Name: Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Leer neutrofielen isoleren uit menselijk perifeer bloed voor het meten van LRRK2 kinase activiteit via Rab10 fosforylatie. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van patiënten met erfelijke Parkinson.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de gezonde vrijwilligers die vriendelijk bloed hebben gedoneerd voor de huidige studie. Wij danken The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) en de Fox BioNet studie leiderschap (FBN) voor hun steun en input voor het geschreven protocol en de video. Wij danken professor Alexander Zimprich van de Universiteit van Wenen in Oostenrijk voor het testen van ons protocol en samenwerking. Wij waarderen de bijdragen van Paul Davies aan het project (general manager van de MRC PPU). We erkennen ook de uitstekende technische ondersteuning van de MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), namelijk Chemische Synthese (Natalia Shpiro voor de synthese van MLi-2), MRC PPU Reagentia en Services antilichaam zuiveringsteams (gecoördineerd door Hilary McLauchlan en James Hastie). Wij danken Mhairi Towler en Fraser Murdoch van Vivomotion voor hun hulp bij het maken van de video's en animaties. Wij danken Steve Soave uit 81 films voor hulp bij de laatste bewerkingen. Esther Sammler wordt ondersteund door een Scottish Senior Clinical Academic Fellowship en heeft financiering ontvangen van Parkinson's UK (K-1706).

Volgens de lokale Britse regelgeving worden alle manipulaties en pipettering van menselijk bloed uitgevoerd in een biologische veiligheidskast van categorie 2. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale ethische beoordelingscommissie en alle deelnemers hebben geïnformeerde toestemming gegeven.
1. Voorbereiding
<ol><li>Bereid 0,1 mL EDTA Stock Solution 1 voor met 100 mM EDTA in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Bereid 60 mL EDTA Stock Solution 2 voor met 1 mM EDTA in PBS.</li>
	<li>Bereid een lysisbuffer voor met 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerofosfaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 0,27 M sacharose, 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x proteaserremmende cocktail, 1 μg/mL microcystin-LR en 0,5 mM diisopropylfluorfosfaat (DIFP). OPMERKING: De auteurs gebruiken routinematig een EDTA-vrij product, maar een EDTA-bevattende proteaseremmercocktail zou ook moeten werken. De lysisbuffer kan vooraf worden gemaakt zonder de β-mercapto-ethanol, proteaseremmers, microcystin-LR en DIFP, en opgeslagen bij 4 °C tot gebruik. Zorg ervoor dat de β-mercapto-ethanol, proteaseremmers, microcystin-LR en DIFP pas vlak voor gebruik worden toegevoegd. LET: DIFP is giftig en moet met zorg worden behandeld in een rookkap na lokale beoordeling van het risico op gezondheids- en veiligheid. DIFP kan worden toegevoegd aan de lysisbuffer en onmiddellijk worden gebruikt. Als alternatief kan de volledige lysisbuffer met alle andere componenten, waaronder DIFP, worden bij -80 °C worden opgeslagen en gedurende ten minste 4 weken worden opgeslagen.</li>
</ol>2. Neutrofiele isolatie van volbloed
<ol><li>Verzamel 10 mL bloed in een bloedafnamebuis. Meng voorzichtig door het omkeren van buizen 7−8x.</li>
	<li>Breng 10 mL bloed over in een conische buis van 50 mL.</li>
	<li>Voeg 100 μL EDTA Stock Solution 1 toe aan het bloed. Meng voorzichtig.</li>
	<li>Voeg 500 μL van de isolatiecocktail (50 μL/mL) van de neutrofiele isolatiekit(Table of Materials)toe aan het bloedbloedmonster.</li>
	<li>Vortex de magnetische kralen uit de neutrofiele isolatie kit voor 30 s voor gebruik om de zeer fijne magnetische kralen opnieuw op te schorten.</li>
	<li>Voeg 500 μL van de magnetische kralen toe aan het bloedmonster en meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 min.</li>
	<li>Vul de buis tot 50 mL met EDTA Stock Solution 2. Meng door heel voorzichtig op en neer te ponsen 2-3x.</li>
	<li>Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om latere agitatie van de buis te voorkomen.</li>
	<li>Incubatie voor 10 min bij RT.</li>
