Name: Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Leer zuivering en analyse van monoklonale antilichamen uit Chinese hamster ovariumcellen met een geautomatiseerd microbioreactorsysteem. Deze methode optimaliseert kwaliteitscontrole met minimale samplevolumes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Scott Lute bedanken voor de analytische ondersteuning die hij heeft verstrekt. Gedeeltelijke interne financiering en ondersteuning voor dit werk wordt geleverd door de CDER Critical Path Program (CA #1-13). Dit project wordt deels ondersteund door een aanstelling in het stage/Research participatie programma op het kantoor van biotechnologie producten, U.S. Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and education via een interagentuur overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van energie en FDA.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pharmaceutical+cGMPs+for+the+21st+Century%3A+A+Risk-Based+Approach%22">Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach</a>. , (2004).</li>
<li>New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm">https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm</a> (2015).</li>
<li>Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+Emergence+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies.</a> Circulation. 127, 2222-2230 (2013).</li>
<li>Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+clone+selection+using+high-throughput+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Advances in clone selection using high-throughput bioreactors.</a> Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).</li>
<li>Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+structural+modifications+of+immunoglobulin+G+and+their+effect+on+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+%26+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity.</a> Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).</li>
<li>Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+for+implementation+of+quality+by+design+%28QbD%29+for+biotechnology+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products.</a> Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).</li>
<li>International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ICH%22">ICH</a>. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+tools+for+characterizing+biopharmaceuticals+and+the+implications+for+biosimilars%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).</li>
<li>Velugula-Yellela, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+high-throughput+automated+microbioreactor+system+for+production+of+model+IgG1+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+liquid+chromatography-mass+spectrometry+methods+for+the+comprehensive+characterization+of+therapeutic+glycoproteins%2C+from+released+glycans+to+intact+protein+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).</li>
<li>Yang, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+correlation+between+charge+and+glycosylation+of+IgG1+variants+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).</li>
<li>Agarabi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Process+Parameter+Screening+Utilizing+a+Plackett-Burman+Design+for+a+Model+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Exclusion+Chromatography+with+On-Line+Light-Scattering%2C+Absorbance%2C+and+Refractive+Index+Detectors+for+Studying+Proteins+and+Their+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.</a> Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).</li>
<li>Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+ranibizumab+%28Lucentis%29+or+bevacizumab+%28Avastin%29+with+dexamethasone+and+triamcinolone+acetonide%3A+An+in+vitro+stability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).</li>
<li>Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high-molecular-weight+nonnative+aggregates+and+aggregation+kinetics+by+size+exclusion+chromatography+with+inline+multi-angle+laser+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Han, H., Livingston, E., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+profiling+of+charge+heterogeneity+in+antibodies+by+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).</li>
<li>Wheeler, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchip+zone+electrophoresis+for+high-throughput+analysis+of+monoclonal+antibody+charge+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).</li>
<li>Carrillo-Cocom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+consumption+in+naive+and+recombinant+CHO+cell+cultures%3A+producers+of+a+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).</li>
<li>Chen, P., Harcum, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+additions+on+ammonium+stressed+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells.</a> Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).</li>
<li>Xing, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+amino+acid+composition+of+CHO+cell+culture+media+for+a+fusion+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production.</a> Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+and+glucose+metabolism+in+fed-batch+CHO+cell+culture+affects+antibody+production+and+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).</li>
<li>Read, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentanomics+informed+amino+acid+supplementation+of+an+antibody+producing+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture.</a> Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).</li>
<li>Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A+chromatography+increases+monoclonal+antibody+aggregation+rate+during+subsequent+low+pH+virus+inactivation+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold.</a> Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).</li>
<li>Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+analysis+of+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Glycan analysis of therapeutic glycoproteins.</a> MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).</li>
<li>Wahl, O., Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+analysis+for+pharmacopoeial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes.</a> Talanta. 154, 150-163 (2016).</li>
<li>Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+quantitative+analysis+of+underivatized+amino+acids+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+%28LC-MS%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).</a> Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).</li>
</ol>

Deze publicatie weerspiegelt de standpunten van de auteur en mag niet worden geïnterpreteerd om de FDA-weergaven of-beleid weer te geven.

