Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Hier beschrijven we een protocol met immunofluorescentie, confocale microscopie en computergebaseerde analyse om de verdeling van synaptisch eiwit ten opzichte van een referentie-eiwit te bepalen. Onze methode omzeilt de inherente variabiliteit van immunofluorescentie vlekken met behulp van een verhouding in plaats van absolute fluorescentie niveaus. Daarnaast u met deze methode de heterogeniteit van eiwitdistributie op verschillende niveaus analyseren.

Van hele hersenschijfjes tot hersengebieden tot zelfs subgebieden zoals de verschillende lagen van de hippocampus. Deze techniek kan worden aangepast om de eiwitverdeling in andere weefsels dan de hersenen en modelsystemen dan muizen te bepalen. Begin met het wassen van eerder geïsoleerde en vaste muishersenen zoals beschreven in het manuscript.

Breng vervolgens de hersenen over naar een 15 milliliter reactiebuis met 30% sacharose 0,1 molaire PB. Om cryo te beschermen de hersenen uitbroeden op 4 graden Celsius voor 48 uur of totdat het zinkt. Daarna gebruik maken van een een scherp mes om de cryo beschermde hersenen trim, afhankelijk van het gebied van belang. Plaats vervolgens de hersenen in een cryo mal en voeg optimale snijtemperatuur compound in te bedden om ervoor te zorgen dat bellen te vermijden en de hersenen goed te oriënteren om een coronale vlak van snijden hebben.

Plaats de cryo schimmel in de min 80 graden Celsius vriezer totdat het is bevroren vast. Monteer het bevroren weefsel op de cryo microtome en wacht minstens 15 minuten voor sectie om het te equiliben tot de microtome temperatuur. Begin met het snijden van de hersenen in 25 micrometer dikke coronale plakjes.

Gebruik een glazen haak op de OKT van de eerste plak zorgvuldig zonder het aanraken van de hersenen weefsel. De OCT blijft aan de glazen haak plakken. Gebruik de glazen haak om de hersenen slice over te dragen in de eerste put.

Verzamel drie aangrenzende plakjes per put in een 24 goed plaat gevuld met 0,1 molaire PB. Bewaar de plakjes op vier graden celsius tot vlekken voor maximaal twee weken. Om de plakjes voor te bereiden op immuno vlekken gebruik maken van een plastic pipet om de PB-oplossing te verwijderen uit een put zonder tekening in de hersenen plakjes. Gebruik dan een 1000 micro liter pipet om 250 microliters van verse PB toe te voegen om ze te wassen van overtollige OCT.

Herhaal deze wasbeurt voor elke put op het moment om te voorkomen dat uitdrogen van de plakjes. Gebruik vervolgens een plastic pipet om de PB-oplossing uit de eerste put te verwijderen. Gebruik een 1000 microliter pipet toe te voegen 250 microliter van het blokkeren buffer per goed werkt goed door goed weer.

Broed de plaat drie uur lang op kamertemperatuur op een shaker. Voeg tijdens de incubatie 250 microliters antilichaambuffer per put toe aan een reactiebuis. Gebruik vervolgens een 2 microliter pipet om de juiste hoeveelheid antilichaam pipetting het direct toe te voegen in de oplossing en voorzichtig pipet op en neer meerdere malen te mengen.

Dan vortex dit verdunde antilichaam niet zeker goede mengen. Goed werken door goed verwijderen van de blokkering buffer met een plastic pipet en voeg 250 microliters van primaire antilichaam oplossing per goed. Incubeer de plaat op een shaker op vier graden celsius 's nachts.

De volgende dag verwijder de antilichaamoplossing met een plastic pipet. Was de plakjes met 300 microliters wasbuffer een per put drie keer tien minuten per wasbeurt op een shaker bij kamertemperatuur. Tijdens het wassen, werken in het donker, verdun de fluor voor een paar seconden antilichaam in een reactiebuis op dezelfde manier als eerder gedaan met het primaire antilichaam.

Na het wassen verwijder de wasbuffer met een plastic pipet en voeg 250 microliters secundaire antilichaamoplossing per put toe. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Na voltooiing van de incubatie verwijder de antilichaamoplossing met een plastic pipet.