	<li>Pipetteer de verrijkte celsuspensie die de neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL. LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact komt met de magneet niet aan en vermijd het verzamelen en verstoren van de rode bloedcellen aan de onderkant van de buis. Laat ongeveer 10 mL van de rode bloedcelsussie achter aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Draai de magnetische kralen voor 30 s voor gebruik en voeg 0,5 mL van de magnetische kralen toe aan de buis met de verrijkte neutrofielen. Meng voorzichtig door de buis om te keren.</li>
	<li>Incubeer bij RT voor 5 min.</li>
	<li>Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om latere agitatie te voorkomen.</li>
	<li>Incubeer bij RT voor 5 min.</li>
	<li>Pipetteer de verrijkte celsuspensie die de neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL. LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact staat met de magneet niet aan. Laat ongeveer 5 mL van de suspensie aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Om ervoor te zorgen dat magnetische kralen volledig uit het celmengsel worden verwijderd, plaatst u de buis met de verrijkte cellen in de magneet.</li>
	<li>Incubatie voor 10 min bij RT.</li>
	<li>Pipetteer de verrijkte celsuspensie die nu pure neutrofielen bevat zorgvuldig in een nieuwe conische buis van 50 mL. LET OP: Raak de zijkant van de buis die in contact staat met de magneet niet aan. Laat ongeveer 5 mL van de suspensie aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Meng de geïsoleerde cellen met 1 mM EDTA Stock Solution 2 tot een eindvolume van ongeveer 41 mL. Pipetteer op en neer om te mengen.</li>
	<li>Verdeel de oplossing gelijkmatig in twee buizen met ongeveer 20 mL in elke buis.</li>
	<li>Centrifugeer beide buizen op 335 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Neem tijdens deze centrifugatie MLi-2-remmervoorraad (200 μM/1.000x concentratie) uit de -80 °C-vriezer en laat bij RT achter voor later gebruik.</li>
	<li>Onmiddellijk na de centrifugatie stap en zonder agitatie van de buizen, giet de supernatant zonder verstoring van de neutrofiele pellets. Resuspend elke cel pellet in 10 mL van celcultuur media (Tabel van materialen)bij RT door voorzichtig pipetteren cellen op en neer 4x.</li>
</ol>3. LRRK2 kinase-remmerbehandeling van zuivere neutrofielen
<ol><li>Label een buis "DMSO" en de andere buis "MLi-2".</li>
	<li>Voeg 10 μL DMSO toe aan de "DMSO" gelabelde buis en meng voorzichtig door 2x op en neer te paien met een pipet van 10 mL. Voeg aan de "MLi-2" gelabelde buis 10 μL van 200 μM MLi-2 voorraadoplossing (eindconcentratie 200 nM) toe en meng voorzichtig door 2x op en neer te paien met een 10 mL pipet.</li>
	<li>Incubeer de monsters gedurende 30 min bij RT. Meng voorzichtig door inversie om de 10 min tijdens de incubatie.</li>
	<li>Verwijder tijdens de incubatietijd 0,5 M DIFP-voorraad uit de vrieskist van -80 °C en plaats in een rookkap op ijs. Verwijder 1 mg/mL microcystin-LR voorraadoplossing uit de -80 °C vriezer en laat bij RT ontdooien. Neem een aliquot (0,25 mL) van de lysisbuffer uit de vriezer, laat het ontdooien bij RT en plaats deze vervolgens op ijs voor later gebruik.</li>
	<li>Bereid 1 mL celkweekmedium voor dat 1 μL DMSO bevat en noem deze DMSO resuspension buffer. Bereid 1 mL RPMI-media voor die 1 μL van 200 μM MLi-2 bevatten en bel deze MLi-2 resuspension buffer.</li>
	<li>Centrifugeer beide buizen na de incubatietijd van 30 min op 335 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Gooi de supernatant in elke buis voorzichtig weg zonder de neutrofiele pellet te verstoren.</li>
	<li>Voor het dmso-gelabelde monster schort de pellet voorzichtig op in 1 mL van de DMSO-hersuspensiebuffer en voor de MLi-2 gelabelde buis, de pellet opnieuw in 1 mL van de MLi-2 resuspension buffer.</li>
	<li>Breng de geresuspendeerde celpellets over op overeenkomstige centrifugerende centrifugatiebuizen met het label "DMSO" en "MLi-2" en centrifugeer beide buizen op 335 x g gedurende 3 min.</li>
	<li>Bereid tijdens de centrifugatiestap de lysebuffer voor. Voeg in de rookkap voorzichtig 0,25 μL van 0,5 M DIFP-oplossing en 0,25 μL van 1 mg/mL microcystin-LR toe aan de 0,25 mL lysisbuffer. Meng en laat op ijs tot het gebruik. OPMERKING: Voeg DIFP toe aan de lysisbuffer binnen 15 min cellyse, omdat DIFP relatief instabiel is in een waterige oplossing.</li>
