Name: Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer een kwantitatieve immunofluorescentiemethode om synaptische proteïneverdeling in muizenhersenen te analyseren met behulp van confocale microscopie en FIJI-software. Deze techniek minimaliseert variabiliteit door fluoresceintensiteitsverhoudingen te gebruiken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Irmgard Weiss voor uitstekende technische bijstand. De auteurs erkennen ondersteuning via Hermes Pofantis en Andoniya Petkova. De auteurs bedanken ook het Europees Instituut voor Neurowetenschappen voor het gebruik van de LSM800 en de technische bijstand, met name door Dr. Nils Halbsgut. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit medisch centrum Göttingen. JSV erkent ondersteuning door het centrum voor Nanoscale microscopie en moleculaire fysiologie van de hersenen (CNMPB).

Dit protocol geen experimenten op levende dieren. Experimenten met euthanizing van dieren naar het verkrijgen van de hersenen monsters werden goedgekeurd door de bescherming van de dieren van de lokale autoriteiten (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) onder het goedkeuringsnummer T 10/30.
Opmerking: Voor dit protocol, 3 volwassen mannelijke C57BL/6 muizen werden gebruikt.
1. de monstervoorbereiding
<ol><li>Bereiden fixeer en 0,1 M fosfaatbuffer (PB; Zie tabel 1).</li>
	<li>Monteren van het dier door transcardial perfusie, zoals beschreven in Gage et al. 28. eerst wassen het bloed met 0,9% NaCl-oplossing, dan perfuse met 30 mL 4% paraformaldehyde (PFA).</li>
	<li>Open de schedel met een schaar en zorgvuldig het isoleren van de hersenen met behulp van een lepel met stompe randen om te voorkomen beschadiging van het weefsel.</li>
	<li>Vullen van een tube van 50 mL reactie met fixeer en de hersenen in 4% postfix PFA bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Verwijder de fixeer en wassen van de hersenen in 50 mL 0,1 M PB op een shaker voor 30 min.</li>
	<li>Na het wassen, Incubeer de hersenen in een 50 mL reactiebuis in 30% sacharose in 0,1 M PB gedurende 48 uur of totdat het zinkt in de buis bij 4 ° C voor cryoprotection.</li>
	<li>Versiering van de hersenen van cryoprotected met een scherp mes, plaatst u deze in een cryomold en insluiten met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde. Vermijd bellen. Oriënteren van de hersenen en het bevriezen van de cryomold in de vriezer-80 ° C.</li>
	<li>Monteer het bevroren weefsel voor segmenteren. Equilibreer het weefsel aan de cryomicrotome temperatuur gedurende ten minste 15 minuten voordat het segmenteren.</li>
	<li>Het gedeelte van de hersenen in 25 µm dik coronale plakjes. Raak de LGO zorgvuldig met een glas haak zonder het aanraken van het hersenweefsel. 3 aangrenzende segmenten per putje in een 24 goed bord verzamelen en bewaren ze in 0,1 M PB bij 4 ° C tot vlekken. Opmerking: Het protocol kan worden gepauzeerd hier voor maximaal twee weken. Langere opslag tijden kunnen interfereren met de kwaliteit van het weefsel en dus invloed op de uitkomst van het experiment.</li>
</ol>2. immunofluorescentie
<ol><li>Bereiden van oplossingen, waaronder de buffer met blokkerend, antilichaam buffer, wassen van de buffer 1 en wassen buffer 2 (Zie tabel 1).</li>
	<li>Spoel segmenten eenmaal met PB te verwijderen overtollige OCT.<ol>
<li>Verwijder de oplossing met een plastic pipet zonder zuigen in de segmenten van de hersenen. Voeg 250 µL van verse PB met een 1000 µL pipet. Let op: Segmenten moeten niet uitdrogen, dus verwijderen en toevoegen van vloeistoffen goed door goed.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder de PB met een plastic pipet en voeg 250 µL van buffer met blokkerend per putje met een 1000 µL pipet. Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (RT) op het schudapparaat.</li>
	<li>Tijdens de incubatietijd, Verdun de primaire antilichamen in antilichaam buffer in een reactiebuis. Gebruik van 250 µL antilichaam buffer per putje en voeg de juiste hoeveelheid antilichaam (Zie tabel 2) waarbij het direct in de oplossing met behulp van een precisiepipet 2 µL eveneens. Meng de oplossing door zachtjes op en neer meermaals pipetteren. Vortex kort daarna opgeven, zodat de juiste mengen. Opmerking: Om te bepalen van de achtergrond fluorescentie, technieken moet ook worden uitgevoerd zonder toevoeging van het primaire antilichaam. Incubeer het segment in antilichaam oplossing zonder primaire antilichamen volgens het protocol daarvoor.</li>
	<li>Nadat de incubatietijd, verwijdert u de buffer met blokkerend met een plastic pipet en voeg 250 µL van antilichaam oplossing met primaire antilichamen per putje. Incubeer segmenten met primair antilichaam 's nachts bij 4 ° C op een shaker.</li>
	<li>Volgende dag wassen de segmenten met het wassen van de buffer 1 3 x voor 10 min op RT op een shaker.<ol>
<li>Verwijder het medium met een plastic pipet en voeg 300 µL per putje buffer 1 te wassen. Incubeer bij RT gedurende 10 min. Herhaal 3 keer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdun de fluorophore-coupled secundaire antilichamen in antilichaam buffer in een reactiebuis tijdens de stappen wassen. Gebruik van 250 µL antilichaam buffer per putje en voeg de juiste hoeveelheid antilichaam (Zie tabel 2) waarbij het direct in de oplossing met behulp van een precisiepipet 2 µL eveneens. Meng de oplossing door zachtjes op en neer meermaals pipetteren. Vortex kort daarna opgeven, zodat de juiste mengen. Let op: Omdat de antilichamen lichtgevoelig zijn, moeten alle stappen vanaf dit punt worden uitgevoerd in het donker.</li>
