Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie
January 29th, 2019
Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.
Hier beschrijven we een protocol met immunofluorescentie, confocale microscopie en computergebaseerde analyse om de verdeling van synaptisch eiwit ten opzichte van een referentie-eiwit te bepalen. Onze methode omzeilt de inherente variabiliteit van immunofluorescentie vlekken met behulp van een verhouding in plaats van absolute fluorescentie niveaus. Daarnaast u met deze methode de heterogeniteit van eiwitdistributie op verschillende niveaus analyseren.
Van hele hersenschijfjes tot hersengebieden tot zelfs subgebieden zoals de verschillende lagen van de hippocampus. Deze techniek kan worden aangepast om de eiwitverdeling in andere weefsels dan de hersenen en modelsystemen dan muizen te bepalen. Begin met het wassen van eerder geïsoleerde en vaste muishersenen zoals beschreven in het manuscript.
Breng vervolgens de hersenen over naar een 15 milliliter reactiebuis met 30% sacharose 0,1 molaire PB. Om cryo te beschermen de hersenen uitbroeden op 4 graden Celsius voor 48 uur of totdat het zinkt. Daarna gebruik maken van een een scherp mes om de cryo beschermde hersenen trim, afhankelijk van het gebied van belang. Plaats vervolgens de hersenen in een cryo mal en voeg optimale snijtemperatuur compound in te bedden om ervoor te zorgen dat bellen te vermijden en de hersenen goed te oriënteren om een coronale vlak van snijden hebben.
Plaats de cryo schimmel in de min 80 graden Celsius vriezer totdat het is bevroren vast. Monteer het bevroren weefsel op de cryo microtome en wacht minstens 15 minuten voor sectie om het te equiliben tot de microtome temperatuur. Begin met het snijden van de hersenen in 25 micrometer dikke coronale plakjes.
Gebruik een glazen haak op de OKT van de eerste plak zorgvuldig zonder het aanraken van de hersenen weefsel. De OCT blijft aan de glazen haak plakken. Gebruik de glazen haak om de hersenen slice over te dragen in de eerste put.
Verzamel drie aangrenzende plakjes per put in een 24 goed plaat gevuld met 0,1 molaire PB. Bewaar de plakjes op vier graden celsius tot vlekken voor maximaal twee weken. Om de plakjes voor te bereiden op immuno vlekken gebruik maken van een plastic pipet om de PB-oplossing te verwijderen uit een put zonder tekening in de hersenen plakjes. Gebruik dan een 1000 micro liter pipet om 250 microliters van verse PB toe te voegen om ze te wassen van overtollige OCT.
Herhaal deze wasbeurt voor elke put op het moment om te voorkomen dat uitdrogen van de plakjes. Gebruik vervolgens een plastic pipet om de PB-oplossing uit de eerste put te verwijderen. Gebruik een 1000 microliter pipet toe te voegen 250 microliter van het blokkeren buffer per goed werkt goed door goed weer.
Broed de plaat drie uur lang op kamertemperatuur op een shaker. Voeg tijdens de incubatie 250 microliters antilichaambuffer per put toe aan een reactiebuis. Gebruik vervolgens een 2 microliter pipet om de juiste hoeveelheid antilichaam pipetting het direct toe te voegen in de oplossing en voorzichtig pipet op en neer meerdere malen te mengen.
Dan vortex dit verdunde antilichaam niet zeker goede mengen. Goed werken door goed verwijderen van de blokkering buffer met een plastic pipet en voeg 250 microliters van primaire antilichaam oplossing per goed. Incubeer de plaat op een shaker op vier graden celsius 's nachts.
De volgende dag verwijder de antilichaamoplossing met een plastic pipet. Was de plakjes met 300 microliters wasbuffer een per put drie keer tien minuten per wasbeurt op een shaker bij kamertemperatuur. Tijdens het wassen, werken in het donker, verdun de fluor voor een paar seconden antilichaam in een reactiebuis op dezelfde manier als eerder gedaan met het primaire antilichaam.