	<li>Onmiddellijk na de centrifugatie, zorgvuldig en volledig verwijderen van alle supernatant met een pipet zonder verstoring van de neutrofiele pellet en plaats de buizen op ijs.</li>
	<li>Voeg onmiddellijk 100 μL lysisbuffer met DIFP en microcystine-LR toe aan elke buis. Met behulp van een 100-200 μL pipet, resuspend de cel pellets door pipetteren op en neer ongeveer 5-10x.</li>
	<li>Lyse de cellen op ijs voor 10 min.</li>
	<li>Centrifugeer buizen op 20.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C om celafval te verwijderen.</li>
	<li>Breng de "DMSO" en "MLi-2" supernatants met de neutrofiele lysaten over in nieuwe centrifugatiebuizen. Gooi de puinpellet weg. LET OP: De neutrofiele lysaten zijn nu klaar voor gebruik of kunnen worden vastgemaakt bevroren in vloeibare stikstof en worden opgeslagen bij -80 °C voor toekomstige analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+Potent%2C+Selective%2C+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Therapies+for+Parkinson%27s+Disease%3A+From+Genetics+to+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li>
<li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+kinase+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li>
<li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li>
<li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson%27s+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Parkinson%27s+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li>
<li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+3-%284-Pyrimidinyl%29+Indazole+%28MLi-2%29%2C+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li>
<li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+serine+proteases%3A+specific+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li>
<li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson%27s+disease+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li>
<li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+VPS35%5BD620N%5D+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li>
<li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li>
<li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32(2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dwingend klinisch, genetisch en biochemisch bewijs wijst op een belangrijke rol voor LRRK2 en in het bijzonder de kinasefunctie bij de ziekte van Parkinson7. LRRK2 kinase remmers zijn ontwikkeld en zijn het invoeren van klinische proeven2,4,12. Als zodanig is er behoefte aan het exploiteren van LRRK2 als biomarker voor doelbetrokkenheid en patiëntgelaagdheid. Ons protocol beschrijft een robuuste en gemakk...

Pogingen om de ziekte van Parkinson (PD) te vertragen of te stoppen zijn tot nu toe mislukt. De ontdekking van hyperactiverende mutaties in de leucine rijke reinase 2 (LRRK2) die het risico voor PD veroorzaken en/of verhogen heeft geleid tot de ontwikkeling van LRRK2 kinase remmers1,2,3. Deze zijn nu opgenomen in klinische proeven4. De exacte functie van LRRK2 is onduidelijk, maar een belangrijke vooruitgang is de identificatie van een subset van Rab GTPase eiwitten, waaronder Rab10, als de eerste bonafide fysiologische substraten van de LRRK2 kinase5,6,7. Belangrijke uitdagingen in het tijdperk van ziekte-modificerende therapieën zijn biochemische markers van LRRK2 kinase activeringsstatus en doelbetrokkenheid van LRRK2 kinase remmers.
Tot nu toe was de belangrijkste farmacokinetische marker voor LRRK2-remmers in vivo een cluster van constitutieve fosforyllated serineresiduen van LRRK2, met name serine 935, die ontsmet raken in reactie op diverse LRRK2-remmers8,9. Serine 935 fosforylatie correleert echter niet met intrinsieke cellulaire LRRK2 kinaseactiviteit omdat het niet direct fosforylaat is door LRRK2 en nog steeds fosforylaat is in kinase-inactieve LRRK210. LRRK2 kinase activiteit correleert goed met autofoostie van serine 1292, maar het is in de praktijk geen geschikte uitlezing voor endogene LRRK2 kinase activiteit door immunoblot analyse van hele cel extracten als gevolg van het huidige gebrek aan betrouwbare en fosforspecifieke antilichamen voor deze site10,11.