	<li>Na het wassen stappen, verwijder het wassen met een plastic pipet buffer en voeg 250 µL van antilichaam oplossing met secundaire antilichamen per putje. Incubeer de plakjes met secundair antilichaam voor 90 min op de RT in het donker.</li>
	<li>Wassen van de segmenten met het wassen van buffer 2 3 x voor 10 min op RT.</li>
	<li>Tijdens de stappen wassen, Verdun 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 0,1 M PB in een concentratie van 1:2000.</li>
	<li>Verwijder de wassen buffer 2 met een plastic pipet en voeg 250 µL van DAPI oplossing per putje. Incubeer gedurende 5 min op RT op het schudapparaat.</li>
	<li>Verwijder de DAPI-oplossing met een plastic pipet en voeg 500 µL van 0,1 M PB per putje met een 1000 µL pipet.</li>
	<li>Segmenten op Microscoop-dia's koppelen.<ol>
<li>Plaats een microscoopglaasje onder de stereoscoop. Met een fijne borstel, voeg drie afzonderlijke druppels van 0,1 M PB in de dia verschijnt. Plaats één segment per druppel op het microscoopglaasje.</li>
		<li>Gebruik de fijne borstel afvlakken en oriënteren van de segmenten op het microscoopglaasje.</li>
		<li>Als alle segmenten correct zijn geplaatst, verwijderen van overtollige PB met een tissue en droog de dia zorgvuldig. Let op: Vermijd de segmenten van de hersenen volledig drogen.</li>
		<li>Voeg 80 µL van het medium in de dia insluiten. Zorgvuldig lager het dekglaasje aan in de dia verschijnt, waardoor de hersenen segmenten te embedding.</li>
		<li>Laat de dia's in de zuurkast gedurende 1-2 uur drogen (behandelen hen Voorkom blootstelling aan licht) en bewaar ze in een Microscoop dia doos bij 4 ° C. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. beeldvorming
<ol><li>Nadat het insluiten medium volledig gehard is, plaatst u het microscoopglaasje onder de confocal microscoop. Opmerking: Epifluorescence microscopie in combinatie met deconvolutie software moet soortgelijke beeldkwaliteit opleveren.</li>
	<li>De laser-instellingen aanpassen door vergroten of verkleinen van de intensiteit van de laser voor elk kanaal, zodat enkele pixels zijn overbelicht om ervoor te zorgen maximale verspreiding van grijze waarden.</li>
	<li>Verwerven van virtuele weefsels van het hele brein segment voor de verschillende kanalen.<ol>
<li>In de denkbaar software (Zie Tabel of Materials), selecteert u de optie van de tegels en het segment van de hersenen met de Tegel regio Setuphandmatig af te bakenen.</li>
		<li>Steunpunten in de hele regio tegel verspreiden en aanpassen van de focus voor de verschillende steunpunten door op te drukken Controleren of tegel regio's / posities...
</li>
		<li>Pas de instellingen in de Acquisitie modus volgens de gewenste resolutie en bestandsgrootte van de resulterende afbeelding en de scan starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de scan is voltooid, de Stitching functie gebruiken voor het verwerken van het virtuele weefsel. Het bestand exporteren als een TIF met de functie Afbeelding exporteren.</li>
</ol>4. computer-gebaseerde analyse
<ol><li>Alle interne kanalen voor één afbeelding in FIJI29 door te klikken op bestand laden | Open.</li>
	<li>Met het gereedschap Freehand bakenen een halfrond in de DAPI-kanaal. Maak een masker van de selectie door te klikken op bewerken | Selectie | Masker maken.</li>
	<li>Bepalen van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen (Mover en synaptophysin) door te klikken op analyseren | Maatregel. Opmerking: Zorg ervoor dat de verschillende kanalen om te bepalen van de gemiddelde fluorescentie intensiteitswaarden voor elk kanaal te selecteren.</li>
	<li>De intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen naar een werkblad kopiëren.</li>
	<li>Bepalen de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor de enkele kanalen in een gebied van belang door het gebied ook met het gereedschap Freehand selecteren uitgezet. Een muis hersenen atlas gebruiken als referentie.</li>
	<li>Herhaal stap 4.1-4.5 voor alle hemisferen en alle gebieden van belang. Opmerking: De waarden voor elk halfrond afzonderlijk bepalen om later vergelijken de waarden in een gebied van belang dat in het halfrond (zie stap 5.2).</li>
</ol>5. de gegevensverwerking
<ol><li>In het geval dat de achtergrond fluorescentie is hoog (Zie discussie), een achtergrond aftrekken nodig zou zijn. Daarvoor, bepalen de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde voor het segment worden verwerkt zonder primair antilichaam tegen het referentie-eiwit (hier: synaptophysin) en die waarde van alle waarden die zijn verkregen voor de hersengebieden en halfrond aftrekken.</li>
	<li>Wanneer de gemiddelde fluorescentie intensiteiten voor de enkele kanalen voor elke halfrond en elk gebied van belang zijn vastgesteld (Zie tabel 3), de Mover in verhouding tot de synaptophysin door de waarde voor de Mover te delen door de waarde voor synaptophysin (berekenen geel in tabel 3). Deze actie uitvoeren voor elk halfrond en elk gebied van belang afzonderlijk.</li>
	<li>Verdeel de verhouding voor een interessegebied verkregen door de verhouding tussen de verkregen voor het overeenkomstige halfrond (oranje in tabel 3) om te bepalen van de verhouding van het gebied van belang zijn voor het halfrond.</li>
	<li>Om te bepalen van de relatieve Mover overvloed, vertalen de verhouding tussen de verkregen in 5.2 in een percentage door haar afwijking van 1 (rood in tabel 3). Een ratio van 1,25 zou daarom een relatieve Mover overvloed van 25% boven het gemiddelde, en een verhouding van 0,75 een relatieve Mover overvloed van 25% onder het gemiddelde zou opleveren.</li>
</ol>