HCCF bevat puin en grote deeltjes die kostbare instrumentatie kunnen verstoppen en vernietigen, dus cultuur verduidelijking is nodig voor verdere downstream-verwerking. Centrifugeren is over het algemeen de eerste benadering van het scheiden van cellen en andere onoplosbare deeltjes uit eiwitten gevolgd door filtratie. Deze gefilterde HCCF wordt vervolgens onderworpen aan snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) voor zuivering. Zuivering van HCCF van geautomatiseerde microbioreactoren om het product te verkrijgen is een belangrijke stap in de downstream-verwerking. Hier wordt een tafel fplc-systeem met een eiwit kolom gebruikt om monoklonale antilichamen van de hccf te verkrijgen. Analyses voor upstream-processen kunnen nuttig inzicht bieden in Celgedrag en het ontwerp van Bioprocess begeleiden, waardoor een consistent en betrouwbaar kwaliteitsproduct wordt verkregen. Analytics stelt ons ook in staat kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te koppelen aan upstream-en downstream-processen. Hier zijn vier assays die vaak worden gebruikt bij de karakterisering van monoklonale antilichamen. Deze technieken zijn robuust, betrouwbaar en gemakkelijk inzetbaar voor proces-en productanalyse uit verschillende upstream bronnen die slechts gedeeltelijk gezuiverd zijn en nog steeds restniveaus van DNA en HCP kunnen bevatten.
Bij het opschonen van monsters voor analyse moet een belangrijk evenwicht worden gevonden tussen het creëren van een voldoende schoon te maken sample, waarbij de variabiliteit in de bioreactor behouden blijft. De twee meest voorkomende verontreinigingen die van invloed zijn op het product zijn DNA en HCP, die kunnen worden gecontroleerd door meting van de absorptie ratio bij 260/280 nm en via SDS-PAGE of μCE-SDS. De hier gepresenteerde assays zijn niet gevoelig voor lage niveaus van DNA-inhoud. De zuiverheid van het product is > 95% zuiver, zoals bepaald door μCE-SDS.
De charge-variant analyse met een microcapillair elektroforese systeem biedt een hoge doorvoer methode om Laad varianten te identificeren, met chips en reagentia die relatief eenvoudig te implementeren zijn. De aard van de techniek en de chemie van het etiketteer reagens zijn zowel gevoelig voor hulpstoffen als andere primaire aminen, waardoor voor de meeste monster matrixen een ontziltings-stap nodig is. Uit ervaring, lage niveaus van DNA co-migreren met de Free-Dye van de labeling reactie en hebben geen invloed op de kwaliteit van de resultaten. Hoewel de variabiliteit van basis-, hoofd-en zure piek kwantificering typisch < 1% is, kunnen hogere niveaus van DNA en andere verontreinigingen de variabiliteit van de assay verhogen. Het is uitermate belangrijk om consistent te zijn met de eiwit etikettering en ervoor te zorgen dat DMF snel wordt gebruikt na verwijdering uit de fles en vermengd met de kleurstof. Lysine en/of histidine normen worden aanbevolen als labeling besturingselementen. Na verloop van tijd en afhankelijk van de kwaliteit van het monster kunnen chips de coating op de microfluïdica-kanalen overtreding of verliezen, wat leidt tot meer ruis, de aanwezigheid van spook pieken en een grotere variatie in monster-to-sample. Om dit voorval te identificeren, werden blanco's en een standaard voor systeem geschiktheid (d.w.z. NISTmAb) gelijktijdig met de monsters geanalyseerd met regelmatige intervallen. Wanneer chip problemen ontstaan, kunnen de chips worden gewassen met de opslagoplossing of vervangen.
De methoden die worden gebruikt voor ontwikkelen-analyse van therapeutische glycoproteïnen betreft voornamelijk vloeistofchromatografie (LC) en/of massaspectrometrie (MS), waarbij lectine microarray-analyse aan populariteit wint als derde optie25. De in dit artikel beschreven methode maakt gebruik van zowel LC als MS, wat voordelen en nadelen heeft. Massaspectrometrische methoden hebben het voordeel van massale verificatie van de geanalyseerde glycans, wat niet mogelijk is met LC-gebaseerde methoden met behulp van een fluorescerende detectie-uitgang of lectine micro arrays. Deze methode gebruikt LC-en fluorescentiedetectie om ontwikkelen-identiteiten toe te wijzen met behulp van retentietijd vergelijking met een dextran-ladder standaard. Fluorescentie bewaking zorgt voor een verhoogde gevoeligheid en kwantificering door het gemak van de detectie, waarbij MS alleen niet in staat zijn om lage abundantie soorten te kwantificeren als gevolg van de slechte ionisatie-efficiëntie van oligosacchariden. De massa-informatie van MS wordt gebruikt om ontwikkelen-identiteiten te bevestigen, maar de verwerkingssoftware gebruikt geen massa-informatie als de primaire toewijzingscriteria. Vandaar, zonder reproduceerbare chromatografie en gemakkelijk te afwikkelen pieken, deze methode kan lijden met betrekking tot ontwikkelen toewijzingen. Gelukkig kan de massa-informatie helpen bij ontwikkelen-toewijzingen, zelfs in situaties waarin de chromatografie subpar is, zoals verschuivingen in de retentietijd die reproduceerbare ontwikkelen-toewijzingen belemmeren. Als deze methode zonder MS wordt gebruikt, moet de chromatografie zich op het hoogste niveau bevinden, aangezien massa-informatie niet kan worden gebruikt om te corrigeren voor tijd drift van verblijf.
De hier beschreven aminozuuranalyse methode gebruikt LC-MS voor snelle kwantificering van underivatized aminozuren in ruwe celkweek media. Alternatieve aminozuuranalyse methoden vereisen aminozuur bewerking agenten om UV-detectie in te schakelen26. De LC-MS-methode biedt belangrijke voordelen ten opzichte van de LC-UV-methode: het maakt identificatie mogelijk op basis van zowel de retentietijd als de ionen massa in tegenstelling tot de LC-UV-methode, die wordt beperkt door een gebrek aan massa karakterisering. Bovendien biedt de LC-MS-methode tijd-en reproduceer baarheids voordelen, aangezien de LC-UV-methode een tijdrovende Derivatiserings reactie vereist, die sample variabiliteit27kan veroorzaken. De injectie van ruwe celkweek media in de LC-MS-methode kan echter nadelige effecten op het MS-signaal veroorzaken als gevolg van het fouling van Ion skimmer. Een kalibratie ladder wordt regelmatig geïnjecteerd als een systeem geschiktheidscontrole, en sample order wordt gerandomiseerd om bias in de gegevens te voorkomen.
Het celkweek proces voor de productie van antilichamen met behulp van microbioreactoren wordt eerder beschreven9. In deze studie zijn gedetailleerde protocollen voor monoklonaal antilichaam karakterisatie methoden die de gegevens van beperkte monstervolumes maximaliseren, goed gedefinieerd. Beperkte hoeveelheden geoogste celkweek vloeistof kunnen soms de verkregen productinformatie beperken en de selectie van de juiste analytische procedures om productkwaliteits gegevens te verkrijgen is essentieel. Analytics zijn belangrijk om upstream-procesparameters te koppelen aan de wijzigingen in de productkwaliteit. Hier wordt een richtlijn gegeven voor gebruikers om mAbs te karakteriseren bij het werken met microbioreactoren.

