Name: In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer in vitro testen om migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigde menselijke eerste-trimester trofoblastcellijnen te evalueren. Deze methoden bieden visuele en kwantitatieve inzichten in factoren die invloed hebben op trofoblastinvasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr Gil Mor voor het verstrekken van de Sw.71 cellen. Dit onderzoek werd gesteund door een Albert McKern Scholar Award naar S.W.

1. cel voorbereiding
<ol><li>Cellen in T-75 kolven in de media van de standaard groei bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid te handhaven. Opmerking: De cellen die worden gebruikt in deze experimenten werden de vereeuwigd eerste-trimester trofoblast cel lijnen Swan.71 (Sw.71) en HTR-8/SVneo9,10. De Sw.71 cellen werden onderhouden in DMEM/F-12 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 1,0 mM natrium pyruvaat 10 mM HEPES, 0.10 mM MEM niet-essentiële aminozuren, 100 eenheden/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. De HTR-8/SVneo cellen werden onderhouden in RPMI-1640 aangevuld met 5% warmte-geïnactiveerd FBS.</li>
	<li>De cellen om te repliceren, totdat ze 90-100% samenvloeiing toestaan. Met behulp van een steriele weefselkweek stroom capuchon, gecombineerd de media van de kolf en wassen cellen met 10 mL steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>De PBS gecombineerd en voeg 5 mL 1 x (0,05%) trypsine-EDTA aan de kolf, ervoor te zorgen dat de cellen door trypsine worden gedekt. Plaats de kolf in de incubator van de laboratorium bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gehandhaafd totdat alle cellen hebben losgemaakt van de bodem van de kolf (ongeveer 5-10 min).</li>
	<li>Voeg 10 mL van voorverwarmde groei media aan op de maatkolf om te schakelen van de trypsine-EDTA.</li>
</ol>2. Kras Assay
<ol><li>Volgende stap 1.4, zaad het juiste aantal cellen in een 24-well plaat om 100% samenvloeiing in 48u. Opmerking: Het is mogelijk om uit te voeren van de kras bepaling met een verscheidenheid van verschillende plaat lay-outs. Het maximum aantal wells toegestaan door de wond maker tool is een 96-Wells-indeling.</li>
	<li>De volgende dag (dag vóór kras assay), media omzetten in fenol-rood mediagroep aangevuld zoals vereist, met inbegrip van warmte-geïnactiveerd, houtskool dextran-ontdaan FBS. Opmerking: Andere studies hebben aanbevolen het gebruik van media met lage concentratie FBS (bijvoorbeeld, 1%) tot een minimum beperken celproliferatie, die kan worden gebruikt als een alternatief in dit protocol11.</li>
	<li>Op de dag van de kras assay, voorbehandeling cellen gedurende 30 minuten door toevoeging van de gewenste behandeling aan de media in elk putje. De geschetste experimenten gebruikt voertuig (1 x PBS) en 100 nM dexamethason in 1 x PBS is verdund.</li>
	<li>
Plaats om te maken van uniforme wonden, steriele 10 µL Pipetteer tips over de pinnen van de wond maker tool. Lager de tips in de eerste rij van putten en de plaat langs het spoor van de maker van de wond te verplaatsen totdat de pipet tips bij de andere kant van de put.
	<ol>
<li>Verplaats de plaat terug naar de uitgangspositie, waardoor de pipet tips om voortdurend het aanraken van de onderkant van de plaat om een constante gewikkeld over de diameter van de put. Verwijderen en vervangen van de steriele 10 µL Pipetteer tips en lager de tips in de volgende rij van putten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal stap 2.4 totdat alle putjes worden gekrast. Opmerking: Als een wond maker hulpprogramma niet beschikbaar is, kunnen wonden worden gemaakt door het midden van de putjes met een uiteinde van de pipet 10 µL handmatig te schrapen.</li>
	<li>Zorgvuldig gecombineerd media en voorzichtig wassen cellen tweemaal met 1 x PBS. Na een laatste wassen, voeg aangevuld fenol-rood gratis, gestripte of lage-FBS media met gewenste behandeling of voertuig (zoals aangegeven in stap 2.3). Opmerking: HTR-8/SVneo cellen moeten worden gewassen met aangevuld fenol-rood media, zoals cellen om los te wassen met 1 x PBS zal veroorzaken.</li>
	<li>Plaats de plaat van de 24-well met krassen putten in de geautomatiseerde, time-lapse imager (Zie Tabel van materialen) gehuisvest in een laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid. Afbeelding wells met regelmatige tussenpozen zoals nodig om cellen te voltooien wondgenezing (bijvoorbeeld elke 2 h gedurende 72 uur).</li>
	<li>Berekenen van de dichtheid van de wond en de breedte van de software gekoppeld aan de geautomatiseerde, time-lapse imager (Zie Tabel van materialen). Voor het berekenen van de procentuele verandering in de wond omvang ten opzichte van de grootte van de startende wond, de wond breedte instellen op moment 0 gelijk aan 100%. Verdeel de grootte van de wond in elke latere timepoint door de grootte van de wond op moment 0 en vermenigvuldig met 100 om het percentage (Figuur 1).</li>
</ol>3. invasie Assay
<ol><li>Volgende stap 1.4, zaad het juiste aantal cellen in 6-Wells-platen om cellen te bereiken van 90% samenvloeiing in 48 h. behouden cellen in een laboratorium incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid.</li>
	<li>De volgende dag, media omzetten in fenol-rood mediagroep aangevuld zoals vereist, met inbegrip van warmte-geïnactiveerd, houtskool dextran-ontdaan FBS. Opmerking: Cellen kunnen op dit moment afhankelijk van de proefopzet worden voorbehandeld.</li>
	<li>Op dit moment, plaats de flacon van de extracellulaire matrix van 10 mg/mL (Zie Tabel van materialen) op ijs, en laat het ontdooien in de koelkast 's nachts.</li>
	<li>De volgende dag, vooraf cool invasie assay levert door het plaatsen van 24-Wells-platen, cultuur van de cel wordt ingevoegd, microcentrifuge buizen en Pipetteer tips in de koelkast (4 ° C) gedurende ten minste 2 uur voorafgaand aan het werken met de extracellulaire matrix.</li>
