van dit peptide in deze techniek kan weefsel gedetgeheimde proteasen identificeren die verantwoordelijk zijn voor biomateriële afbraak.Demonstratie van deze techniek is belangrijk om de meerlaagse aanpak te visualiseren die uniek is in vergelijking met andere zymografietechnieken. Het aantonen van deze techniek zal zijn, Ameya Deshmukh, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om te beginnen, bereid een 10%polyacrylamide oplossen gel oplossing zoals beschreven in tabel een van de tekst protocol.Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TEMED en APS toe. Vul vervolgens halverwege de 1,5 millimeter minigelcassette met de oplossende geloplossing. Voeg een dun laagje isopropanol toe aan de bovenkant van de polyacrylamidegel om een levelgel te produceren en bubbels te voorkomen.Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Wanneer de polyacrylamide in de buis volledig gestold is, is de reactie compleet. Terwijl de eerste oplossende gellaag polymeriseert, haalt u de Azido-PEG3-Maleimide-kit uit de opslag bij 20 graden Celsius en laat u de componenten op kamertemperatuur komen.Los vervolgens de componenten van flacon twee op in het aanbevolen volume van DMSO van de fabrikant. En vortex voor 30 seconden om ervoor te zorgen dat de vloeistoffen goed gemengd zijn. Breng de inhoud van flacon een in een schone, droge 100 millileter ronde bodemkolf die een roerstaaf bevat.Steek onmiddellijk een rubberen septumstopper met een diafragma dat met een spuit in de mond van de kolf kan worden doorboord. Steek vervolgens twee 18-gauge spuitnaalden in het middenrif. Sluit een van de spuitnaalden aan op een inerte gastank en laat het gas de ronde bodemkolf gedurende drie minuten vullen.Sluit vervolgens het inerte gas af en maak het los van de naald. Met behulp van een spuit, injecteer de volledige inhoud van flacon twee in de kolf. Verwijder zowel de naalden als de spuit.Laat de componenten 30 minuten mengen bij kamertemperatuur tijdens het roeren. Verwijder hierna de rubberen septumstopper en breng de inhoud over naar een schone vijf milliliter centrifugebuis. Zodra de eerste oplossende gellaag heeft gepolymeriseerd giet de isopropanol laag.Pipet een milliliter gedeïoniseerd water op de top van de gel en giet het water af om de gel te spoelen. Haal de thiol gefunctionaliseerde fluorescerende peptide uit de opslag op 80 graden Celsius. Laat het ontdooien bij kamertemperatuur.Bereid een 10%resolving gel oplossing met de Azido-PEG3-Maleimide linker molecuul en de fluorescerende peptide zoals beschreven in tabel een van de tekst protocol. Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TMED en APS toe. Vul vervolgens de helft van het resterende gedeelte van de gelcassette met de peptide resolving gel oplossing.Voeg een dun laagje isopropanol toe aan de bovenkant van de polyacrylamidegel om een levelgel te produceren en bubbels te voorkomen. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Nadat de reactie is voltooid, giet de isopropanollaag af.Pipet een milliliter gedeïoniseerd water op de top van de gel en giet het water af om de gel te spoelen. Als u de gels niet onmiddellijk gebruikt, bewaar ze dan door ze onder te dompelen in een plastic doos gevuld met 100 milliliter 1x PBS bij vier graden Celsius. Wikkel de doos in aluminiumfolie om fotobleaching te voorkomen.Bereid eerst een stapelgeloplossing van 5% voor, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Voeg onmiddellijk voor het gieten van de gel de TMED en APS toe. Vul het resterende lege gedeelte van de gelcassette met de stapelgeloplossing.Steek snel een 1,5 millimeter gelkam in de stapelen gel laag ervoor te zorgen dat er geen bubbels blijven gevangen onder de putten. Gebruik de overgebleven polyacrylamide-oplossing om de voortgang van de polymerisatiereactie bij te houden. Wanneer de reactie is voltooid, verwijder dan voorzichtig de kam en de tape van de achterkant van de gelcassette.Los om te beginnen monsters op in conventionele zymografiemonsterbuffer. Voeg 400 milliliter besturingssysteem 1X tris glycene SDS running buffer toe aan het gel apparaat. Laad tot 35 microliter monster per put.Voer de monsters op 120 volt op vier graden Celsius gedurende anderhalf uur of totdat de moleculaire gewicht normen geven aan dat de proteases van belang zijn binnen de peptide-oplossende gel laag. Verwijder hierna de gels uit de plastic cassette. Was de gels drie keer in een herbenaringende buffer bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.Bij elke wasbeurt van 10 minuten. Breng gels gedurende 15 minuten over naar een ontwikkelende bufferoplossing. Vervang vervolgens de oplossing door verse ontwikkelende buffer en incubeer bij 37 graden Celsius onder zachte agitatie gedurende 24 uur.Gebruik hierna een fluorescerende gelscanner imager met de juiste excitatie- en emissiefilters om de gels in beeld te brengen. In deze studie naar fluorescerende protease afbreekbare peptiden zijn opgenomen in polyacrylamide gels. QGIW is een collageen een afgeleide sequentie ontworpen om cellulaire collagenesis te detecteren, terwijl LACW is een sequentie die is geoptimaliseerd voor de detectie van MMP-14 en MMP-11.Fluorescerende beeldvorming onthult tal van banden binnen de LACW peptide gels, Terwijl slechts een enkele band wordt gezien in de QGIW gels. In vergelijking met gelatinezymografie zijn LACW-gels in staat om meer proteolytische banden te detecteren, wat het vermogen van peptide zymografie aantoont om een breder scala aan proteasen te detecteren die aanwezig zijn in biologische monsters dan traditionele methoden met behulp van inheemse substraten. Peptide zymografie cellen worden vervolgens geïncubeerd in de ontwikkeling buffer met ofwel GM6001, een breed spectrum MMP-remmer, of E64, een algemene cathepsin remmer.Behandeling van de LACW peptide gels met GM6001, vermindert de intensiteit van de banden. Terwijl de behandeling met E64 geen waarneembaar effect heeft. Behandeling van de QGIQ peptide gels met GM6001 resulteert in volledige ablatie van de eerder vertoonde banden.Terwijl E64 geen effect heeft. Gelatine zymografie wordt uitgevoerd met behulp van gezuiverde, geactiveerde MMP-9 om de gevoeligheid van peptide zymografie te vergelijken met de huidige gouden standaard. LACW gels zijn in staat om de kleinste concentraties MMP-9 te detecteren.Proteases vereisen specifieke voorwaarden om de natuur te herstellen en geactiveerd te worden. Bereid de bufferoplossingen zorgvuldig voor om ervoor te zorgen dat de samenstelling en PH correct zijn. Deze methode kan worden aangevuld met bestaande technieken om de identiteit te verifiëren en verdere analyse van de gemeten proteasen uit te voeren.Dit omvat westerse blotting, real-time PCR, en massaspectrometrie. Wees voorzichtig bij het hanteren van polyacrylamide. Ongepolymeriseerde oplossing wordt beschouwd als een krachtige neurotoxine en passende persoonlijke beschermingsmiddelen moeten altijd worden gedragen bij de behandeling ervan.