Eiwit therapeuten worden gebruikt voor de behandeling van een groeiende verscheidenheid aan medische aandoeningen, met inbegrip van weefsel transplantatie complicaties, auto-immune aandoeningen, en kanker1. Sinds 2004 heeft de Amerikaanse Food and Drug Administration (USFDA) een toenemend aantal biologische licentie toepassingen (BLAs) gedocumenteerd van alle goedkeuringen gereguleerd door het Center for Drug Evaluation and Research (CDER), met BLAs accounting voor meer dan 25% in 2014 en 20152.
Gezien deze groeiende markt, worden biofarmaceutische fabrikanten uitgedaagd om snel meer product met consistente kwaliteit te leveren. Inspanningen om de productopbrengst te vergroten hebben zich geconcentreerd op CHO Cell engineering en productielijn screening, hoewel de belangrijkste verbeteringen zijn te wijten aan vooruitgang in de media/feed strategie optimalisatie en celcultuur milieu-controls1, 3 , 4 , 5 tijdens het fabricageproces.
Omdat mAbs worden geproduceerd in een biologisch systeem, kan er inherente eiwit variabiliteit zijn. De samenstelling van het antilichaam kan post-translationeel worden gewijzigd, zoals glycosylatie of beïnvloed door afbraak of enzymatische reacties. Deze structurele variaties kunnen veroorzaken gevaarlijke immuunreacties of ALTER antilichaam binding, die op zijn beurt kan verminderen of elimineren van de beoogde therapeutische functie5. Zo worden kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) van monoklonale antilichamen-N-glycan-profiel, Charge-variant verdeling en het percentage van antilichamen in monomerische vorm-regelmatig bewaakt en gecontroleerd als onderdeel van een Quality by Design (QbD)-benadering tijdens productieprocessen1,6. In een gereguleerde productieomgeving moeten therapeutische eiwitten voldoen aan acceptatiecriteria om in licentie te worden gegeven als een goedgekeurd handels geneesmiddel7. De hierin gepresenteerde methoden zouden doorgaans deel uitmaken van het kwaliteits karakterisatie proces voor een antilichaam7,8, en elke eiwit wetenschapper zal bekend zijn met hun gebruik.
In eerdere werkzaamheden9werd de toepassing en werking van microbioreactoren voor een hoge doorvoer screening van celkweek condities in upstream bioprocessing beschreven. Het gezuiverde product verkregen uit de wisselende media condities wordt onderworpen aan N-glycan-analyse met LC-MS. Glycosylatie patronen van therapeutische eiwitten kunnen worden gedetecteerd en gekarakteriseerd met behulp van LC-MS-technieken10,11, en de aanwezigheid van verschillende ontwikkelen-soorten is gekoppeld aan Bioprocess-parameters zoals voeder strategie, pH en temperatuur12. Het effect van de wisselende media omstandigheden op de productkwaliteit, aangegeven door het percentage van de resulterende IgG in monomerische vorm, wordt ook geëvalueerd met de grootte uitsluitings chromatografie-multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)13,14 , 15. het charge-variant profiel vertegenwoordigt een aantal wijzigingen van16 die van invloed kunnen zijn op de functie van een product. Microcapillaire zone elektroforese (mcze) is een techniek die een aanzienlijk snellere analysetijd biedt in vergelijking met traditionele Cation Exchange (Cex) chromatografie en capillaire ISO focus (CIEF) methoden die worden gebruikt voor de charge-variant analyse17 ,18. Verbruikte bioreactor media werd geanalyseerd om aminozuur consumptie tijdens de eiwitproductie te volgen, omdat het betrekking heeft op veranderingen in de identificerende attributen van het antilichaam19,20,21,22 , 23.
Met eiwitanalyse kunnen we kritieke procesparameters (Cpp's) identificeren op basis van de relaties tussen proces ingangen en veranderingen in Cqa's. Tijdens de ontwikkeling van Bioprocess demonstreert en meet Cpp's fundamenteel de procesbeheersing en zorgt ervoor dat het product niet is veranderd, wat essentieel is in sterk gereguleerde productieomgevingen. In dit document worden analytische technieken gepresenteerd om enkele van de biochemische kenmerken van het eiwit te meten die het meest relevant zijn voor product CQAs (N-glycan profiel, Charge varianten en grootte homogeniteit).