	<li>Met behulp van gekoeld leveringen in de weefselkweek kap, Verdun 10 mg/mL extracellulaire matrix 1:1 met fenol-rood-vrije, serumvrij media aan een definitieve concentratie van 5 mg/mL. Opmerking: Houd altijd de voorraad en verdunde extracellulaire matrix op ijs. De verhouding van de extracellulaire matrix media kan worden aangepast op basis van de eigenschappen van de cellijn gebruikt in de test.</li>
	<li>Met behulp van gekoeld leveringen in de weefselkweek kap, 100 μl van verdunde extracellulaire matrix aan de inserts (Zie Tabel van materialen) die zijn geplaatst in de 24-well plaat toevoegen. Zorg ervoor dat de matrix niveau zonder enige bubbels. Plaats de plaat van de 24-well met matrix beklede inzetstukken in de incubator bij 37 ° C om de matrix te verharden.</li>
	<li>Om prep voor invasie assay cellen, cellen met 1 mL 1 x PBS wassen, gecombineerd de PBS en 500 µL van 1 x trypsine-EDTA toevoegen aan elk putje. Plaats de 6-well plaat in de incubator van de laboratorium bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gehandhaafd totdat alle cellen hebben losgemaakt van de bodem van de plaat.</li>
	<li>Zodra de cellen hebben losgemaakt, voeg 500 µL van fenol-rood-vrije, serumvrij media aan elk putje van de trypsinized cellen.</li>
	<li>Overdracht van 1.000 µL van vrijstaande cellen microcentrifuge buis en spin down voor 5 min bij 400 x g bij 4 ° C.</li>
	<li>Gecombineerd media en resuspendeer de cellen in fenol-rood-vrije, serumvrij media (volume is afhankelijk van de concentratie van cellen). Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter (Zie Tabel van materialen) en het volume van de celsuspensie voor een eindconcentratie van 5 x 105 cellen per mL. Opmerking: Een hemocytometer en Microscoop kunnen ook worden gebruikt om de cellen tellen.</li>
	<li>600 μL van de volledige groei media toevoegen aan de putjes van de plaat 24-well die zal worden gebruikt voor de bepaling van de invasie. Opmerking: Extra chemoattractants of behandelingen kunnen worden toegevoegd aan het volledige groeimedium in de put (tweede kamer). De geschetste experimenten toegevoegd voertuig (1 x PBS) of 100 nM dexamethason verdund in 1 x PBS aan de tweede kamer.</li>
	<li>Plaats de vooraf gecoate invoegen in elk putje met volledige groeimedium, die zal worden gebruikt voor de bepaling van de invasie. Voeg dan 200 μL van cellen op de top van elke vooraf gecoate cel invoegen (Hogerhuis) voor een totaal van 1 x 105 cellen. Opmerking: Als een negatieve controle voor deze test, kan een gelijk volume van fenol-rood-vrije, serumvrij media (zonder cellen) worden toegevoegd aan het Hogerhuis.</li>
	<li>Plaats 24-well plaat in het laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gedurende 24 uur. Opmerking: De incubatietijd van de 24 h is geoptimaliseerd voor de cellen van de trofoblast van vereeuwigd eerste-trimester en verdere tests kunnen worden verlangd dat het bepalen van de vereiste incubatietijd in andere cellijnen.</li>
	<li>Na overnachting incubatie, zuig de overige media van de bovenste en onderste kamer zonder verstoring van de extracellulaire matrix. Verwijder daarna voorzichtig de extracellulaire matrix en de niet-binnengevallen cellen van het bovenste gedeelte van de insert met een wattenstaafje, zwabberen zo vaak als nodig is om het verwijderen van de extracellulaire matrix.</li>
	<li>Wassen, elke plaats 3 x met 1 x PBS, PBS toevoegen aan de bovenste en onderste kamers van de put. Gecombineerd PBS na elke wasbeurt.</li>
	<li>Repareren van cellen die zijn gekoppeld aan de inserts door het plaatsen van inzetstukken in 100% ijskoude methanol gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Wash wordt 3 x met 1 x PBS en verwijderen PBS ingevoegd na de finale wassen. Vlek van de cellen die zijn gekoppeld aan de inzetstukken voor 10 min met 0,2% kristalviolet in 20% ethanol.</li>
	<li>3 x met gedeïoniseerd water spoelen en gecombineerd gedeïoniseerd water na de laatste wasbeurt.</li>
	<li>Hiermee voegt u gedurende 1 uur bij kamertemperatuur drogen. Met behulp van Tang en een scheermesje, zorgvuldig knip het onderste membraan van het donormateriaal en monteren op een glasplaatje met de onderkant naar boven. Toestaan montage media te drogen bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Het verkrijgen van ten minste 4 unieke beelden van binnengevallen cellen per monster met behulp van een lichte Microscoop met een doelstelling van 20 x. Het totale aantal cellen in elke afbeelding tellen en normaliseren van het aantal cellen te controleren van monsters en het uitzetten van gegevens (Figuur 2).</li>
</ol>4. de proliferatie Assay
<ol><li>Volgende stap 1.4, trypsinized cellen uit de kolf met behulp van een geautomatiseerde cel counter tellen en zaad in 6-Wells-platen op een bevolkingsdichtheid van 2 x 10,5 cellen per putje in standaard groei media.</li>
	<li>Plaats van cellen in een laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gedurende 4 uur of totdat de cellen hebben gehouden.</li>
	<li>Verandering media fenol-rood gratis media aangevuld zoals vereist, met inbegrip van warmte-geïnactiveerd, houtskool dextran-ontdaan FBS en toevoegen van de gewenste behandeling. De geschetste experimenten voertuig (1 x PBS) of 100 nM dexamethason verdund in 1 x PBS toegevoegd. Plaats de 6-Wells-platen in een laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid.</li>
	<li>Media verwijderen en vervangen door nieuwe media en behandeling elke 48 uur.</li>
	<li>Na 24, 48 of 72 uur behandeling, wassen van cellen met 1 mL 1 x PBS en 500 µL trypsine-EDTA toevoegen aan elk putje. Plaats 6-well plaat in de incubator tot cellen hebben losgemaakt van de plaat.</li>
	<li>Nadat u cellen hebt losgekoppeld van de plaat, toevoegen 500 µL van het aangevuld fenol-rood mediagroep trypsine deactiveren.</li>
	<li>5 µL van trypsinized cellen toevoegen aan 5 µL van Trypan blauw in een aparte buis en meng door pipetteren.</li>
	<li>Cellen van elk putje in tweevoud met behulp van een geautomatiseerde cel counter tellen.</li>
	<li>Het gemiddelde van het aantal cellen per putje op elk tijdstip en plot als een functie van de tijd (Figuur 3).</li>
</ol>

