Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te bieden om endogene LRRK2 kinase activiteit in menselijk perifeer bloed te beoordelen. Dit wordt bereikt door het monitoren van LRRK2-gemedieerde fosforylatie van Rab eiwitten, in dienst Michael J.Fox Foundation fosfo-specifieke Rab monoclonal antilichamen. Hier richten we ons op menselijke perifere bloednefolfielen als een vorm van homogene site bevolking met hoge expressieniveaus van zowel Rab2 en Rab10.

De neutrofiele isolatie is gebaseerd op een negatieve selectie die binnen 40 minuten na de voltooide actie isolatie van 99% zuivere en levensvatbare neutrofielen mogelijk maakt en tegelijkertijd een hoge hoeveelheid eiwitniveaus oplevert. Verzamel 10 milliliter bloed in een bloedafnamebuis. Meng zachtjes door buizen zeven tot acht keer om te keren.

Breng 10 milliliter bloed over in een conische buis van 50 milliliter. Voeg aan bloed 100 microliters van EDTA voorraad oplossing 1, 0.1 molaire EDTA PBS Oplossing, meng voorzichtig. Voeg 500 microliter isolatiecocktail, 50 microliter per milliliter van de neutrophil isolatiekit toe aan het hele bloedmonster.

Vortex de magnetische kralen van de neutrophil isolatie kit voor 30 seconden voor gebruik om zeer fijne magnetische kralen resuspend. Voeg 500 microliter magnetische kralen toe aan het bloedmonster en meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden.

Top-up buis tot 50 milliliter met EDTA voorraad oplossing 2. Dit is een millimolar EDTA PBS Oplossing. Meng door heel voorzichtig pipetten op en neer twee tot drie keer.

Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om daaropvolgende agitatie van de buis te voorkomen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zorgvuldig pipette verrijkte cel suspensie die neutrofielen bevat in een nieuwe 50 milliliter conische buis.

Raak de zijkant van de buis die in contact is met de magneet niet aan en vermijd het verzamelen en verstoren van de rode bloedcellen aan de onderkant van de buis. Laat ongeveer 10 milliliter van de rode bloedcel suspensie achter aan de onderkant van de buis. Vortex magnetische kralen gedurende 30 seconden voor gebruik en voeg 0,5 milliliter magnetische kralen aan de buis met de verrijkte neutrofielen.

Meng voorzichtig door de buis om te keren. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om daaropvolgende agitatie te voorkomen.

Vijf minuten incubeer maken bij kamertemperatuur. Voorzichtig pipette de verrijkte cel suspensie die neutrofielen bevat in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Raak de zijkant van de buis die in contact is met de magneet niet aan.

Laat ongeveer vijf milliliter van de suspensie aan de onderkant van de buis. Om ervoor te zorgen dat magnetische kralen volledig uit het celmengsel worden verwijderd, plaatst u de buis met verrijkte cellen in de magneet. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Voorzichtig pipette de verrijkte cel suspensie die nu bevat pure neutrofielen in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Raak de zijkant van de buis die in contact is met de magneet niet aan. Laat ongeveer vijf milliliter suspensie aan de onderkant van de buis.

Hertogede cellen met één millimolar EDTA voorraadoplossing 2 tot een eindvolume van ongeveer 41 milliliter. Pipette op en neer om te mengen. Verdeel de oplossing in twee buizen met ongeveer 20 milliliter in elke buis.

Centrifuge beide buizen op 335G gedurende vijf minuten. Neem tijdens de centrifugatiestap de MLi-2-remmervoorraad, 200 micromolar slash 1000X-concentratie uit de min 80 graden vriezer en laat bij kamertemperatuur voor verder gebruik. Onmiddellijk na de centrifugatie stap en zonder agitatie van de buizen, giet het supernatant zonder verstoring van de neutrophil pellets.

resuspend elke celpellet in 10 milliliter celkweekmedium bij kamertemperatuur door cellen voorzichtig op en neer vier keer te pipetten. Label een buis DMSO en de andere buis MLi-2. Voeg aan dmso-gelabelde buis 10 microliter DMSO toe en voeg 10 microliter van 200 micromolar MLi-2 voorraadoplossing toe door voorzichtig op en neer te pipetten om te mengen.

Incubeermonsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meng zachtjes door inversie om de 10 minuten tijdens de incubatieperiode. Verwijder tijdens de 30 minuten durende LRRK2 kinaseremmerbehandeling 0,5 molaire DIFP-voorraadoplossing uit de min 80 graden vriezer en plaats in rookkap op ijs.