Na het wassen verwijder de wasbuffer met een plastic pipet en voeg 250 microliters secundaire antilichaamoplossing per put toe. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Na voltooiing van de incubatie verwijder de antilichaamoplossing met een plastic pipet.
Was de secties drie keer met wasbuffer twee op dezelfde manier als bij wasbuffer een. Tijdens deze wasverdunning DAPI vlek in 0.1 kies PB om een concentratie van één tot 2000 te bereiken. Voeg na het verwijderen van de wasbuffer van de plaat 250 microliters DAPI-oplossing toe en broed 5 minuten bij kamertemperatuur op de shaker.
Na het verwijderen van de DAPI oplossing met een plastic pipet gebruik maken van een 1000 microliter pipet om 500 microliter van 0,1 molaire PB per put toe te voegen. Plaats een microscoop dia onder een stereoscoop. Gebruik een fijne borstel om drie afzonderlijke druppels van 0,1 kies PB op de dia toe te voegen.
Plaats met het penseel één segment per druppel op de dia en vlak af en oriënteer de segmenten. Nadat alle plakjes correct zijn geplaatst, gebruikt u een papierweefsel om overtollige PB te verwijderen en voorzichtig te drogen zonder de plakjes volledig te drogen. Voeg vervolgens 80 microliters inbedding medium op de dia en zorgvuldig te dekken met een cover slip om de hersenen plakjes insluiten.
Bedek de dia's om blootstelling aan licht te voorkomen en laat ze te drogen in de rookkap voor een tot twee uur en sla ze in een microscoop dia doos op vier graden Celsius tot klaar voor confocale microscopie. Na het verwerven van virtuele weefsels van de hele hersenen slice voor verschillende kanalen zoals beschreven in het manuscript laden alle enkele kanalen of een afbeelding in FIJI door te klikken op bestand en vervolgens te openen. Gebruik vervolgens het gereedschap Vrije handselectie om één halfrond in het DAPI-kanaal af te bakenen.
Klik op bewerken en selecteer vervolgens en maak masker om een masker van het geselecteerde gebied te maken. Klik vervolgens op analyseren en meet vervolgens deeltjes om de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor enkele kanalen te bepalen. Zorg ervoor dat u afzonderlijke kanalen selecteert om de gemiddelde fluorescentieintensiteitswaarden voor elk kanaal te bepalen.
Kopieer daarna de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor de afzonderlijke kanalen in een spreadsheet. Om de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor de afzonderlijke kanalen in een gebied van belang te bepalen, wordt het gebied afbakend met het gereedschap vrije handselectie. Na het bevlekken met DAPI die vlekken kernen hersensecties hebben een punctate patroon en regio's met een hoge celdichtheid zijn helderder dan regio's met een lage celdichtheid.
Vlekken met Mover antilichaam bleek heterogene verdeling met heldere hot spot gebieden en dimmer gebieden in de hersenen waar als Synaptophysin bleek meer homogene verdeling. Een overlay van beelden toonde de differentiële verdeling van rode fluorescentie die wijst op Mover eiwit vergeleken groene fluorescentie die Synaptophysin aangeeft. Na kwantificeringsanalyse zijn fluorescentieintensiteitswaarden voor verschillende kanalen over de hemisferen en over de interessegebieden bepaald voor zowel Verhuizer als Synaptophysin.
Verhoudingen van de verhuizer fluorescentie waarden synaptophysine fluorescentie waarden tonen de heterogene verdeling van verhuizer met gebieden van hoge en lage Mover niveaus ten opzichte van Synaptische vesikels. Relatieve Mover overvloed de verhouding in een gebied van belang in vergelijking met die over de hele hemisfeer en vertaald in een percentage bleek hoeveel Verhuizer aanwezig is in een gebied van belang ten opzichte van het gemiddelde. Relatieve Mover overvloed werd bepaald voor verschillende lagen in de subvelden van de hippocampus.