<ol><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+trophoblast+cell+differentiation%3A+Physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li>
<li>Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+placental+development+during+the+first+trimester%3A+implications+for+the+pathophysiology+of+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia.</a> Placenta. 21, S25-S30 (2000).</li>
<li>Norwitz, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+implantation+and+placentation%3A+laying+the+blueprint+for+pregnancy+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications.</a> Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).</li>
<li>Ness, R. B., Sibai, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+and+disparate+components+of+the+pathophysiologies+of+fetal+growth+restriction+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).</li>
<li>Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+growth+factors+and+signalling+pathways+controlling+human+trophoblast+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).</li>
<li>Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1-Mediated+Induction+of+PAI-1+Restricts+Invasion+of+HTR-8%2FSVneo+Trophoblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells.</a> Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).</li>
<li>Nadeem, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+Signals+through+Activin+Receptor-Like+Kinase+7+to+Inhibit+Trophoblast+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion.</a> The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).</li>
<li>Onogi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+inhibits+invasion+of+extravillous+trophoblast+cells+through+reduction+of+matrix+metalloproteinase+%28MMP%29-2+activation+in+the+early+first+trimester+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy.</a> Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).</li>
<li>Straszewski-Chavez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+a+novel+telomerase+immortalized+first+trimester+trophoblast+cell+line%2C+Swan+71%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71.</a> Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).</li>
<li>Graham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+first+trimester+human+trophoblast+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan.</a> Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+signaling+regulates+cell+invasion+and+migration+in+the+human+first-trimester+trophoblast+cell+line+Sw.+71%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71.</a> American Journal of Reproductive Immunology. , e12974(2018).</li>
<li>Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+red+in+tissue+culture+media+is+a+weak+estrogen%3A+implications+concerning+the+study+of+estrogen-responsive+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze procedure is gebaseerd op het gebruik van migratie en invasie testen als u wilt opnemen van het tarief van celproliferatie als een potentiële bijdrage aan gemeten verschillen in trofoblast cel beweging. Samen gebruikt, zijn deze in-vitrotests eenvoudige en effectieve methoden die kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de cellulaire routes die trofoblast migratie regelen. Zoals hierboven beschreven, kunnen cellen van de trofoblast worden behandeld met hormonen, cytokinen, groeifactoren of andere moleculen ...