<ol><li>Wallrafen, R., Dresbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Presynaptic+Protein+Mover+Is+Differentially+Expressed+Across+Brain+Areas+and+Synapse+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58(2018).</li>
<li>Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+two+novel+Munc13+proteins+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain.</a> Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).</li>
<li>Rosenmund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Control+of+Vesicle+Priming+and+Short-Term+Plasticity+by+Munc13+Isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms.</a> Neuron. 33, 411-424 (2002).</li>
<li>Breustedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc13-2+differentially+affects+hippocampal+synaptic+transmission+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity.</a> Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).</li>
<li>Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Munc13+Proteins+Differentially+Regulate+Readily+Releasable+Pool+Dynamics+and+Calcium-Dependent+Recovery+at+a+Central+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Defined+Methodology+for+Reliable+Quantification+of+Western+Blot+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data.</a> Mol Biotechnol. , (2013).</li>
<li>Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+chemiluminescent+Western+blotting+Elimination+of+the+antibody+factor+by+dilution+series+and+calibration+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve.</a> Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).</li>
<li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).</li>
<li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).</li>
<li>Wilhelm, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+isolated+synaptic+boutons+reveals+the+amounts+of+vesicle+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins.</a> Science. 344, 1023-1028 (2014).</li>
<li>Navone, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+p38%3A+An+integral+membrane+protein+specific+for+small+vesicles+of+neurons+and+neuroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells.</a> Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).</li>
<li>Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Bassoon+and+Piccolo+in+Assembly+and+Molecular+Organization+of+the+Active+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).</li>
<li>Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+vesicular+glutamate+transporter+mRNA+in+rat+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus.</a> Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).</li>
<li>Chaudhry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vesicular+GABA+transporter%2C+VGAT%2C+localizes+to+synaptic+vesicles+in+sets+of+glycinergic+as+well+as+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).</li>
<li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Microscopic+Immunocytochemical+SAP-97+at+Postsynaptic%2C+Presynaptic%2C+and+Nonsynaptic+Sites+of+Adult+and+Neonatal+Rat+Visual+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex.</a> Synapse. 257, 239-257 (2001).</li>
<li>Valtschanoff, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+NR2+Receptor+Subunit+in+Rat+Somatic+Sensory+Cortex+%3A+Synaptic+Distribution+and+Colocalization+With+NR1+and+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95.</a> Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).</li>
<li>Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSD-95+Is+Associated+with+the+Postsynaptic+Density+and+Not+with+the+Presynaptic+Membrane+at+Forebrain+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).</li>
<li>Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+A+Receptor+Trafficking-Mediated+Plasticity+of+Inhibitory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses.</a> Neuron. 70, 385-409 (2011).</li>
<li>Kirby, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirby%2C+M+%22Understanding+the+molecular+diversity+of+GABAergic+synapses%22">Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses</a>. 5, 1-12 (2011).</li>
<li>Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).</li>
<li>Heise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Localization+of+Shanks+to+VGLUT1-Positive+Excitatory+Synapses+in+the+Mouse+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).</li>
<li>Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+TGN38+to+the+trans-Golgi+network%3A+involvement+of+a+cytoplasmic+tyrosine-containing+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence.</a> Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).</li>
<li>Antonini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tprg%2C+a+gene+predominantly+expressed+in+skin%2C+is+a+direct+target+of+the+transcription+factor+p63%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).</li>
<li>Burre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+proteins+under+conditions+of+rest+and+activation%3A+Analysis+by+2-D+difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).</li>
<li>Kremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+is+a+novel+vertebrate-specific+presynaptic+protein+with+differential+distribution+at+subsets+of+CNS+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses.</a> FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).</li>
<li>Ahmed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mover+Is+a+Homomeric+Phospho-Protein+Present+on+Synaptic+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Körber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Presynaptic+Release+Probability+by+the+Vertebrate-Specific+Protein+Mover%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover.</a> Neuron. 87, 521-533 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, (2012).</li>
<li>Schneider Gasser, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+in+brain+sections%3A+simultaneous+detection+of+presynaptic+and+postsynaptic+proteins+in+identified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons.</a> Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , ACADEMIC PRESS. (2001).</li>
<li>Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Elimination+of+Background+Fluorescence+in+Formalin-Fixed+Human+Brain+Tissue+for+Immunofluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).</li>
<li>Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+retinol-binding+protein+in+rat+liver+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De methode hier beoogt het kwantificeren van de distributie van een proteïne van belang ten opzichte van de overvloed van een marker eiwit met een bekende verdeling gepresenteerd. Immunofluorescentie kleuring prima overweg met een hoge variabiliteit van kleuring intensiteiten tussen verschillende segmenten. De hier beschreven aanpak van de kwantificering omzeilt dit probleem door het bepalen van de verhouding van de proteïne van belang zijn voor het gemiddelde over het halfrond. Daarom verschillende kleuring intensiteite...