<table><tbody><tr><td>CHO DG44 Cell Line</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>Akta Avant 25</td><td>General Electric Life Sciences</td><td>28930842</td><td></td></tr><tr><td>Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin</td><td>Millipore Sigma</td><td>115115830</td><td>Purificatie stationaire fase</td></tr><tr><td>Omnifit 10cm Column</td><td>Diba Fluid Intelligence</td><td>006EZ-06-10-AA</td><td>Behuizing voor stationaire fase</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 10 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1113-81</td><td></td></tr><tr><td>&micro;Dawn Multi Angle Light Scattering Detector</td><td>Wyatt</td><td>WUDAWN-01</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m Millex GV Filter Unit PVDF Membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>10X Phosphate Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mL Syringe</td><td>Covidien</td><td>8881512878</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Binary Pump</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity DAD&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Sampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Thermostat</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Thermostatted Column Compartment</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Corning Inc.</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>150 uL Glass Inserts with Polymer Feet&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2088</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tube</td><td>Corning Inc.</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Plate</td><td>Bio-Rad</td><td>127737</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695072</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPA996-4</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC BSM</td><td>Waters Corporation</td><td>18601504612</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager</td><td>Waters Corporation</td><td>186015000</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC FLR Detector</td><td>Waters Corporation</td><td>176015029</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Amino Acid Standard, 1 nmol/&micro;L&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5061-3330</td><td></td></tr><tr><td>Amino Acid Supplement</td><td>Agilent Technologies</td><td>5062-2478</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis</td><td>Waters Corporation</td><td>186007081</td><td></td></tr><tr><td>Blue Screw Caps with Septa</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Chip</td><td>Perkin Elmer</td><td>760435</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Reagent Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS760670</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography Water (MS Grade)</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>20673</td><td></td></tr><tr><td>Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates</td><td>Waters Corporation</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample</td><td>Waters Corporation</td><td>176003712</td><td></td></tr><tr><td>GXII Buffer Tubes</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>697075- NC</td><td></td></tr><tr><td>GXII Detection Window Cleaning Cloth</td><td>VWR</td><td>21912-046</td><td></td></tr><tr><td>GXII HT Touch</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS138160</td><td></td></tr><tr><td>GXII Ladder Tubes</td><td>Genemate</td><td>C-3258-1</td><td></td></tr><tr><td>GXII Lint-Free Swab</td><td>ITW Texwipe</td><td>TX758B</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Intact mAb Mass Check Standard</td><td>Waters Corporation</td><td>186006552</td><td></td></tr><tr><td>Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm</td><td>Imtakt</td><td>WAA25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840274100</td><td></td></tr><tr><td>Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector</td><td>Wyatt</td><td>WTREX-11</td><td></td></tr><tr><td>Perchloric acid</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels</td><td>Labcon</td><td>1034-960-008</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder</td><td>Waters Corporation</td><td>186007982</td><td></td></tr><tr><td>Screw Top Clear Vial 2mL</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Iodide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383112</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L</td><td>Tosoh Biosciences</td><td>003449</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI Scientific Information System</td><td>Waters Corporation</td><td>667005138</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Manifold Shims</td><td>Waters Corporation</td><td>186007986</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Waters Corporation</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-ToF</td><td>Waters Corporation</td><td>186005597</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van chinese hamster ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd microbioreactor systeem

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn een van de meest populaire en goed gekarakteriseerde biologische producten die vandaag worden geproduceerd. Meestal geproduceerd met behulp van Chinese Hamster ovarium (CHO) cellen, cultuur en procesomstandigheden moeten worden geoptimaliseerd voor het maximaliseren van antilichamen Antilichaamtiters en bereiken van doel kwaliteit profielen. Deze optimalisatie maakt meestal gebruik van geautomatiseerde micro schaal bioreactoren (15 ml) om meerdere procescondities parallel te schermen. Optimalisatie criteria omvatten de cultuur prestaties en de kritische kwaliteitskenmerken (Cqa's) van het monoklonaal antilichaam (mAb) product, wat de werkzaamheid en veiligheid kan beïnvloeden. Cultuur prestatiestatistieken omvatten celgroei en nutriëntenconsumptie, terwijl de Cqa's de N-glycosylatie-en aggregatie profielen van mAb, de charge-varianten en het molecuulgewicht omvatten. Dit gedetailleerde protocol beschrijft hoe te zuiveren en vervolgens te analyseren HCCF monsters geproduceerd door een geautomatiseerde microbioreactor systeem om waardevolle prestaties metrische gegevens en outputs te krijgen. Eerst wordt een geautomatiseerde proteïne-A-methode voor snelle proteïne-vloeistofchromatografie (FPLC) gebruikt om de mAb te zuiveren van geoogste celkweek monsters. Eenmaal geconcentreerd, de ontwikkelen profielen worden geanalyseerd door massaspectrometrie met behulp van een specifiek platform (verwijzen naar de tabel van de materialen). Moleculaire gewichten en aggregatie profielen van antilichamen worden bepaald aan de hand van de grootte uitsluitings chromatografie-meervoudige hoek lichtverstrooiing (SEC-MALS), terwijl de charge varianten worden geanalyseerd met behulp van microchip capillaire zone elektroforese (mCZE). Naast de maatstaven voor cultuur prestaties die tijdens het bioreactor proces zijn vastgelegd (d.w.z. de levensvatbaarheid van de cultuur, het aantal cellen en de gemeenschappelijke metabolieten, waaronder glutamine, glucose, lactaat en ammoniak), worden verbruikte media geanalyseerd om de beperkende voedingsstoffen te identificeren Verbeter de voedingsstrategieën en het algehele procesontwerp. Daarom wordt ook een gedetailleerd protocol beschreven voor de absolute kwantificering van aminozuren door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) van verbruikte media. De methoden die worden gebruikt in dit protocol profiteren van platforms met hoge doorvoer die compatibel zijn voor grote aantallen kleine volumes.