Placenta ontwikkeling is een cruciale stap in de inrichting van de zwangerschap, zowel in moederlijke en foetale gezondheid beïnvloeden. De mechanistische basis waarmee dit gebeurt is echter niet volledig begrepen. Cel migratie is een belangrijke biologisch proces dat aan de totstandkoming en de functies van de placenta tijdens de zwangerschap bijdraagt. Na de implantatie van de blastocyst onderscheidt de trophectoderm in villous trophoblasts, die betrekking hebben op het oppervlak van de verdikte villi en zijn betrokken bij gas en nutriënten uitwisseling, en extravillous trophoblasts (EVTs), die migreren uit van de villi en de moeders decidua en therapieën1binnen te dringen. Migratie van de EVTs is essentieel voor het remodelleren van maternale spiraal slagaders en tot de oprichting van uteroplacental verkeer ter ondersteuning van de foetale groei2. Onvoldoende trofoblast invasie tijdens de zwangerschap leidt tot een abnormale ontwikkeling van de placenta en kan bijdragen aan zwangerschapscomplicaties zoals gestational hypertensie, pre-eclampsie, intra-uteriene groei beperking en vroeggeboorte3, 4. Inzicht in de factoren die invloed hebben op de beweeglijkheid van de trofoblast is daarom essentieel om het bepalen van de trajecten die nodig zijn voor normale placentation.
Trofoblast migratie wordt gecontroleerd door een complex netwerk van signalering van moleculen, met inbegrip van groeifactoren, cytokines, hormonen en angiogenic factoren5. Als gevolg van de beperkingen van het bestuderen van de placenta in vivo, vereeuwigd in-vitrotests gebruik te maken van menselijke trofoblast cel lijnen cruciaal zijn voor het identificeren van de factoren die aan de beweeglijkheid van de trofoblast bijdragen. Kras en invasie testen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van individuele moleculen trofoblast cel migratie6,7,en8kwantitatief te evalueren. Echter, terwijl nuttig om te onderzoeken hoe veranderingen in migratie kunnen worden veroorzaakt door wijzigingen in cel invasiviteit parallel, deze twee testen geen rekening met aanvullende mechanismen die aan de gewijzigde tarieven van cel migratie bijdragen kunnen. Verlagingen van het tarief van celproliferatie kunnen bijvoorbeeld resulteren in minder cellen beschikbaar zijn om te migreren.
Hier beschrijven we kwantitatieve in-vitro methoden voor de beoordeling van de trofoblast migratie met behulp van kras, celproliferatie, en cel invasie testen. In de scratch assay, een uniforme wond wordt gemaakt in een cel enkelgelaagde en de migratie van de cellen om het gat te vullen wordt gemeten door geautomatiseerde, time-lapse beeldvorming van de grootte van de wond en dichtheid van de cellen binnen de wond. De cel proliferatie bepaling is gebaseerd op de berekening van de verhouding tussen cellen op elk punt van de tijd in vergelijking met een bekende startende hoeveelheid cellen. In de cel invasie assay, cellen worden overgeënt bovenop een extracellulaire matrix beklede cel cultuur invoegen kamer (bijvoorbeeld Transwell) en het aantal cellen die via de extracellulaire matrix in reactie op de chemo-lokstof binnenvallen worden geteld.
De kras assay is een eenvoudige en effectieve tool die kan worden gebruikt om te bepalen hoe de verschillende omgevingsfactoren invloed op cel migratie. De proliferatie en invasie testen kunnen vervolgens worden gebruikt om te bepalen van de bijdrage van celproliferatie en invasiviteit aan algemene veranderingen in cel migratie. Gezamenlijk bieden deze gehaltebepalingen robuuste metingen van biologische processen die tot de beweeglijkheid van de cel bijdragen kunnen. Twee vereeuwigd eerste-trimester trofoblast-cellijnen werden gebruikt in de beschreven tests, de Swan.71 (Sw.71) en de HTR-8/SVneo9,10. Deze tests kunnen echter ook worden geoptimaliseerd voor gebruik in andere celtypen te identificeren van de belangrijkste modulatoren van cel migratie en invasie.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan blue stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB06021-00100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MEM non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>100 mM sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate transwell inserts</td><td>Corning</td><td>3422</td><td>Bevatten polycarbonaatfilters met een poriegrootte van 8 &mu;m</td></tr><tr><td>Charcoal dextran-stripped FBS</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-119</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9&alpha;-fluoro-16&alpha;-methyl-11&beta;, 17, 21-triol-3, 20-dione; &ge;98% TLC)</td><td>Steraloids</td><td>P0500-000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Ham&rsquo;s F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 24-well ImageLock Plates</td><td>Essen BioScience</td><td>4365</td><td>Als u het IncuCyte Zoom-beeldvormingssysteem gebruikt, zaait u cellen op IncuCyte ImageLock Plates. Deze platen hebben referentiemarkeringen op de bodem van de plaat die worden gebruikt als referentie voor herhaalde beeldvorming in een constant gezichtsveld.</td></tr><tr><td>IncuCyte software</td><td>Essen BioScience</td><td>2010A Rev2</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM systeem</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td>Scratch assay-beelden werden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van de vooraf ingestelde &ldquo;Scratch Wound&rdquo; parameters op het IncuCyte ZOOM-systeem. Andere time-lapse microscopen kunnen ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Matrigel Membrane Matrix</td><td>Becton Dickinson</td><td>356231</td><td>Met verminderde groeifactoren, fenolroodvrij</td></tr><tr><td>Micro Slides</td><td>VWR International, LLC</td><td>48311-7003</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin (10.000 eenheden/mL)/streptomycine (10.000 &micro;g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>151-40-122</td><td></td></tr><tr><td>Phenol-red free DMEM/Ham's F12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Semi-automatic wound maker tool</td><td>Essen BioScience</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester trophoblast cellijnen

