Een inductie systeem voor geclusterde stoma door suiker oplossing onderdompeling behandeling in Arabidopsis thaliana zaailingen
15 februari 2019
Het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe voor het opwekken van geclusterde stoma in zaadlobben van Arabidopsis thaliana zaailingen door onderdompeling behandeling met een suiker-bevattende middellange oplossing en hoe waarnemen van intracellulaire structuren zoals chloroplasten en microtubuli in de geclusterde guard cellen met behulp van confocale laser microscopie.
Deze methode heeft een belangrijke vraag beantwoord van de plantenontwikkelingsbiologie. Dat wil zeggen, wat is het belang van ruimtelijke verdeling van stomata? Ons inductiesysteem voor geclusterde stomata met behulp van sacharoseoplossing is vrij eenvoudig en direct toepasbaar op transgene of gemuteerde lijnen van Arabidopsis thaliana.
Voeg om te beginnen 1,1 gram Murashige-Skoog medium zouten en 15 gram sacharose toe aan een beker. Voeg 490 milliliter gedestilleerd water toe aan het bekerglas en meng met de roerstaaf. Gebruik kaliumhydroxide om de pH aan te passen aan 5,8.
Verdun vervolgens de oplossing met 500 milliliter gedestilleerd water en breng de verdunde oplossing over op een middelgrote fles. Daarna, autoclave de oplossing. Bereid de sterilisatieoplossing voor volgens het tekstprotocol.
Dan, werken onder aseptische omstandigheden, plaats ongeveer 50 transgene A.thaliana zaden die een fluorescerende marker in een 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens een milliliter van 70% ethanol toe aan de buis en meng door de buis vijf keer om te keren. Nadat de zaden naar de bodem van de buis zijn gezonken, verwijdert u de ethanol voorzichtig met een micropipet.
Voeg een milliliter sterilisatieoplossing toe aan de zaden en omker de buis vijf keer om te mengen. Verwijder voorzichtig de sterilisatieoplossing uit de zaden met een micropipet. Voeg vervolgens een milliliter steriel water toe.
Voeg 1,5 milliliter van de Murashige-Skoog oplossing toe aan elke put van een 24 putplaat. Voeg vervolgens twee gesteriliseerde zaden aan elke put. Met behulp van twee lagen parafilm, tape het deksel op de plaat.
Breng de plaat vervolgens over naar een groeikamer om 14 dagen te broeden. Breng eerst 30 microliters van Murashige-Skoog-oplossing over van de 24 putplaat naar het midden van een glazen glijbaan. Verwijder met behulp van een schaar de cotyledon uit een 14 dagen oude zaailing.
Zweef de cotyledon met de observatie kant naar boven op de daling van Murashige-Skoog oplossing. Bereid de cotyledon volgens de methoden die eerder beschreven in het Journal of Visualized Experiments. Zet het exemplaar op het podium van een confocale lasermicroscoop.
Gebruik ten slotte heldere veldverlichting om geclusterde beschermcellen te selecteren voor observatie. In dit protocol werd stomatale clustering geïnduceerd in A.thaliana zaailingen. De geclusterde beschermcellen gekweekt in de sacharose met een medium met grotere chloroplasten dan beschermcellen gekweekt in sacharose-vrije omstandigheden.
De vergroting van de chloroplasten werd bevestigd met een chloroplast stroma marker en chlorofyl autofluorescenten, wat suggereert dat sacharosebehandeling resulteerde in ophoping van zetmeelkorrels in de chloroplasten. Bovendien, confocale observatie van GFP tub-6 bleek dat de corticale microtubuli waren radiaal georiënteerd in de sacharose behandelde cellen, net als in de sacharose-vrije wachtcellen. Eigenlijk ontdekten we deze methode per ongeluk.
Na de bevinding hebben we de milieurespons van geclusterde stomata onderzocht. Wij geloven dat ons systeem kan helpen om de betekenis van de stomata distributie te onderzoeken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert hoe geclusterde huidmondjes in de cotylodonen van Arabidopsis thaliana-zaailingen kunnen worden geïnduceerd met behulp van een suikerhoudend medium. Daarnaast wordt de observatie van intracellulaire structuren, zoals chloroplasten en microtubuli in sluitcellen, via confocale lasersmicroscopie beschreven.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Plantenontwikkelingsbiologie
- Stomatafunctie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Stomata spelen een cruciale rol bij de gasuitwisseling en waterregulatie in planten.