Communicatie tussen de neuronen gebeurt op gespecialiseerde contact sites synapsen genaamd. Synapsen bevatten een groot aantal verschillende eiwitten die orkestreren van synaptische transmissie. Sommige van deze eiwitten Toon een heterogene distributie in het zenuwstelsel en zijn niet aanwezig in elke synapse1. Een voorbeeld van een dergelijke eiwitten is Munc13, die bij het proces van de priming van synaptische vesikels betrokken is. Er zijn verschillende isoforms van Munc13, die zijn ongelijkmatig verdeeld in de hersenen2, en de aanwezigheid of de afwezigheid van specifieke isoforms kunt beïnvloeden op korte termijn synaptische plasticiteit en synaptische vesikel dynamics3, 4 , 5. Daarom is het van vitaal belang voor zitten kundig voor de aanwezigheid van verschillende synaptic eiwitten over hersengebieden identificeren.
De methoden van keuze voor kwantificering van synaptic eiwitten - tot dusver - zijn massaspectrometrie en westelijke bevlekken, in plaats van immunohistochemistry6,,7,,8,9. In sommige gevallen zijn verschillende methoden gebruikt als aanvulling op elkaar om te beoordelen van zowel het aantal en de lokalisatie van specifieke proteïnen (d.w.z.Wilhelm, et al.. 10). de methode we hier beschrijven voorziet de lokalisatie en de kwantificering van proteïnen van belang zonder de noodzaak van het gebruik van elke biochemische methode, gewoon dienst immunefluorescentie technieken. Een ander voordeel hier is dat de kwantificering kan worden gedaan over gebieden veel kleiner, verwezenlijkt en derhalve, meer specifiek, dan die door andere methoden. Echter moet men rekening houden dat een betrouwbare referentie-eiwit nodig is om te beoordelen van de verdeling van de proteïne van belang.
Fluorescerende vlekken door immunohistochemistry stelt ons in staat om routinematig de lokalisatie van eiwitten over hersengebieden alsook binnen verschillende neuronale compartimenten. Ter identificatie van de verschillende compartimenten, worden specifieke markers gebruikt. Typisch, antilichamen tegen synapsin en synaptophysin11 kunnen worden gebruikt om te etiketteren van synaptische vesikels, terwijl antilichamen tegen fagot label de actieve zone van een presynaptische terminal12. Vesiculaire vervoerders, zoals de vesiculaire glutamaat vervoerders (vGluT) of vesiculaire GABA vervoerder (vGAT), worden gebruikt voor het label excitatory13 en remmende14 presynaptische terminals, respectievelijk. Aan de postsynaptisch kant, kunnen antistoffen tegen het eiwit Homer worden gebruikt om te markeren postsynaptisch terminals en antilichamen tegen postsynaptisch dichtheid eiwit 95 (PSD95)15,16,17 of gephyrin18 , 19 , 20 kan respectievelijk excitatory of remmende postsynaptisch terminals, label. Met behulp van antilichamen tegen een proteïne van belang en markeringen zoals degene hierboven beschreven, kan men de lokalisatie van dergelijke eiwitten bepalen. Veel studies tot nu toe hebben gedaan in een kwalitatieve wijze21. Echter om te bepalen op een betrouwbare manier de differentiële verdeling van een specifieke synaptic proteïne, moet een niet alleen bepalen de aanwezigheid of afwezigheid maar ook haar relatieve concentratie. De heterogeniteit van grootte en bevolkingsdichtheid van synapsen is het belangrijk om een verhouding tussen de synaptische markering en de proteïne van belang. Anders, synapse-rijke regio's zoals de niet-piramidale lagen van de hippocampus en de moleculaire laag van het cerebellum zal tonen een hoge dichtheid van synaptic eiwitten, alleen als gevolg van de hogere dichtheid van synapsen maar niet als gevolg van een sterke aanwezigheid van deze eiwitten in elke synapse (b.v., Wallrafen en Dresbach1). Aan de andere kant, zal eiwitten in de neuronale soma (b.v., TGN3822) meestal sterke aanwezigheid in de hippocampal piramidale cellaag of hippocampal of cerebellaire submodule cellaag vanwege de hoge concentratie van neuronale cel organen weergeven in die gebieden. Deze niet-homogene verdeling van structuren, synapses daarom in dit geval, kan leiden tot een valse raming van de verdeling van de proteïne van belang zelf. Bovendien is er een intrinsieke variabiliteit in intensiteiten in verschillende steekproeven in technieken immunohistochemische kleuring. Het protocol beschreven hier houdt dit rekening en vermijdt dergelijke vooroordelen, evenals andere beperkingen die voortvloeien uit de immunohistochemische methoden.
In onze recente studie, wij hebben gebruikte deze methode voor het beschrijven van de differentiële expressie van Mover (ook wel TPRGL23 SVAP3024) over 16 verschillende hersenen gebieden1. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke synaptic eiwit dat kan worden gevonden in associatie met synaptische vesikels en invloeden van de neurotransmitter release25,26,27. We hebben de Mover uitdrukking aan de overvloed van synaptische vesikels, gerelateerde door kleuring voor synaptophysin als merkstof referentie synaptic blaasje. We vonden de hoge niveaus van de Verhuizer van met name in de septal kernen, de ventrale pallidum en de amygdala. Binnen de hippocampus vonden we een heterogene verdeling van de Mover, met hoge niveaus in de lagen die zijn gekoppeld aan de intra-hippocampal berekening, en lage niveaus in de input- en output lagen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL reactiebuisjes</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>50 mL reactiebuisjes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>multiwell 24 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;

