Discriminatie van zeven immuun cel deelverzamelingen door twee-fluorescerende Stroom Cytometry

Het algemene doel van deze methodologie is om verder te gaan dan de optische limiet van de meeste stroomcytometers door een onderzoeker in staat te stellen vijf extra markers op te nemen om complexe celpopulaties te ondervragen. Met behulp van deze techniek is het mogelijk om een diepe immunophenotypering te bereiken bij het werken met instrument met een laag aantal detectoren of monsters met een beperkt aantal cellen. Begin deze procedure door het zorgvuldig overbrengen van getrokken bloed in een 50-milliliter conische buis.

Verdun het bloed met een gelijke hoeveelheid PBS zonder calcium en magnesium. Voeg 15 milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan de bodem van een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Overlay het verdunde bloed voorzichtig bovenop het dichtheidsgradiëntmedium, waardoor het mengen tussen het dichtheidsgradiëntmedium en verdund bloed wordt vermeden.

Centrifuge op 400 keer g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder rem om verstoring van de interface te voorkomen. Gebruik na centrifugatie een pipet om de bovenste laag zorgvuldig aan te trekken en weg te gooien, met aandacht voor het niet verwijderen van cellen op de interface tussen het plasma- en dichtheidsgradiëntmedium. Verzamel zoveel mogelijk perifere bloedmononucleaire cellen, of PBMC's, mogelijk uit de interface zonder de rode celpellet aan de onderkant van de 50-milliliter conische buis aan te raken en over te brengen naar een nieuwe buis.

Voeg PBS toe om het uiteindelijke volume op 25 milliliter te brengen en om te keren meerdere keren om te mengen. Was vervolgens de PBMCs twee keer zoals aangegeven in de tekst. Na het verwijderen van de bloedplaatjes en het tellen van de PBMCs zoals beschreven in de tekst, resuspend de cellen in PBS, 0,1% natrium azide tot een concentratie van een keer 10 tot de zevende cellen per milliliter.

Om de PBMCs voor te bereiden op vlekken, breng je 100 microliter van elk monster over naar een 96-well V-bodemplaat. Centrifugeren de plaat op 350 keer g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Breng de supernatant voorzichtig aan zonder de celpellet te verstoren.

Voeg aan elke put 100 microliter PBS toe met een levende/dode fixeerbare kleurstof die reageert met gratis amine op eiwitten en het PBMC-mengsel zorgvuldig opnieuw opschort. Laat de plaat vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur zitten voor het labelen van dode cellen. Bereid voor elk monster 30 microliter van een mix met alle zeven antilichamen.

In dit stadium kunnen getitreerde antilichamen tegen verschillende doelmoleculen en in verschillende fluorchromen ook worden toegevoegd. Centrifugeer de 96-put plaat op 350 keer g gedurende drie minuten bij kamertemperatuur, en zorgvuldig aspirate de supernatant zonder verstoring van de cel pellet. Voeg de antilichaamcocktail toe aan elke put en maak voorzichtig opnieuw op te dagen zonder bellen te genereren.

Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Voeg na 30 minuten 150 microliter kleuringsbuffer toe aan elke put en vercentrifugeert de plaat drie minuten lang op 350 keer g bij kamertemperatuur. Zorgvuldig aanzuigen van de supernatant zonder verstoring van de cel pellet, en resuspend de cellen in 200 microliter van PBS.

De cellen zijn nu klaar voor flow cytometrie analyse. Anti-CD3, CD8, CD14, CD19 en TCR gamma delta antilichamen worden getitreerd met een maximale kleuring index curve. Antilichaam titratie is de meest kritische stap in dit protocol om goed te identificeren zeven immuuncel subset met behulp van twee fluorchromen.

Om een tweevoudige verdunning van antilichamen voor te bereiden, vul 10 putten van een 96-putplaat met 40 microliter kleuringbuffer per put. Voor de toepassing van deze video wordt alleen de titratie van anti-CD8 getoond. In de eerste put, verhoging van het uiteindelijke volume tot 80 microliter van kleuring buffer, en voeg anti-CD8 bij een concentratie vier keer de concentratie voorgesteld door de fabrikant.

Meng goed en breng 40 microliter naar de tweede put. Meng goed en herhaal deze stap voor alle andere putten. Vlek 10 monsters van PBMCs of volbloed met 30 microliter van de 10 verschillende tweevoudige verdunningen van anti-CD8 volgens het protocol eerder aangetoond.