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cel verkeer is een essentiële eigenschap van trophoblasts tijdens de ontwikkeling van de placenta en vroege zwangerschap. Het belang van goede trofoblast migratie en invasie wordt aangetoond door zwangerschap aandoeningen zoals pre-eclampsie en uteriene groei beperking, die verband houden met ontoereikende trofoblast invasie van de maternale therapieën. Helaas, onze inzicht in de mechanismen die de placenta ontwikkelt zich uit het migreren trophoblasts is beperkt. In vitro analyse van cel migratie via de kras assay is een nuttig hulpmiddel bij het identificeren van factoren die trofoblast trekkende capaciteit regelen. Deze bepaling alleen geeft echter geen definitie van de cellulaire veranderingen die leiden een gewijzigde cel migratie tot kunnen. Dit protocol beschrijft drie verschillende in-vitrotests die gezamenlijk worden gebruikt voor het evalueren van de trofoblast cel verkeer: de kras assay, de bepaling van de invasie en de bepaling van de proliferatie. De protocollen die hier beschreven kunnen ook worden aangepast voor gebruik in andere cellijnen te kwantificeren van cel mutatie in reactie op stimuli. Deze methoden kunnen onderzoekers individuele factoren die bijdragen tot de beweging van de cel en zorgen voor een grondig onderzoek van mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan de schijnbare wijzigingen in cel migratie te identificeren.