kwantificeren van de heterogene verdeling van een synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

De aanwezigheid, afwezigheid of niveaus van specifieke synaptic eiwitten kunnen ernstige synaptische transmissie beïnvloeden. Naast het ophelderen van de functie van een eiwit, is het belangrijk om ook de verdeling ervan. Hier beschrijven we een protocol met immunofluorescentie, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse om te bepalen van de verdeling van de synaptische proteïne verhuizer (ook wel TPRGL of SVAP30 genoemd). We vergelijken de verdeling van de Mover met die van de synaptische vesikel eiwit synaptophysin, waardoor het bepalen van de verdeling van de Mover op een kwantitatieve manier ten opzichte van de overvloed van synaptische vesikels. Deze methode kan met name mogelijk worden uitgevoerd als u wilt toestaan voor de vergelijking van de verdeling van eiwitten met verschillende antilichamen of microscopen of over verschillende studies. Onze methode omzeilt de inherente variabiliteit van immunefluorescentie technieken door de opbrengst van een verhouding in plaats van absolute fluorescentie niveaus. De methode die we beschrijven, kunnen bovendien de onderzoeker voor het analyseren van de verdeling van een eiwit op verschillende niveaus: van hele hersenen segmenten hersengebieden aan verschillende deelgebieden in één hersenen gebied, zoals de verschillende lagen van de hippocampus of sensorische cortices. Verhuizer is een gewerveld dier-specifieke eiwit dat is gekoppeld aan de synaptische vesikels. Met deze methode, laten we zien dat de Mover is ongelijkmatig verdeeld over de hersengebieden, met hoge niveaus in het ventrale pallidum, de septal kernen en de amygdala en ook binnen één hersengebieden, zoals de verschillende lagen van de hippocampus.

Vertegenwoordiger kleuring patronen van verschillende markers te zien in Figuur 1. Het patroon is afhankelijk van de verdeling van het eiwit. Voorbeelden van vijf rostro-caudal niveaus worden weergegeven in kolommen (A)-(E). Een representatieve DAPI kleuring wordt weergegeven in de eerste rij: DAPI houdt vast aan het DNA van een cel en dus kernen zijn gekleurd. Dit resulteert in een punctate patroon. Regio's met een hoge celd...