Was de secties drie keer met wasbuffer twee op dezelfde manier als bij wasbuffer een. Tijdens deze wasverdunning DAPI vlek in 0.1 kies PB om een concentratie van één tot 2000 te bereiken. Voeg na het verwijderen van de wasbuffer van de plaat 250 microliters DAPI-oplossing toe en broed 5 minuten bij kamertemperatuur op de shaker.

Na het verwijderen van de DAPI oplossing met een plastic pipet gebruik maken van een 1000 microliter pipet om 500 microliter van 0,1 molaire PB per put toe te voegen. Plaats een microscoop dia onder een stereoscoop. Gebruik een fijne borstel om drie afzonderlijke druppels van 0,1 kies PB op de dia toe te voegen.

Plaats met het penseel één segment per druppel op de dia en vlak af en oriënteer de segmenten. Nadat alle plakjes correct zijn geplaatst, gebruikt u een papierweefsel om overtollige PB te verwijderen en voorzichtig te drogen zonder de plakjes volledig te drogen. Voeg vervolgens 80 microliters inbedding medium op de dia en zorgvuldig te dekken met een cover slip om de hersenen plakjes insluiten.

Bedek de dia's om blootstelling aan licht te voorkomen en laat ze te drogen in de rookkap voor een tot twee uur en sla ze in een microscoop dia doos op vier graden Celsius tot klaar voor confocale microscopie. Na het verwerven van virtuele weefsels van de hele hersenen slice voor verschillende kanalen zoals beschreven in het manuscript laden alle enkele kanalen of een afbeelding in FIJI door te klikken op bestand en vervolgens te openen. Gebruik vervolgens het gereedschap Vrije handselectie om één halfrond in het DAPI-kanaal af te bakenen.

Klik op bewerken en selecteer vervolgens en maak masker om een masker van het geselecteerde gebied te maken. Klik vervolgens op analyseren en meet vervolgens deeltjes om de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor enkele kanalen te bepalen. Zorg ervoor dat u afzonderlijke kanalen selecteert om de gemiddelde fluorescentieintensiteitswaarden voor elk kanaal te bepalen.

Kopieer daarna de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor de afzonderlijke kanalen in een spreadsheet. Om de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor de afzonderlijke kanalen in een gebied van belang te bepalen, wordt het gebied afbakend met het gereedschap vrije handselectie. Na het bevlekken met DAPI die vlekken kernen hersensecties hebben een punctate patroon en regio's met een hoge celdichtheid zijn helderder dan regio's met een lage celdichtheid.

Vlekken met Mover antilichaam bleek heterogene verdeling met heldere hot spot gebieden en dimmer gebieden in de hersenen waar als Synaptophysin bleek meer homogene verdeling. Een overlay van beelden toonde de differentiële verdeling van rode fluorescentie die wijst op Mover eiwit vergeleken groene fluorescentie die Synaptophysin aangeeft. Na kwantificeringsanalyse zijn fluorescentieintensiteitswaarden voor verschillende kanalen over de hemisferen en over de interessegebieden bepaald voor zowel Verhuizer als Synaptophysin.

Verhoudingen van de verhuizer fluorescentie waarden synaptophysine fluorescentie waarden tonen de heterogene verdeling van verhuizer met gebieden van hoge en lage Mover niveaus ten opzichte van Synaptische vesikels. Relatieve Mover overvloed de verhouding in een gebied van belang in vergelijking met die over de hele hemisfeer en vertaald in een percentage bleek hoeveel Verhuizer aanwezig is in een gebied van belang ten opzichte van het gemiddelde. Relatieve Mover overvloed werd bepaald voor verschillende lagen in de subvelden van de hippocampus.

De drie bezienswaardigheden worden gekwantificeerd door de verhouding in de respectieve lagen te vergelijken met de verhouding van het overeenkomstige halfrond. Deze procedure kan eenvoudig worden aangepast en gecombineerd met verschillende beeldvormingstechnieken zoals superresolutiemicroscopie om bovendien de subcellulaire verdeling van het eiwit van belang te bepalen. Deze techniek kan ook worden toegepast op verschillende modelsystemen, zoals genetisch gemodificeerde of met drugs behandelde dieren.

Dit kan een vergelijkende benadering mogelijk maken tussen verschillende experimentele omstandigheden of zelfs soorten.