De cellijnen vereeuwigd menselijke eerste-trimester trofoblast Sw.71 en HTR-8/SVneo werden gebruikt in deze experimenten om de rol van glucocorticoïden in trofoblast cel migratie12. Glucocorticoïden werden gebruikt in deze experimenten, zoals zij onlangs is gebleken te wijzigen van de trofoblast functies, hoewel alternatieve behandelingen gebruikte12zou kunnen zijn. Beide cellijnen werden behandeld met voertuig (1 x PBS) of 100 nM van de syn...

Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Deze methoden kunnen worden gebruikt om factoren te bepalen die de trofoblaste invasie beïnvloeden die inzicht kunnen geven in belangrijke negatieve verloskundige resultaten. Het voordeel van deze techniek is dat het een visuele en kwantitatieve analyse van verschillende factoren die van invloed kunnen zijn trofoblast invasie met inbegrip van proliferatie en migratie. Om te beginnen met de scratch test, zaad het juiste aantal cellen in een 24-well plaat tot 100% samenvloeiing te bereiken in 48 uur.De volgende dag, verander de media in fenol rode vrije media aangevuld met warmte geïnactiveerde houtskool dextran gestript FBS. Op de dag van de kras, voeg de gewenste behandeling aan de media in elke put om de cellen voor te behandelen gedurende 30 minuten. Om uniforme wonden te maken, plaatst u steriele 10 microliter pipettips op de pinnen van het gereedschap van de wondmaker.Laat de uiteinden in de eerste rij putten zakken en beweeg de plaat langs het spoor van de wondmaker totdat de pipettetips de andere kant van de put bereiken. Beweeg de plaat vervolgens terug naar de uitgangspositie om een constante wond over de diameter van de put te garanderen. Laat de tips in de volgende rij putten en herhaal totdat alle putten zijn bekrast.Bevestig dat de kras de breedte van de put bedekt door de plaat onder een microscoop te observeren. Vervolgens, zorgvuldig aspirate de media en voorzichtig wassen van de cellen met 1x PBS tweemaal. Na een laatste wasbeurt, voeg aangevuld fenol roodvrij gestript of laag FBS-media toe met een gewenste behandeling.Plaats vervolgens de plaat met de bekraste putten in een geautomatiseerde timelapse imager gehuisvest in een incubator die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide bevat bij 95% luchtvochtigheid atmosfeer. Beeld de cellen op regelmatige tijdstippen als dat nodig is om cellen in staat te stellen wondgenezing te voltooien. Om te beginnen met de invasie test, zaad het juiste aantal cellen in zes-put platen in een incubator die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide onderhoudt op 95%vochtigheid atmosfeer.Laat cellen 90% samenvloeiing bereiken in 48 uur. De volgende dag, verander de media in fenol rode vrije media aangevuld met warmte geïnactiveerde houtskool dextran gestript FBS. Plaats een flesje van 10 milligram per milliliter extracellulaire matrix in een koelkast op ijs en laat 's nachts ontdooien.De dag erna gebruikt u gekoelde pipettips om 10 milligram per milliliter van de extracellulaire matrix te verdunnen met de fenolrode vrije serumvrije media tot een uiteindelijke concentratie van vijf milligram per milliliter. Voeg vervolgens 100 milliliter van de verdunde extracellulaire matrix toe aan gekoelde wisselplaten die in de gekoelde 24-putplaat zijn geplaatst. Broed de plaat uit op 37 graden Celsius om de matrix te laten uitharden.Om cellen voor te bereiden op de invasietest, was cellen met een milliliter 1x PBS. Dan aspirate de PBS en voeg 500 microliter van 1x Trypsin EDTA aan elke put. Plaats de zes-put plaat in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% vochtigheid atmosfeer handhaaft totdat alle cellen hebben losgemaakt van de onderkant van de plaat.Zodra de cellen zijn losgemaakt, voeg 500 microliters van de fenol rode vrije serum vrije media aan elke put van de trypsinized cellen. Breng vervolgens 1.000 microliter losse cellen over naar een microcentrifugebuis en spin gedurende vijf minuten naar beneden bij 400 keer g bij vier graden Celsius. Vervolgens, aspirate de media en resuspend de cellen in de fenol rode vrije serum vrije media.Tel cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en pas het volume van de celsuspensie aan voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 miljoen cellen per milliliter. Voeg 600 microliter van de volledige groeimedia toe aan elke put van