We hebben een robuuste en eenvoudige test ontwikkeld om lrrk2 kinase-padactiviteit te kwantificeren in menselijke perifere bloedcellen die lrrk2-gecontroleerde fosforylatie van zijn fysiologische doeleiwit Rab10 bij threonine 7311meet. Perifeer bloed is gemakkelijk toegankelijk door geslachtsdeel, dat is een laag risico en snelle procedure die minimaal ongemak veroorzaakt. We richten ons op menselijke perifere bloedneutrofielen omdat ze een overvloedige (37-80% van alle witte bloedcellen) en homogene celpopulatie die relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 en Rab1011uitdrukt . Bovendien kunnen perifere bloedneutrofielen snel en efficiënt worden geïsoleerd door gebruik te maken van een immunomagnetische negatieve benadering. Om ervoor te zorgen dat de daaropvolgende waargenomen Rab10-fosforylatie wordt bemiddeld door LRRK2, wordt elke partij neutrofielen geïncubeerd met of zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase-remmer (we gebruiken en aanbevelen MLi-2)2,12. Dit wordt gevolgd door cellyse in een buffer met de proteaseremmer diisopropylfluorosafosfaat (DIFP), wat nodig is voor het onderdrukken van de intrinsieke serine protease activiteit waarvan bekend is dat hoog bij neutrofielen13. Voor de uiteindelijke analyse door kwantitatieve immunoblotting raden we aan om het MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam te gebruiken dat specifiek de Rab10 Thr73-phosphoepitope detecteert en niet cross-react met andere fosforylated Rab eiwitten14. Selectiviteit en specificiteit van dit antilichaam is gevalideerd in overexpressiemodellen van verschillende Rab-eiwitten en een A549 Rab10 knock-out cellijn14. Zo meten we het verschil in Rab10 fosforylatie in neutrofiele lysaten die zijn behandeld met en zonder een krachtige en selectieve LRRK2 kinase remmer2. Als alternatief kunnen monsters ook worden geanalyseerd met andere methoden, zoals kwantitatieve massaspectrometrie.
Tot slot, LRRK2-gecontroleerde Rab10 fosforylatie is een superieure marker van LRRK2 kinase activiteit op LRRK2 fosforylatie op serine 935 en menselijke perifere bloed neutrofielen zijn een waardevolle bron voor PD onderzoek naar LRRK2. Ons protocol biedt een robuuste en eenvoudige test om LRRK2 trajectactiviteit te ondervragen in perifere bloedneutrofielen en maakt biochemische gelaagdheid mogelijk van personen met verhoogde LRRK2 kinase activiteit15. Belangrijk is dat dergelijke personen kunnen profiteren van toekomstige LRRK2 kinase remmer behandeling.

<table><tbody><tr><td>1 mL Pipette tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>1.5 mL Micro tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>10 mL Pipette tips&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025&nbsp;</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>10 μL Pipette tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.113</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>15 mL falcon tube&nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>200 μL Pipette tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>25 mL Pipette tips&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>50 mL falcon tube&nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube</td><td>BD&nbsp;</td><td>BD 367525</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge</td><td>Beckman</td><td></td><td>of equivalent centrifuge met swingende mand voor 15 mL en 50 mL falcon tubes bij snelheid 1000-1200 x g</td></tr><tr><td>Category 2 biological safety cabinet.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>DIFP (Diisopropylfluorofosfaat)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0879</td><td>Bereid 0,5M stam oplossing in isopropanol met speciale voorzorgsmaatregelen&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>6250</td><td></td></tr><tr><td>Droge ijs of vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14190094</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep Magnet&nbsp;</td><td>Stemcell</td><td>18002</td><td>voor 1 x 50 ml kegelbuis</td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit&nbsp;</td><td>Stemcell</td><td>19666</td><td>Dit bevat oplossingen genaamd &ldquo;Isolation Cocktail&rdquo; en &ldquo;RapidSpheres magnetische kralen</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, in spuitfles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>IJs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (watervrij)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerofosfaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 0,27 M sucrose, 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystine-LR, 0,5 mM diisopropylfluorofosfaat (DIFP).