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Hier beschrijven we een protocol met immunofluorescentie, confocale microscopie en computergebaseerde analyse om de verdeling van synaptisch eiwit ten opzichte van een referentie-eiwit te bepalen. Onze methode omzeilt de inherente variabiliteit van immunofluorescentie vlekken met behulp van een verhouding in plaats van absolute fluorescentie niveaus. Daarnaast u met deze methode de heterogeniteit van eiwitdistributie op verschillende niveaus analyseren.Van hele hersenschijfjes tot hersengebieden tot zelfs subgebieden zoals de verschillende lagen van de hippocampus. Deze techniek kan worden aangepast om de eiwitverdeling in andere weefsels dan de hersenen en modelsystemen dan muizen te bepalen. Begin met het wassen van eerder geïsoleerde en vaste muishersenen zoals beschreven in het manuscript.Breng vervolgens de hersenen over naar een 15 milliliter reactiebuis met 30% sacharose 0,1 molaire PB. Om cryo te beschermen de hersenen uitbroeden op 4 graden Celsius voor 48 uur of totdat het zinkt. Daarna gebruik maken van een een scherp mes om de cryo beschermde hersenen trim, afhankelijk van het gebied van belang. Plaats vervolgens de hersenen in een cryo mal en voeg optimale snijtemperatuur compound in te bedden om ervoor te zorgen dat bellen te vermijden en de hersenen goed te oriënteren om een coronale vlak van snijden hebben.Plaats de cryo schimmel in de min 80 graden Celsius vriezer totdat het is bevroren vast. Monteer het bevroren weefsel op de cryo microtome en wacht minstens 15 minuten voor sectie om het te equiliben tot de microtome temperatuur. Begin met het snijden van de hersenen in 25 micrometer dikke coronale plakjes.Gebruik een glazen haak op de OKT van de eerste plak zorgvuldig zonder het aanraken van de hersenen weefsel. De OCT blijft aan de glazen haak plakken. Gebruik de glazen haak om de hersenen slice over te dragen in de eerste put.Verzamel drie aangrenzende plakjes per put in een 24 goed plaat gevuld met 0,1 molaire PB. Bewaar de plakjes op vier graden celsius tot vlekken voor maximaal twee weken. Om de plakjes voor te bereiden op immuno vlekken gebruik maken van een plastic pipet om de PB-oplossing te verwijderen uit een put zonder tekening in de hersenen plakjes. Gebruik dan een 1000 micro liter pipet om 250 microliters van verse PB toe te voegen om ze te wassen van overtollige OCT.Herhaal deze wasbeurt voor elke put op het moment om te voorkomen dat uitdrogen van de plakjes. Gebruik vervolgens een plastic pipet om de PB-oplossing uit de eerste put te verwijderen. Gebruik een 1000 microliter pipet toe te voegen 250 microliter van het blokkeren buffer per goed werkt goed door goed weer.Broed de plaat drie uur lang op kamertemperatuur op een shaker. Voeg tijdens de incubatie 250 microliters antilichaambuffer per put toe aan een reactiebuis. Gebruik vervolgens een 2 microliter pipet om de juiste hoeveelheid antilichaam pipetting het direct toe te voegen in de oplossing en voorzichtig pipet op en neer meerdere malen te mengen.Dan vortex dit verdunde antilichaam niet zeker goede mengen. Goed werken door goed verwijderen van de blokkering buffer met een plastic pipet en voeg 250 microliters van primaire antilichaam oplossing per goed. Incubeer de plaat op een shaker op vier graden celsius 's nachts.De volgende dag verwijder de antilichaamoplossing met een plastic pipet. Was de plakjes met 300 microliters wasbuffer een per put drie keer tien minuten per wasbeurt op een shaker bij kamertemperatuur. Tijdens het wassen, werken in het donker, verdun de fluor voor een paar seconden antilichaam in een reactiebuis op dezelfde manier als eerder gedaan met het primaire antilichaam.Na het wassen verwijder de wasbuffer met een plastic pipet en voeg 250 microliters secundaire antilichaamoplossing per put toe. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Na voltooiing van de incubatie verwijder de antilichaamoplossing met een plastic pipet.Was de secties drie keer met wasbuffer twee op dezelfde manier als bij wasbuffer een. Tijdens deze wasverdunning DAPI vlek in 0.1 kies PB om een concentratie van één tot 2000 te bereiken. Voeg na het verwijderen van de wasbuffer van de plaat 250 microliters DAPI-oplossing toe en broed 5 minuten bij kamertemperatuur op de shaker.Na het verwijderen van de DAPI oplossing met een plastic pipet gebruik maken van een 1000 microliter pipet om 500 microliter van 0,1 molaire PB per put toe te voegen. Plaats een microscoop dia onder een stereoscoop. Gebruik een fijne borstel om drie afzonderlijke druppels van 0,1 kies PB op de dia toe te voegen.Plaats met het penseel één segment per druppel op de dia en vlak af en oriënteer de segmenten. Nadat alle plakjes correct zijn geplaatst, gebruikt u een papierweefsel om overtollige PB te verwijderen en voorzichtig te drogen zonder de plakjes volledig te drogen. Voeg vervolgens 80 microliters inbedding medium op de dia en zorgvuldig te dekken met een cover slip om de hersenen plakjes insluiten.Bedek de dia's om blootstelling aan licht te voorkomen en laat ze te drogen in de rookkap voor een tot twee uur en sla ze in een microscoop dia doos op vier graden Celsius tot klaar voor confocale microscopie. Na het verwerven van virtuele weefsels van de hele hersenen slice voor verschillende kanalen zoals beschreven in het manuscript laden alle enkele kanalen of een afbeelding in FIJI door te klikken op bestand en vervolgens te openen. Gebruik vervolgens het gereedschap Vrije handselectie om één halfrond in het DAPI-kanaal af te bakenen.Klik op bewerken en selecteer vervolgens en maak masker om een masker van het geselecteerde gebied te maken. Klik vervolgens op analyseren en meet vervolgens deeltjes om de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor enkele kanalen te bepalen. Zorg ervoor dat u afzonderlijke kanalen selecteert om de gemiddelde fluorescentieintensiteitswaarden voor elk kanaal te bepalen.Kopieer daarna de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor de afzonderlijke kanalen in een spreadsheet. Om de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor de afzonderlijke kanalen in een gebied van belang te bepalen, wordt het gebied afbakend met het gereedschap vrije handselectie. Na het bevlekken met DAPI die vlekken kernen hersensecties hebben een punctate patroon en regio's met een hoge celdichtheid zijn helderder dan regio's met een lage celdichtheid.Vlekken met Mover antilichaam bleek heterogene verdeling met heldere hot spot gebieden en dimmer gebieden in de hersenen waar als Synaptophysin bleek meer homogene verdeling. Een overlay van beelden toonde de differentiële verdeling van rode fluorescentie die wijst op Mover eiwit vergeleken groene fluorescentie die Synaptophysin aangeeft. Na kwantificeringsanalyse zijn fluorescentieintensiteitswaarden voor verschillende kanalen over de hemisferen en over de interessegebieden bepaald voor zowel Verhuizer als Synaptophysin.Verhoudingen van de verhuizer fluorescentie waarden synaptophysine fluorescentie waarden tonen de heterogene verdeling van verhuizer met gebieden van hoge en lage Mover niveaus ten opzichte van Synaptische vesikels. Relatieve Mover overvloed de verhouding in een gebied van belang in vergelijking met die over de hele hemisfeer en vertaald in een percentage bleek hoeveel Verhuizer aanwezig is in een gebied van belang ten opzichte van het gemiddelde. Relatieve Mover overvloed werd bepaald voor verschillende lagen in de subvelden van de hippocampus.De drie bezienswaardigheden worden gekwantificeerd door de verhouding in de respectieve lagen te vergelijken met de verhouding van het overeenkomstige halfrond. Deze procedure kan eenvoudig worden aangepast en gecombineerd met verschillende beeldvormingstechnieken zoals superresolutiemicroscopie om bovendien de subcellulaire verdeling van het eiwit van belang te bepalen. Deze techniek kan ook worden toegepast op verschillende modelsystemen, zoals genetisch gemodificeerde of met drugs behandelde dieren.Dit kan een vergelijkende benadering mogelijk maken tussen verschillende experimentele omstandigheden of zelfs soorten.