Verkrijg gegevens met een stroomcytometer en plot het signaal van elke verdunning. Na het berekenen van de vlekindex voor elke concentratie van antilichamen zoals beschreven in de tekst, zet u de vlekindex ten opzichte van de concentratie van antilichamen, uitgedrukt als een fractie van de verdunning van het antilichaam, in kaart en identificeert u de concentratie van het antilichaam met de maximale vlekindexwaarde. Om de anti-CD4 en anti-CD56 antilichamen te titreren, begin met de tweevoudige verdunningsstrategie die eerder werd aangetoond, waarbij extra concentraties tussenin worden toegevoegd om het concentratiebereik dat scheiding van CD4-positieve T-cellen en NK-cellen van de andere celpopulaties mogelijk maakt, fijn te identificeren.

Titreert het anti-CD4 antilichaam door het anti-CD4 signaal te plaatsen tussen het dubbele CD8-positieve, CD3-positieve signaal en de CD3 enkele positieve populatie. Titreer het anti-CD56-antilichaam volgens een strategie die vergelijkbaar is met de anti-CD4-antilichaam titratie, door NK-cellen tussen de CD3-negatieve en de CD3-positieve populaties te plaatsen. Om te beginnen met deze twee-fluorochrome, zeven-marker gating strategie, selecteer de lymfocyten poort, en maak een stip plot met een van de twee fluorchromen gebruikt in dit protocol op elke as.

Poort op CD8-positieve T-cellen geïdentificeerd als CD3 en CD8 dubbele positieve cellen in de rechterbovenhoek van de stip plot. Sluit de dim-CD8-populatie uit die NKT-cellen kan bevatten. Poort op CD4-positieve T cellen geïdentificeerd als de populatie tussen CD8-positieve T-cellen en de CD3 enkele positieve populaties.

Poort op gamma delta T cellen geïdentificeerd als hoge CD3 cellen. Subdivide gamma delta T cellen naar CD8 positief en CD8 negatief. Poort op NK cellen geïdentificeerd als de populatie tussen CD3-positieve en CD3-negatieve cellen.

Verdeel de NK-cellen onder cd8-positief en CD8-negatief. Poort op B-cellen geïdentificeerd als de CD3-negatieve, CD19-positieve populatie op de rechterbenedenhoek van de stip plot. Selecteer de monocytpoort en maak een stipplot met een van de twee fluorchromen die in dit protocol op elke as worden gebruikt.

Poort op de CD3-negatieve, CD14-positieve bevolking. Met behulp van deze strategie werden lymfocyten van een patiënt met multipel myeloom afgesloten op basis van hun voorwaartse spreiding en zijverstrooiing en hun stromingscytometrisch profiel. CD8-positieve geheugen subpopulaties en naïeve T-cellen werden geïdentificeerd door de expressie van CD45RA en CCR7.

Expressie van HLA-DR en CD57 werd gebruikt om T-celactivering te bestuderen in CD8-positieve naïeve, geheugen, centraal geheugen, effectorgeheugen en effectorgeheugen CD45RA-positieve cellen. Op een vergelijkbare manier werden CD4-positieve naïeve en geheugen T-cellen geïdentificeerd. Binnen de geheugenpopulatie werden CCR4 en CCR6 gebruikt om T-helper-subpopulaties in CD4-positieve T-cellen te identificeren.

Subpopulaties van NK-cellen werden gekenmerkt door CD16 en CD57 expressie. Deze strategie werd gebruikt om de dynamiek in immuunpopulaties van longitudinale monsters van een donor met multipel myeloom die een stamceltransplantatie kreeg, te onderzoeken. Karakterisering van CD8 en CD4 subpopulaties na verloop van tijd toonde een aanhoudende CD4-positieve en CD8-positieve T-cel activering en een scheeftrekking van T helper om een T-helper-een fenotype.

Maar op dag 60, het percentage van B-cellen drastisch verhoogd, het voorspellen van de patiënt terugval. Een goede celvoorbereiding en antilichaam titratie zijn cruciale stappen om betrouwbare resultaten te bereiken met behulp van deze techniek. Antilichaam gericht op andere markers kan worden toegevoegd om diepere stroom cytometrie analyse te bereiken en om modulaire stroom cytometrische panelen gericht op verschillende geslachten op hetzelfde moment te creëren.

Soortgelijke benaderingen die gericht zijn op het uitbreiden van het aantal opneembare merkers kunnen ook worden ontwikkeld met behulp van verschillende sets marker of voor gebruik in verschillende diermodellen. Vergeet niet dat natriumaedide brandwonden kan veroorzaken aan huid en ogen. Daarom moeten een labjas, een beschermende bril en handschoenen altijd worden gedragen bij het hanteren van dit reagens.