de 24-putplaat en plaats de voorgecoate insert erin. Voeg vervolgens 200 microliter cellen toe bovenop elke voorgecoate celinvoegsel voor een totaal van 0,1 miljoen cellen.Plaats de 24-put plaat in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% luchtvochtigheid atmosfeer gedurende 24 uur onderhoudt. Na nachtelijke incubatie, zuig de resterende media uit de bovenste en onderste kamers zonder verstoring van de extracellulaire matrix. Verwijder vervolgens voorzichtig de extracellulaire matrix en niet-binnengevallen cellen uit het bovenste gedeelte van de wisselplaten met een wattenstaafje.Was elke insert drie keer door het toevoegen van 1x PBS aan zowel de bovenste en onderste kamers van de put. Aspirate PBS na elke wasbeurt. Om cellen aan de wisselplaten te bevestigen, plaatst u de wisselplaten gedurende 30 minuten in 100% ijskoude methanol bij vier graden Celsius.Was het drie keer met 1x PBS en verwijder PBS na de laatste wasbeurt. Bevlek de cellen die aan de wisselplaten zijn bevestigd met 0,2% kristal violet in 20% ethanol gedurende 10 minuten. Spoel met gedeïsized water drie keer en aanzuigen gedeïioniseerd water na de laatste wasbeurt.Luchtdroge inzetstukken bij kamertemperatuur gedurende een uur. Ten slotte met behulp van tangen en een scheermesje, zorgvuldig snijd het onderste membraan van de insert en monteer het op een glazen schuif met de onderkant naar boven. Met behulp van een lichtmicroscoop met een 20X-doelstelling, verkrijg ten minste vier unieke beelden van de binnengevallen cellen per monster.Gebruik om te beginnen met de proliferatietest, een geautomatiseerde celteller om de trypsinized cellen uit de kolf te tellen. Zaadcellen in zes-put platen met een dichtheid van 0,2 miljoen cellen per put in standaard groeimedia. Plaats vervolgens cellen in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% vochtigheid atmosfeer gedurende vier uur of totdat cellen hebben gehecht.Verander vervolgens de media in fenol rode vrije media aangevuld met warmte geïnactiveerde houtskool dextran gestript FBS en gewenste behandeling. Plaats de zes-put plaat in de couveuse die 37 graden Celsius temperatuur en 5% kooldioxide op 95% vochtigheid atmosfeer onderhoudt. Vervang vervolgens de media door de verse media aangevuld met de gewenste behandeling om de 48 uur.Na 24, 48 of 72 uur behandeling, was cellen met een milliliter van 1x PBS en voeg 500 microliter trypsin EDTA aan elke put. Plaats een zes-put plaat in de incubator totdat de cellen zijn losgemaakt van de plaat. Zodra cellen zijn losgemaakt van de plaat, voeg 500 microliters van de aangevulde fenol rode vrije media om Trypsin te deactiveren.Voeg ten slotte vijf microliters van de trypsinized cellen toe aan vijf microliter van Trypan Blue in een aparte buis en meng door pipetting. Gebruik een geautomatiseerde celteller om cellen van elke put in tweevoud te tellen. Vereeuwigd menselijke eerste trimester trophoblast Swan.71 cellen werden behandeld voor nul, acht en 18 uur met voertuig 1x PBS of 100 micromolar van de synthetische glucocorticoïde dexamethason in de scratch test. Meting van de wondgrootte en de wonddichtheid in Swan. 71- en HTR-8/SVneo-cellen die met een voertuig of 100 nanomolar dex zijn behandeld, toonden aan dat de dexbehandeling de wondsluiting verminderde, wat aangeeft dat glucocorticoïden de celmigratie kunnen remmen.Na de invasie test, glucocorticoïde behandeling verminderde cel invasie, zoals blijkt uit een 15%-vermindering van het aantal binnengevallen Swan. 71- en HTR-8/SVneo-cellen die gedurende 24 uur met 100 nanomolar dex zijn behandeld in vergelijking met met voertuigen behandelde cellen. Na de celproliferatietest verminderde de glucocorticoïde behandeling de celproliferatie, zoals aangegeven door minder Zwaan.71- en HTR-8/SVneo-cellen behandeld met 100 nanomolar dex in vergelijking met met voertuigen behandelde cellen. Methoden om celdood te evalueren kunnen worden gebruikt in combinatie met deze procedure om te bepalen of apoptose of necrose bijdragen aan veranderde trofoblastfuncties. We hebben uniek het gebruik van standaard technieken routinematig gebruikt in de kanker biologie voor de studie van trofoblast functie.Er zijn geen gevaren verbonden aan deze methoden. De enige voorzorgsmaatregel die kijkers moeten nemen is het gebruik van steriele techniek voor weefselkweek.