De geoogste celkweek vloeistof uit de geautomatiseerde micro schaal bioreactor wordt gezuiverd met behulp van snelle eiwit vloeistofchromatografie (FPLC), zoals te zien in Figuur 1 en de kritische kwaliteitskenmerken van de gezuiverde eiwitten (CQAs) werden gekenmerkt door verschillende downstream analytische methoden. Dit is een belangrijk voordeel van het geautomatiseerde microbioreactor systeem; verschillen in CQAs kunnen snel worden beoordeeld in een breed scala aan voorwaarden. N-glycan-gegevens van met CHO geproduceerde mAbs die door massaspectrometrie worden verwerkt, moeten worden weergegeven als de chromatogrammen in Figuur 2. De figuur toont een vergelijking tussen twee chromatogrammen waaruit blijkt dat de mannose 5 piek (M5) uit één monster aanzienlijk lager is. Als er slechts een lawaaierige basislijn wordt waargenomen in plaats van pieken, kan dit betekenen dat de chromatografie-instelling defect is of dat de procedure niet lukt. Met behulp van besturingselementen, kan het oplossen van problemen worden vereenvoudigd. Beoordeel eerst de FLR toppen van de dextran ladder; Deze pieken geven aan dat het chromatografische systeem correct functioneert. Vergelijk vervolgens de experimenteel verkregen pieken met die verkregen uit een verwerkte intact mAb-standaard. Als pieken van de standaard zichtbaar zijn, maar er geen monster pieken worden geïdentificeerd, zijn de mAb-monsters niet correct verwerkt. Dit kan het gevolg zijn van SDS of nucleofiele aanwezigheid in de buffer die interfereert met N-glycan-labeling en-zuivering.
SEC-MALS kan worden gebruikt om twee Cqa's te beoordelen: het aggregatie profiel en het molecuulgewicht van het antilichaam. Een representatief SEC-MALS chromatogram is vergelijkbaar met dat van Figuur 3. De moleculaire massaverdeling en het absolute molecuulgewicht werden bepaald met behulp van de vereiste software met een extinctiecoëfficiënt van 1,37 mL * (mg * cm)-1 en een DN/dc van 0,185 ml/g. Als piek bellen en het instellen van de basislijn in de software handmatig wordt uitgevoerd, resultaten kunnen enigszins afwijken van gebruiker tot gebruiker. Het absolute molecuulgewicht van monomerische IgG1 uit Figuur 3 is 1,504 x 105 da ± 0,38% (blauw) en het hogere order complex is 7,799 x 105 da ± 3,0% (rood). De polydispersiteit van de aggregaten is veel groter dan die van het monomeer, zoals aangegeven door de rode molaire massaverdeling van piek 1 (Figuur 3). De kleine hoeveelheid van het monster en het belang van aggregatie als een CQA maken deze techniek een zeer waardevol aanvullend analytisch instrument voor het geautomatiseerde microbioreactor systeem.
Het resultaat van mCZE is een electropherogram, zoals in Figuur 4, dat het charge-variant profiel voor een monoklonaal antilichaam toont. Het profiel is een unieke handtekening voor het onderzochte eiwit en is zeer gevoelig voor de pH van het bedrijf. Ook zichtbaar is een vrije-kleurstof piek links van het charge-variant profiel. Bij het vaststellen van een bedrijfs pH is er enige discretionaire bevoegdheid voor de machinist om de resolutie en het signaal te balanceren; Bovendien moet de exploitant zorgen voor een goede scheiding van de vrije-kleurstof piek die op ~ 30 s wordt gemigreerd. Het monster kan na de etikettering worden ontleden om deze piek te verwijderen, hoewel dit leidt tot een significant verlies aan signaal. Zodra een operationele pH is vastgesteld, kunnen de monster profielen worden vergeleken. Hoewel het over het algemeen consistent is, kunnen veranderingen in de etiketterings efficiëntie of verschillen in hulpstoffen leiden tot kleine verschillen in de migratie van een monster en het charge-variant profiel waardoor electropherogrammen moeilijk te vergelijken zijn. In plaats daarvan is de vergelijkingsmethode meestal gebaseerd op de percentages basis-, hoofd-en zure soorten. In dit geval kunnen relatieve verschillen zo klein als 1-2% worden geïdentificeerd met behulp van mCZE.
Aminozuur verbruik kan worden gecontroleerd om te bepalen of uitputting veranderingen in CQAs veroorzaakt. Chromatogram uitlezingen van de massaspectrometer kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de succesvolle aanmaak van een ijkcurve voor de absolute kwantificering van aminozuren in ruwe bioreactor media monsters. Figuur 5 toont twee totaal ionen CHROMATOGRAMMEN (TIC) en één geëxtraheerd ionen chromatogram (xic) als representatieve resultaten tijdens dit proces. In Figuur 5Atoont de getoonde tic het achtergrond signaal van het buffersysteem omdat er slechts een water Blank werd geïnjecteerd. Figuur 5 B toont een representatieve tic van de aminozuur standaard waar, in vergelijking met het water blank, kleine pieken die overeenkomen met de individuele aminozuur soorten kunnen worden waargenomen (zoals lysine op 7,96 minuten). Om de piek te integreren en de kwantificering van het piek gebied (en dus de concentratie) te vergemakkelijken, wordt de XIC gebruikt waarbij alleen het signaal van een gedefinieerd "chromatogram Mass Window" wordt weergegeven. Afhankelijk van de gevoeligheid van het instrument en de kwaliteit van de chromatografische scheiding, zal het optimale massa venster door de gebruiker moeten worden bepaald. In dit voorbeeld (Figuur 5C) wordt de xic van lysine (m/z = 147,1144) met een massa venster van 10 ppm weergegeven waar lysine in het aminozuur standaard uit de kolom op 8,03 minuten afgaat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> Figuur 1 . Representatief chromatogram van het zuiverings schema met behulp van de snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC)-techniek. De fasen van de zuiveringsmethode die overeenkomen met volume (mL) worden gelabeld langs de x-as. De UV-extinctie bij 280 nm (mAU y-as, ononderbroken lijn) wordt gedurende de zuiveringscyclus bewaakt. Niet-specifiek gebonden onzuiverheden worden verplaatst door het verhogen van de geleidbaarheid (mS/cm y-as, onderbroken lijn) tijdens de hoge zout wassing. het antilichaam wordt van proteïne een kolom voorzien met de introductie van elutie buffer (conc B, gestippelde lijn) wanneer de pH daalt tot 4 (niet weergegeven). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> Figuur 2. Een representatief fluorescentie chromatogram dat is verkregen van gelabelde glycanen die massa zijn geverifieerd. De x-as is retentietijd (minuten), terwijl de y-as de signaalintensiteit is. De piek op 14,94 min vertegenwoordigt de mannose 5 (M5) glycan, waar een groot verschil tussen de sterkte van de M5 signaal kan worden waargenomen tussen de twee monsters die worden overgelegd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> Figuur 3. Moleculaire gewichtsverdeling van IgG1 monoklonaal antilichaam. Chromatogram van een intact IgG1 monoklonaal antilichaam, gescheiden door de grootte van de uitsluitings chromatografie in 1x PBS (pH 7.4). De extinctie wordt gecontroleerd bij 280 nm (zwart; linker as) en lichtverstrooiing en brekingsindex detectoren werden gebruikt om het absolute molecuulgewicht van elke piek (rood en blauw; rechter as) te berekenen. Hoog moleculair gewicht soorten worden aangeduid met de piek met het label "HMW". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> Figuur 4 . Charge-variant Profiel van een IgG1 monoklonaal antilichaam. Dit elektroferogram wordt gegenereerd op een mcze-platform. Een Free-Dye piek migreert op ~ 30 s en is goed gescheiden van de IgG1. Voor kwantificering werden pieken opgesplitst in basis-, hoofd-en zure soorten met behulp van instrument data analysis software. De rode lijn schetst de geïntegreerde piek gebieden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> Figuur 5. Representatieve resultaten van de ionchromatogrammen voor op massaspectrometrie gebaseerde aminozuuranalyse van ruwe bioreactor media. De x-as is tijd (minuten), terwijl de y-as signaalintensiteit (a) een water blank dient als de negatieve controle en onthult het achtergrond signaal waargenomen in de loop van de vloeistofchromatografie gradiënt (B) het aminozuur 225 pmol/μL Standaard wordt hier gebruikt als een positieve controle, aangezien de individuele pieken die in dit totale ionen chromatogram worden waargenomen de verschillende aminozuren vertegenwoordigen van de standaard mix die chromatografisch wordt opgelost (C) een representatief geëxtraheerd ionen chromatogram voor m /z 147,1144, dat is lysine. De 7,96 min piek in B komt overeen met de 8,03 piek in C van lysine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Dit protocol richt zich op de analyse van beperkte monsters verkregen uit microbioreactoren om essentiële informatie over de kritische kwaliteitskenmerken van de producten te extraheren. Een ander voordeel van deze technieken is dat ze minimale tijden van analyse gebruiken om de belangrijkste kenmerken te bepalen die de kwaliteitsparameters van het vervaardigde product dicteren. Demonstrerende procedure zijn David Powers, Talia Faison en Phillip Angart, onderzoekers van mijn laboratorium.Begin met het openen van de software die aan het zuiveringssysteem is bevestigd en plaats 15 milliliter conische buizen om het gezuiverde antilichaam eluaat en 50 milliliter conische buizen te verzamelen om de flow-through tijdens de hoge zoutwassing in de fractiecollector te verzamelen. Voeg vervolgens 0,22 micrometer porie gefilterde geoogste celcultuurvloeistof toe aan een lege spuit van 12 milliliter met een afgetopt mondstuk. Na het verwijderen van de dop plaatst u de spuitmond in de handmatige injectiepoort van het zuiveringssysteem.Draai de spuit om het op zijn plaats aan te draaien en druk de zuiger totdat het volledige volume van het monster is geïnjecteerd en is zichtbaar in de bijgevoegde 10 milliliter grote volume monster lus. Selecteer de opgeslagen methode en klik op Uitvoeren wanneer de instrumentsoftware daarom vraagt. Wanneer al het antilichaam is ontweken, neutraliseer het gezuiverde eiwit onmiddellijk met één molaire tris basis tot een pH van ongeveer 5,5.Om het gezuiverde antilichaam door centrifugatie te concentreren, plaatst u 100 kilodaltonfilters in filtraatopvangbuizen. Was de filters met 500 microliter dubbel gedestilleerd water en centrifuge vervolgens. Herhaal filterwas twee keer.Gooi na de tweede wasbeurt het filtraat weg en breng de gespoelde filters over naar nieuwe centrifugebuizen. Voeg vervolgens 500 microliter monster toe aan elk filter voor centrifugatie. Aan het einde van de spin, omkeren van het filter in een nieuwe collectie buis om het geconcentreerde monster te verkrijgen met een laatste centrifugatie.Verdun voor N-glycan-etikettering en isolatie 7,5 microliter van elk geconcentreerd antilichaammonster. Met 15,3 microliter vloeibare chromatografie massaspectrometrie of LCMS-grade water in één milliliter buizen uit de kit, en denatureren de antilichamen met zes microliters van een 5%-oplossing van een enzymvriendelijke en massaspectrometrievriendelijke oppervlakteactieve stof bij 90 graden Celsius gedurende drie minuten. Laat de monsters aan het einde van de denaturatie drie minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat ze 1,2 microliter peptide N-glycosidase F toevoegen voor een incubatie van vijf minuten bij 50 graden Celsius.Na het koelen van de monsters gedurende drie minuten tot kamertemperatuur, etiketteren de monsters met 12 microliter tl fluorescerende tagging reagens opgelost in watervrije dimethylformamide gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verdun aan het einde van de incubatie