&nbsp;</td><td></td><td></td><td>alternatief bevroren lysis buffer in aliquoten zonder Microcystine-LR, DIFP verkrijgbaar bij MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td></tr><tr><td>Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)</td><td>Merck</td><td>438194-10MG</td><td>of equivalent (potente en selectieve LRRK2 remmer)</td></tr><tr><td>Microcystine-LR</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-350-012-M001</td><td>1 mg/ml stock in DMSO en bewaar bij -80 oC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx scan Western Blot beeldvormingssysteem</td><td>Odyssey</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permanente markerpen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persoonlijke beschermingsmiddelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>natriumpyrofosfaat</td><td>Sigma</td><td>S22</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>β-glycerofosfaat</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>β-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Voorgestelde antilichamen voor Western blotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-RAB10 (fosfo T73) antilichaam [MJF-R21]</td><td>abcam</td><td>ab230261</td><td></td></tr><tr><td>Anti-α-tubuline</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5174</td><td>gebruikt bij 1:2000 verdunning</td></tr><tr><td>Goat anti-muis IRDye 680LT</td><td>LI-COR</td><td>926-68020</td><td>gebruikt bij 1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>Goat anti-muis IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>gebruikt bij 1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>Goat anti-konijn IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td>gebruikt bij 1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>MJFF-total Rab10 muisantilichaam</td><td>gegenereerd door nanoTools (nanotools.de)</td><td>niet van toepassing*</td><td>gebruikt bij 2 μg/ml eindconcentratie; * Het MJFF-total Rab10 antilichaam gegenereerd door nanoTools (www.nanotools.de) [11] zal in 2018 gecommercialiseerd worden door de Michael J Fox Foundation</td></tr><tr><td>Muis anti-LRRK2 C-terminus antilichaam</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>&nbsp;75-253</td><td>gebruikt bij 1 μg/ml eindconcentratie</td></tr><tr><td>pS935-LRRK2</td><td>MRC PPU Reagents and Services</td><td>UDD2</td><td>gebruikt bij 1 μg/ml eindconcentratie</td></tr></tbody></table>

menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de parkinson geassocieerde lrrk2 kinase pathway door de beoordeling van rab10 fosforylatie

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

De leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is het meest gemuteerde gen bij erfelijke Parkinson' ziekte (PD) en alle pathogene LRRK2 mutaties resulteren in hyperactivatie van de kinase functie. Hier beschrijven we een eenvoudige en robuuste test om LRRK2 kinase route activiteit in menselijke perifere bloed neutrofielen kwantificeren door het meten van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van een van de fysiologische substraten, Rab10 op threonine 73. De beschreven immunoblotting analyse vereist een volledig selectief en fosfospecifiek antilichaam dat de Rab10 Thr73 epitoop fosforylaat door LRRK2 herkent, zoals de MJFF-pRab10 konijn monoklonale antilichaam. Het maakt gebruik van menselijke perifere bloed neutrofielen, omdat perifere bloed is gemakkelijk toegankelijk en neutrofielen zijn een overvloedige en homogene bestanddeel. Belangrijk is dat neutrofielen relatief hoge niveaus van zowel LRRK2 als Rab10 uitdrukken. Een potentieel nadeel van neutrofielen is hun hoge intrinsieke serine protease activiteit, die het gebruik van zeer krachtige proteaseremmers zoals de organofosfor neurotoxine diisopropylfluorosafosfaat (DIFP) als onderdeel van de lysisbuffer vereist. Niettemin zijn neutrofielen een waardevolle bron voor onderzoek naar lrrk2 kinase-padactiviteit in vivo en moeten ze in aanmerking komen voor opname in PD-biorepository-collecties.

Onze test maakt het mogelijk het ondervragen van de activering van de PD-geassocieerde LRRK2 kinase in menselijke perifere bloed neutrofielen met LRRK2-afhankelijke Rab10 fosforylatie als een uitlezing. Neutrofielen zijn een homogene en overvloedige perifere witte bloedcellen populatie die hoge niveaus van zowel de LRRK2 en Rab10 eiwitten (Figuur 1) uitdrukt. De enige andere celpopulatie onder de resterende perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) met hoge kopieaantallen van beide eiwitte...

Mutaties in het leucine rijke reinase 2 gen (LRRK2) veroorzaken erfelijke de ziekte van Parkinson. We hebben een eenvoudige en robuuste methode ontwikkeld voor het beoordelen van LRRK2-gecontroleerde fosforylatie van Rab10 bij menselijke perifere bloedneutrofielen. Dit kan helpen bij het identificeren van personen met een verhoogde LRRK2 kinase traject activiteit.