De drie bezienswaardigheden worden gekwantificeerd door de verhouding in de respectieve lagen te vergelijken met de verhouding van het overeenkomstige halfrond. Deze procedure kan eenvoudig worden aangepast en gecombineerd met verschillende beeldvormingstechnieken zoals superresolutiemicroscopie om bovendien de subcellulaire verdeling van het eiwit van belang te bepalen. Deze techniek kan ook worden toegepast op verschillende modelsystemen, zoals genetisch gemodificeerde of met drugs behandelde dieren.
Dit kan een vergelijkende benadering mogelijk maken tussen verschillende experimentele omstandigheden of zelfs soorten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een kwantitatieve methode om de verdeling van een synaptisch eiwit te analyseren met behulp van immunofluorescentie en confocale microscopie. De methode maakt het mogelijk om de verhoudingen van eiwitverdelingen te evalueren in plaats van absolute fluorescentieniveaus, waardoor het aanpasbaar is voor verschillende biologische weefsels buiten de hersenen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immuνοfluorescentietechnieken
Achtergrond
- Detectie van synaptische eiwitten is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functie.
- Immuνοfluorescentiekleuring is vatbaar voor variabiliteit, wat deze methode beperkt.
- De techniek kan worden gebruikt in verschillende weefsels en modelorganismen.
Doel van de studie
- Om een nauwkeurige benadering te ontwikkelen voor het kwantificeren van synaptische eiwitverdelingen.
- Om heterogeniteit in eiwitverdeling op verschillende hersenniveaus te beoordelen.
- Om eiwitanalysetechnieken te verfijnen die geschikt zijn voor meerdere biologische contexten.
Gebruikte methoden
- Immuνοfluorescentie gecombineerd met confocale microscopie op hersensneden.
- Gebruik van eerder geïsoleerde muizenhersenweefsels als biologisch model.
- Cryoconservering en snijden van hersenweefsel met een dikte van 25 micrometer.
- Stapsgewijze was- en incubatieprocedures voor antilichaamtoepassing en kleuring.
- Beeldanalyse met behulp van FIJI-software voor het kwantificeren van fluorescentie-intensiteiten.
Belangrijkste resultaten
- De methode biedt een duidelijke weergave van eiwitverdeling over hersengebieden.
- Verschillende synaptische eiwitten vertonen heterogene en homogene patronen in verdeling.
- Gebieden met hoge celdichtheid vertoonden helderdere signalen, wat de effectiviteit van DAPI-kleuring aangeeft.
Conclusies
- Deze studie verbetert de mogelijkheid om synaptische eiwitverdeling kwantitatief te beoordelen.
- De methode is veelzijdig en maakt analyses in verschillende weefsels en modelsystemen mogelijk.
- Het begrijpen van deze verdelingspatronen kan inzicht geven in neuronale mechanismen en mogelijke ziektemodellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of synaptic protein distribution using immunofluorescence and confocal microscopy addresses a critical need for reproducible, comparative protein localization in neurobiology and CNS drug discovery. By leveraging ratio-based fluorescence analysis, this method enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity across preclinical models. The approach enables robust cross-study and cross-platform comparisons, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of synaptic protein localization relative to reference markers.
- Supports functional target validation by revealing heterogeneous protein distribution across brain regions and subregions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing region-specific protein abundance patterns.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain tissue systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes immunofluorescence outputs by using ratio metrics, reducing inter-experiment variability.
- Enables reproducible, scalable quantification of protein distribution for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on synaptic protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein distribution data with disease-relevant brain regions and subfields.
- Enables comparative studies across genetically modified or drug-treated animal models.
- Supports translational biomarker identification by quantifying protein heterogeneity at multiple anatomical levels.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative spatial protein data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment in CNS-focused R&D.
- Discovery Biology: Provides quantitative, region-specific protein distribution data for hypothesis-driven target validation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging outputs suitable for assay development and compound screening.
- Analytics: Generates ratio-based fluorescence measurements for robust statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-model and cross-condition analyses.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable workflow for diverse tissues, antibodies, and imaging platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of protein localization studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Depends on access to high-quality antibodies and advanced imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to various tissues, model systems, and imaging platforms with protocol optimization.
- Potential limitations include antibody specificity and photobleaching during imaging.