het gelabelde N-glycanmengsel met 358 microliters acetonitril en plaats een hydrofiele interactiechromatografieplaat in een vacuümspruitstuk met shims en afvalbak. Conditioneer de putten met 200 microliters water met het vacuüm aangepast aan 10 tot 15 kilopascals om ervoor te zorgen dat de vloeistof 15 tot 30 seconden duurt om door de hydrofiele interactiechromatografie hars te gaan.Equilibrate de putten met 200 microliter van 85%acetonitril gedurende 15 tot 30 seconden voor het laden van 400 microliters van elk gelabeld glycan mengsel op elke put, het toepassen van het vacuüm na elke nieuwe vloeistof wordt toegevoegd. Wanneer alle monsters zijn toegevoegd, was de hars twee keer met 600 microliter van 1%mierenzuur en 90% acetonitril per wasbeurt en vervang de afvalbak door 600 microliter inzamelbuizen. Ontwijk vervolgens de gelabelde N-glycanen met drie 30-microlitervolumes spectrometrie elutiebuffer en verdun de verdunningen van de pool met 310 microliter dimethylformamide in acetonitrile bemonsterd eluent.Voor het analyseren van de gelabelde N-glycan elutie monsters op een ultraperformance vloeibare chromatografie systeem gekoppeld aan een fluorescentie detector en viervoudige tijd van de vlucht massaspectrometer, gebruik 50 millimolar ammonium formaat en 100% LCMS rang acetonitril voor de mobiele fasen. Stel de initiële stroomsnelheid in op 0,4 milliliter per minuut, waarbij de LC-gradiënt tijdens de elutiefase steeds meer ammoniumforium biedt. Stel de fluorescentiedetector in om een excitatie van 265 nanometer en een emissie van 425 nanometer met een bemonsteringssnelheid van twee hertz te meten.Stel de viervoudige vluchttijd in op ms1-positieve ionengevoeligheidsmodus met een massabereik van 100 tot 2.000 Daltons, een scantijd van 0,25 seconden en een continuüm-gegevensverwerving. Laad vervolgens de monsters in de automatische sampler ingesteld op 10 graden Celsius en voer de geladen methode. Om een monster te desalt ter voorbereiding van de analyse van de ladingsvariant, klikt u de onderste stop van een ontziltingskolom van 0,5 milliliter, maakt u de bovenste stop kwijt en plaatst u de desaltingkolom in een centrifugebuis van 1,7 milliliter.Breng de nieuwe kolom in een nieuwe microcentrifugebuis en voeg 80 microliter van een 3,5 milligram per milliliter antilichaam oplossing aan de bovenkant van de kolom. Lijn de kolom uit op de oorspronkelijke afdrukstand en centrifugeren de kolom. Gooi vervolgens de desaltingkolom weg en meng het geconcentreerde monster grondig.Verdun het monster tot een concentratie van twee milligram per milliliter in 25 microliter ultrazuiver water in een enkele put van een 96-putplaat en voeg vijf microliters labelbuffer en vijf microliter van het etiketteren van reagens toe aan de put. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, meng 60 microliters reagenswater met het monster en bedek de plaat met een plaatafdichting voor centrifugatie. Om de laadvariantchip voor te bereiden, verwijdert u de opslagoplossing en wast u de putten één, drie, vier, zeven, acht en tien met water.Vervang het water door pH 7.2 lopende buffer en voeg 750 microliter van lopende buffer aan de bufferbuis toe. Druk op De Plaat van het ontlaad op de gebruikersinterface van het instrument en verwijder de verbinding van de 96-putplaat. Plaats de plaat en bufferbuis in de aangegeven plekken op de GX2-monsterlade en druk op Load Plate.Plaats de chip in de chipkamer, sluit het deksel op de chipkamer, selecteer de HT-eiwitladingvariant test wanneer daarom wordt gevraagd en klik op Uitvoeren. Zuivering van de geoogste celkweek monster uit de geautomatiseerde microschaal bioreactor door snelle eiwit vloeibare chromatografie maakt de karakterisering van de kritische kwaliteit attributen van de gezuiverde eiwitten door middel van verschillende downstream analytische methoden, zoals aangetoond. N-glycan gegevens van Chinese hamster eierstok geproduceerde monoklonale antilichamen verwerkt door massaspectrometrie moeten lijken op deze representatieve chromatogrammen.Grootte uitsluiting chromatografie meerdere hoek lichtverstrooiing kan worden gebruikt om de aggregatie profiel en moleculair gewicht van het antilichaam te beoordelen. De kleine hoeveelheid monster en het belang van de aggregatie zijn kritische kwaliteitskenmerken om van deze techniek een zeer waardevol aanvullend analytisch instrument te maken voor het geautomatiseerde microbioreactorsysteem. Het resultaat van micro capillaire zone elektroforese is een elektroferogram en kan worden gebruikt om de lading variant profiel voor een monoklonale antilichaam, een unieke handtekening voor het eiwit wordt onderzocht dat zeer gevoelig is voor de operationele pH tonen.Aminozuur consumptie kan ook worden gecontroleerd om te bepalen of de uitputting veroorzaakt veranderingen in de kritische kwaliteit attributen van het antilichaam. Het is belangrijk om te zorgen voor een goede en efficiënte zuivering van het vervaardigde product, omdat de analytische stappen alleen kunnen worden uitgevoerd met een goed gezuiverd eiwit. Het product kan ook worden onderworpen aan peptide mapping en stabiliteit testen.Maar zodra het eiwit is gebruikt voor een karakterisering methode, het meestal niet kan worden gebruikt voor een ander. Deze technieken maken het mogelijk om producten te analyseren die zijn geproduceerd uit kleine volume- en bioprocessingscreeningplatforms met een hoge doorvoer om de invloed van bioprocessingparameters op de productkwaliteit te begrijpen. Sommige van deze technieken maken gebruik van geconcentreerd perchloorzuur, mierenzuur, N-dimethylformamide, die allemaal gevaarlijk zijn en zorgvuldig moeten worden behandeld tijdens het dragen van de juiste beschermende apparatuur.