quantifying-heterogeneous-distribution-synaptic-protein-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

De overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd bij synapsen grote invloed op synaptische sterkte. Deze methode kwantificeert fluorescent gelabelde neurotransmitter receptoren in drie dimensies met single-synaps resolutie...

Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em&gt; C. elegans</em

This video demonstrates the immunofluorescence staining of a mouse brain slice to quantify the distribution of a specific presynaptic protein. The process involves blocking nonspecific sites, applying primary antibodies for the target protein and a reference marker, followed by secondary antibody labeling and nuclear counterstaining. The reference marker ensures accurate quantification by providing a consistent baseline, and the distribution of the presynaptic protein is analyzed across brain...

Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Source: Schönherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic...

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

Dit artikel illustreert hoe de expressie van neurotransmitterreceptoren kan worden gekwantificeerd en het patroon geanalyseerd op synapsen met geïdentificeerde pre- en postsynaptische elementen door een combinatie van virale transductie van optogenetische hulpmiddelen en de freeze-fracture replica immunolabeling techniek.

Gecombineerde optogenetische en Freeze-fractuur Replica immunokleuring Input-specifieke Regeling van glutamaatreceptoren in de Mouse amygdala Onderzoek

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Dit protocol beschrijft een methode voor het combineren van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en fluorescentie immunohistochemie (IHC) in zowel vers ingevroren als gefixeerde hersensecties van muizen, met als doel het bereiken van multilabel FISH en fluorescentie IHC-signaal. IHC richtte zich op cytoplasmatische en membraangebonden eiwitten.

Combinatie van multiplex fluorescentie in situ hybridisatie met fluorescerende immunohistochemie op vers ingevroren of vaste hersensecties van muizen

Dit protocol presenteert een robuuste, gedetailleerde methode om zeer zuivere synaptosomen, synaptische blaasjes en andere synaptische fracties uit het muizenbrein te verkrijgen. Deze methode maakt de evaluatie van synaptische processen mogelijk, inclusief de biochemische analyse van eiwitlokalisatie en -functie met compartimentale resolutie.

Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Leer een kwantitatieve immunofluorescentiemethode om synaptische proteïneverdeling in muizenhersenen te analyseren met behulp van confocale microscopie en FIJI-software. Deze techniek minimaliseert variabiliteit door fluoresceintensiteitsverhoudingen te gebruiken.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

Meer video's verkennen