- De ruimtelijke verdeling van stomata beïnvloedt de plantenfysiologie en -ontwikkeling.
- Arabidopsis thaliana is een modelorganisme voor het bestuderen van de plantbiologie.
- Confocale lasersmicroscopie maakt gedetailleerde observatie van cellulaire structuren mogelijk.
Doel van de studie
- Om geclusterde huidmondjes te induceren in Arabidopsis thaliana-zaailingen.
- Om de intracellulaire structuren in sluitcellen te onderzoeken.
- Om een methode te bieden die toepasbaar is op transgene of mutante lijnen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een suikerhoudend medium met Murashige-Skoog-zouten en sucrose.
- Aanpassing van de pH naar 5,8 met kaliumhydroxide.
- Onderdompelingsbehandeling van zaailingen in het bereide medium.
- Observatie van sluitcellen met confocale laserscanmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van geclusterde huidmondjes in de cotylodonen.
- Visualisatie van chloroplasten en microtubuli in sluitcellen.
- Aangetoonde toepasbaarheid op diverse Arabidopsis-lijnen.
- Verstrekte inzichten in de ruimtelijke distributie van huidmondjes.
Conclusies
- De methode is effectief voor het bestuderen van de stomatale ontwikkeling.
- Het vergroot het inzicht in de stomatale functie bij planten.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit protocol voor verdere inzichten.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Inzicht in de ruimtelijke distributie van huidmondjes informeert voorspellende modellen van de watergebruiksefficiëntie en fotosynthetische capaciteit van planten, wat relevant is voor de optimalisatie van de gewasopbrengst en stressbestendigheid in de agrarische biotechnologie. Dit inductiesysteem maakt mechanistische analyse van de biologie van sluitcellen mogelijk zonder genetische modificatie, wat de validatie van targets in plant-signaleringsroutes ondersteunt. De methode biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor het evalueren van de effecten van verbindingen op het patroon en de functie van huidmondjes in discovery-pipelines.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar ruimtelijke patroonmechanismen bij de ontwikkeling van huidmondjes mogelijk om targets in plantensignaleringsroutes te valideren.
- Operationele waarde: Biedt een niet-genetisch, chemisch induceerbaar systeem dat toepasbaar is op transgene of mutante lijnen voor het verminderen van risico's bij targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare fenotypische uitkomsten (geclusterde huidmondjes, vergroting van chloroplasten) voor high-content screening van bioactieve verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerd sucrose-MS-medium en confocale readouts om de reproduceerbaarheid van de assay tussen laboratoria te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppel stomatale clustering aan intracellulaire biomarkers (chloroplastgrootte, microtubuli-oriëntatie) voor mechanistische risicoreductie in studies naar plantenstressresponsen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van gen- of target-ontdekking naar fenotypische validatie in ziekterelevante systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarin fenotypische screening en targetvalidatie voorafgaan aan de lead-identificatie, in het bijzonder in pipelines voor agrochemische ontwikkelingen en planteneigenschappen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing naar de significantie van stomatale spreiding via induceerbare clustering zonder genetische alteratie.
- Screening: Maakt assay-klare systemen mogelijk met kwantificeerbare sluitcel-fenotypes voor screening van compound-bibliotheken.
- Analytics: Biedt kwantitatieve confocale read-outs (chloroplastgrootte, microtubulusoriëntatie) om effecten van behandelingen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt intracellulaire observaties met stomatale functies voor predictieve modellering van stressrespons.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar inductieplatform dat toepasbaar is op diverse mutante en transgene Arabidopsis-lijnen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target-validatie via fenotypische risicoreductie van mechanismen voor stomatale patroonvorming.
- Operationele waarde: Standaardisatie via een gedefinieerd sucrose-MS-medium en pH-aanpassing waarborgt de reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt vroege go/no-go-beslissingen mogelijk over verbindingen die de stomatale ontwikkeling beïnvloeden, waardoor het risico op falen in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van fenotypische validatie in systemen met geclusterde huidmondjes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in planteweefselkweek, steriele technieken en confocale microscopie.
- Afhankelijk van toegang tot een autoclaaf, groeikamers en laser-scanning microscopen.
- Maakt standaardisatie van zaadsterilisatie en de bereiding van het sucrosemedium tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing aan andere soorten of weefseltypes kan optimalisatie van de sucroseconcentratie en de blootstellingsduur vereisen.
- Beperkt tot waarneembare fenotypes in cotylodonen; schaalbaarheid naar assays van de hele plant kan aanvullende validatie behoeven.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