Verplaats vervolgens een milligram per milliliter Microcystin-LR voorraadoplossing uit de min 80 graden vriezer en plaats bij kamertemperatuur om te ontdooien. Ontdooi een aliquot, 0,25 milliliter van de lysisbuffer door het uit de vriezer te halen, laat ontdooien bij kamertemperatuur en plaats het vervolgens op ijs voor verder gebruik. Bereid een milliliter RPMI medium met een microliter van DMSO noemen dit DMSO Resuspension Buffer.

Bereid een milliliter RPMI-medium voor met één microliter van 200 micromolar MLi-2 of alternatieve LRRK2 kinaseremmer en noem deze MLi-2 Resuspension Buffer. Na de incubatietijd van 30 minuten, centrifuge beide buizen op 335G gedurende vijf minuten, zoals voorheen. Gooi de supernatant voorzichtig in elke buis weg zonder de neutrofiele pellet te verstoren.

Voor de DMSO gelabelde buis, voorzichtig resuspend pellet in een milliliter van DMSO Resuspension Buffer. En voor de MLi-2 gelabelde buis, resuspend pellet in een milliliter van MLi-2 Resuspension Buffer. Breng geresuspended cell pellets over naar overeenkomstige centrifugatiebuizen met het label DMSO en MLi-2 en centrifuge beide buizen drie minuten op 335G.

Bereid tijdens de centrifugatiestap de lysebuffer voor. Voeg in de rookkap voorzichtig 0,25 microliter 0,5 molaire DIFP-oplossing toe, evenals 0,25 microliter van één milligram per milliliter microcystin-LR aan de 0,25 milliliter lysebuffer. Meng en laat op ijs tot gebruik.

Onmiddellijk na de centrifugatie, zorgvuldig en volledig verwijderen van alle supernatant met een pipet zonder verstoring van de neutrophil pellet en plaats buizen op ijs. Voeg onmiddellijk 100 microliter lysebuffer met DIFP en microcystine-LR toe aan elke buis. Met behulp van een 100 tot 200 microliter pipet, resuspend de cel pellets door pipet op en neer ongeveer vijf tot 10 keer.

Lig cellen 10 minuten op ijs. Dan, centrifuge buizen op 20.000 keer G gedurende 15 minuten op vier graden Celsius om celpuin te verwijderen. Breng DMSO en MLi-2 supernatant met neutrofiele lysates over in nieuwe centrifugatiebuizen.

Gooi puin pellets. Neutrophil lysates zijn nu klaar voor gebruik of kunnen worden gesnapt bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen op min 80 graden voor toekomstige analyse. Aan de hand van gegevens uit de openbaar beschikbare importdatabase toont deze grafiek aan dat een overvloed aan LRRK2- en Rab10-eiwitten bijzonder hoog is in menselijke perifere bloednecofielen en monocyten.

Het isoleren van menselijke perifere bloednepelfielen met deze procedure resulteert in een hoge onzuivere opbrengst van cellen. De tabel aan de bovenkant toont het totale aantal cellen geïsoleerd van 10 milliliter perifeer bloed van drie gezonde donoren. Ook worden de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen getoond, evenals de totale eiwitlysaatopbrengst.

Na behandeling met en zonder de LRRK2 kinaseremmer, MLi-2, worden neutrofielen gelysed in aanwezigheid van de krachtige proteaseremmer, DIFP. Voor figuur B aan de linkerkant werden 10 microgram hele celextracten per rijstrook onderworpen aan multiplex-kwantitatieve immunoblot-analyse met de aangegeven antilichamen. De figuur aan de rechterkant, C, toont het belang van DIFP voor de preventie van proteolytische afbraak, met name van de grote LRRK2 eiwit.

Ter vergelijking: hoge concentraties PMSF alleen al zijn minder effectief. Hier is gebleken dat LRRK2-gecontroleerde Rab10 fosforylatie aanzienlijk wordt verhoogd met ongeveer drievoudig in perifere bloed neutrofielen afkomstig van patiënten met de erfelijke ziekte van Parkinson herbergen een heterozygoot VPS35 D620N mutatie in vergelijking met controles. De bovenste grafiek toont de multiplex immunoblot analyse en de onderkant, de kwantificering daarvan.

Dit suggereert dat de VPS35 D620N mutatie activeert LRRK2 kinase pad van activiteit door een nog onbekend mechanisme. Samengevat presenteren we een facile en robuuste test om LRRK2 kinase pathway activiteit te meten door rab eiwit fosforylatie, zoals Rab10, in de menselijke perifere afgeleide neutrofielen te controleren, deze methode stelt ons in staat om LRRK2-trajectactiviteit te beoordelen en te bepalen hoe mutaties, ziektetoestanden of remmers LRRK2-trajectactiviteit moduleren.