in-vitro-assays-to-evaluate-migration-invasion-proliferation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

Traditionele, tweedimensionale celcultuur technieken vaak resulteren in veranderde eigenschappen met betrekking tot de differentiatie markers, cytokines en groeifactoren. Drie-dimensionale celkweek in het draaiende celkweek systeem (RCC's) herstelt expressie van vele van deze factoren zoals hier afgebeeld met een extravillous trophoblast cellijn.

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het efficiënt siRNA transfectie van vers geïsoleerde menselijke villous cytotrofoblasten behulp microporatie en het identificeren van DNA-eiwitcomplexen in deze cellen. Getransfecteerde cellen kunnen worden gecontroleerd door Western blot en EMSA analyses gedurende de 4 dagen cultuurtijd.

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Hier gepresenteerd is een protocol voor bemonstering van menselijke placenta villous weefsel gevolgd door isolatie van de cytotrophoblasts voor primaire celculturen. Behandeling van trophoblasts met TNFα recapituleert ontsteking in de zwaarlijvige uteriene omgeving en vergemakkelijkt de ontdekking van moleculaire targets geregeld door een ontsteking in placentas met moeders obesitas.

Een Model van primaire menselijke Trophoblast te bestuderen van het Effect van ontsteking geassocieerd met moeders obesitas over regulering van Autophagy in de Placenta

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Het huidige protocol maakt het herstel mogelijk van buisachtige structuren die zijn gevormd in de klassieke in vitro angiogenese-buisvormingstest waarbij cellen, zoals trofoblastcellen, zich organiseren in capillaire structuren over een laag extracellulaire basaalmembraanmatrix. De teruggevonden structuren worden gebruikt voor RNA- en eiwitisolatie voor verschillende biochemische analyses.

Trofoblastcelherstel van angiogenese-buisvormingstest voor analyse van differentiatiemarkerexpressie

Dit protocol maakt zuivering, karakterisering en kweek mogelijk van primaire HLA-G+ extravilleuze trofoblasten (EVT) uit de decidua basalis en het chorionmembraan van menselijke termplacenta's. Primaire EVT-culturen behouden de levensvatbaarheid gedurende 96 uur, waardoor co-kweek met monster-gematchte moederlijke immuuncellen en daaropvolgende flowcytometrische en moleculaire analyse van hun interacties mogelijk is.

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Leer in vitro testen om migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigde menselijke eerste-trimester trofoblastcellijnen te evalueren. Deze methoden bieden visuele en kwantitatieve inzichten in factoren die invloed hebben op trofoblastinvasie.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen (Video) | JoVE Journal

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

Meer video's verkennen