detection-of-protease-activity-by-fluorescent-peptide-zymography

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De Protease Fluorescent Detection Kit is ontworpen voor de meting van de protease-activiteit met behulp van fluorometrie. Het is ook geschikt voor de detectie van sporen van protease besmetting. De methode is gebaseerd op de proteolytische hydroysis van een eigen formulering van een FITC-gelabelde caseïne substraat.

Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

Dit protocol beschrijft een activiteit-gebaseerde test voor het opsporen van matrix metalloproteïnasen in kweeksupernatanten of lichaamsvloeistoffen.

Detectie van Functionele matrix metalloproteinasen door zymografie

In this video, we perform zymography, an electrophoretic technique, to analyze the proteolytic activity within biological samples.

Fluorescent Peptide Zymography: A Modified Technique to Detect Protease Activity Using Fluorogenic Substrates in Zymogram Gels

This video demonstrates the zymography gel electrophoresis technique to assess the activity of matrix metalloproteinases (MMPs) present in cell culture supernatant. The active MMPs degrade the MMP-specific substrate embedded in a polyacrylamide gel, which appears as clear bands against a dark stained background following staining.

Zymography Gel Electrophoresis: An Electrophoretic Technique to Detect Matrix Metalloproteinases by Assessing the Enzymatic Activity

This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

We beschrijven een eenvoudige, kwantitatieve colorimetrische test die specifiek de proteolytische activiteit van humane, muis- of ratten-Granzyme B (GzmB) meet. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor het bepalen van de protease-activiteit van andere granuulserineproteasen door de hydrolyse van andere synthetische peptide-substraten met een geschikte herkenningssequentie.

Een colorimetrische test waarmee specifiek Granzyme B proteolytische activiteit: Hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Hier presenteren we een protocol om de oriëntatie en topologie van integrale membraaneiwitten in levende cellen te bepalen. Dit eenvoudige protocol is gebaseerd op de selectieve proteasegevoeligheid van chimaeren tussen het eiwit van belang en GFP.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Hier presenteren we de gedetailleerde procedure van een onlangs ontwikkelde protease assay platform met behulp van N-terminal hexahistidine/maltose-bindend-proteïne en fluorescente proteïne-gesmolten recombinante substraten gekoppeld aan het oppervlak van nikkel-nitrilotriacetic zure magnetische agarose kralen. Een latere in-gel-analyse van de monsters van de assay gescheiden door elektroforese van het gel van natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide is ook gepresenteerd.

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Presenteren we een fluorogenic peptide decollete assay waarmee een snelle screening van de proteolytic activiteit van proteasen op peptiden die vertegenwoordigen de breukzijde van virale fusion peptiden. Deze methode kan ook worden gebruikt op elke andere aminozuur motief binnen een eiwit sequentie om te testen voor de protease-activiteit.

Een Fluorogenic Peptide decollete Assay aan het scherm voor Proteolytic activiteit: toepassingen voor coronavirus spike eiwit activering

Proteïnasen zijn van vitaal belang voor bacteriële pathogenese, waardoor invasie en immuunontwijking mogelijk worden. Extractie in één stap van cytoplasmatische en membraaneiwitten van bacteriën in hun actieve vorm is schrijnend. Dit video-artikel demonstreert de extractie van volledige cellulaire eiwitten van Leptospira voor zymografie-analyse om gelatinasen te detecteren en te karakteriseren.

Extractie in één stap en zymografische analyse van bacteriële gelatinasen

Ontdek fluorescerende peptide zymografie voor het opsporen van protease-activiteit in biologische monsters. Deze modulaire methode maakt detectie van een breder scala aan proteasen mogelijk dan traditionele technieken.

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

Meer video's verkennen