purification-analytics-monoclonal-antibody-from-chinese-hamster-ovary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een high-throughput, geautomatiseerd platform van de productie cellijn ontwikkeling voor de productie van therapeutische eiwitten is beschreven. Uitvoering van de BD FACS Aria Cell Sorter, heeft CloneSelect Imager en Tecan Freedom EVO liquid handling systeem gedemonstreerd aanzienlijk toegenomen verwerkingscapaciteit in cellijn ontwikkeling met verbeterde cellijn kwaliteit en een hoge reproduceerbaarheid.

Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

This video demonstrates a technique to study the in vivo localization of tumor-specific antibodies in a mouse tumor xenograft model. Upon subcutaneously injecting cancer cells into mice for tumor formation, fluorescently-labeled antibodies are injected that bind to tumor-specific receptors, enabling in vivo assessment of antibody localization via imaging.

A Technique to Assess the In Vivo Localization of Tumor-Specific Antibodies

The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Een geoptimaliseerd protocol wordt gepresenteerd voor de generatie van monoklonale antilichamen op basis van de hybridoma-technologie. Muizen werden geïmmuniseerd met een immunoconjugaat. Miltcellen werden gefuseerd door PEG en een elektrische impuls met onsterfelijke myeloomcellen. Antilichaam-producerende hybridoma-cellen werden geselecteerd door HAT en antigeen-specifiek ELISA-screening.

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige werking van 48 parallelle celculturen onder uiteenlopende omstandigheden in een systeem van microbioreactor wordt gepresenteerd. Proces van de cultuur van de cel, oogst en latere antilichaam titer analyse worden beschreven.

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Hier presenteren we een gedetailleerde procedure om een ontwerp van experiment uit te voeren in een geautomatiseerde micro-bioreactor gevolgd door celoogst en eiwitkwantificering met behulp van een Protein A-kolom.

Proces optimalisatie met behulp van high throughput geautomatiseerde micro-bioreactoren in de Chinese Hamster Eierstok celteelt

Het glycosyleringspatroon van een antilichaam bepaalt de klinische prestaties, dus industriële en academische inspanningen om glycosylatie te beheersen blijven bestaan. Omdat typische glyco-engineeringcampagnes tijd- en arbeidsintensief zijn, zou het genereren van een snel protocol om de impact van glycosyleringsgenen te karakteriseren met behulp van transiënte uitschakeling nuttig zijn.

Snelle antilichaamglycosengineering in ovariumcellen van Chinese hamsters

Dit protocol beschrijft hoe het Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS-cel) kan worden gebruikt om microbiële monoklonale isolatie, teelt en pluk uit te voeren. De MISS-cel bereikt een geïntegreerde workflow op basis van microfluïdische druppeltechnologie, die een uitstekende monodispersie van druppels, hoge parallelle teelt en detectie van biomassa met hoge doorvoer biedt.

Geautomatiseerde en high-throughput microbiële monoklonale teelt en plukken met behulp van het eencellige Microliter-druppel Culture Omics-systeem

Leer zuivering en analyse van monoklonale antilichamen uit Chinese hamster ovariumcellen met een geautomatiseerd microbioreactorsysteem. Deze methode optimaliseert kwaliteitscontrole met minimale samplevolumes.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem (Video) | JoVE Journal

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Meer video's verkennen