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te bieden om endogene LRRK2 kinase activiteit in menselijk perifeer bloed te beoordelen. Dit wordt bereikt door het monitoren van LRRK2-gemedieerde fosforylatie van Rab eiwitten, in dienst Michael J.Fox Foundation fosfo-specifieke Rab monoclonal antilichamen. Hier richten we ons op menselijke perifere bloednefolfielen als een vorm van homogene site bevolking met hoge expressieniveaus van zowel Rab2 en Rab10.De neutrofiele isolatie is gebaseerd op een negatieve selectie die binnen 40 minuten na de voltooide actie isolatie van 99% zuivere en levensvatbare neutrofielen mogelijk maakt en tegelijkertijd een hoge hoeveelheid eiwitniveaus oplevert. Verzamel 10 milliliter bloed in een bloedafnamebuis. Meng zachtjes door buizen zeven tot acht keer om te keren.Breng 10 milliliter bloed over in een conische buis van 50 milliliter. Voeg aan bloed 100 microliters van EDTA voorraad oplossing 1, 0.1 molaire EDTA PBS Oplossing, meng voorzichtig. Voeg 500 microliter isolatiecocktail, 50 microliter per milliliter van de neutrophil isolatiekit toe aan het hele bloedmonster.Vortex de magnetische kralen van de neutrophil isolatie kit voor 30 seconden voor gebruik om zeer fijne magnetische kralen resuspend. Voeg 500 microliter magnetische kralen toe aan het bloedmonster en meng voorzichtig door de buis meerdere keren om te keren. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden.Top-up buis tot 50 milliliter met EDTA voorraad oplossing 2. Dit is een millimolar EDTA PBS Oplossing. Meng door heel voorzichtig pipetten op en neer twee tot drie keer.Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om daaropvolgende agitatie van de buis te voorkomen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zorgvuldig pipette verrijkte cel suspensie die neutrofielen bevat in een nieuwe 50 milliliter conische buis.Raak de zijkant van de buis die in contact is met de magneet niet aan en vermijd het verzamelen en verstoren van de rode bloedcellen aan de onderkant van de buis. Laat ongeveer 10 milliliter van de rode bloedcel suspensie achter aan de onderkant van de buis. Vortex magnetische kralen gedurende 30 seconden voor gebruik en voeg 0,5 milliliter magnetische kralen aan de buis met de verrijkte neutrofielen.Meng voorzichtig door de buis om te keren. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Plaats de buis in de magneet en verwijder het deksel om daaropvolgende agitatie te voorkomen.Vijf minuten incubeer maken bij kamertemperatuur. Voorzichtig pipette de verrijkte cel suspensie die neutrofielen bevat in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Raak de zijkant van de buis die in contact is met de magneet niet aan.Laat ongeveer vijf milliliter van de suspensie aan de onderkant van de buis. Om ervoor te zorgen dat magnetische kralen volledig uit het celmengsel worden verwijderd, plaatst u de buis met verrijkte cellen in de magneet. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Voorzichtig pipette de verrijkte cel suspensie die nu bevat pure neutrofielen in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Raak de zijkant van de buis die in contact is met de magneet niet aan. Laat ongeveer vijf milliliter suspensie aan de onderkant van de buis.Hertogede cellen met één millimolar EDTA voorraadoplossing 2 tot een eindvolume van ongeveer 41 milliliter. Pipette op en neer om te mengen. Verdeel de oplossing in twee buizen met ongeveer 20 milliliter in elke buis.Centrifuge beide buizen op 335G gedurende vijf minuten. Neem tijdens de centrifugatiestap de MLi-2-remmervoorraad, 200 micromolar slash 1000X-concentratie uit de min 80 graden vriezer en laat bij kamertemperatuur voor verder gebruik. Onmiddellijk na de centrifugatie stap en zonder agitatie van de buizen, giet het supernatant zonder verstoring van de neutrophil pellets.resuspend elke celpellet in 10 milliliter celkweekmedium bij kamertemperatuur door cellen voorzichtig op en neer vier keer te pipetten. Label een buis DMSO en de andere buis MLi-2. Voeg aan dmso-gelabelde buis 10 microliter DMSO toe en voeg 10 microliter van 200 micromolar MLi-2 voorraadoplossing toe door voorzichtig op en neer te pipetten om te mengen.Incubeermonsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meng zachtjes door inversie om de 10 minuten tijdens de incubatieperiode. Verwijder tijdens de 30 minuten durende LRRK2 kinaseremmerbehandeling 0,5 molaire DIFP-voorraadoplossing uit de min 80 graden vriezer en plaats in rookkap op ijs.Verplaats vervolgens een milligram per milliliter Microcystin-LR voorraadoplossing uit de min 80 graden vriezer en plaats bij kamertemperatuur om te ontdooien. Ontdooi een aliquot, 0,25 milliliter van de lysisbuffer door het uit de vriezer te halen, laat ontdooien bij kamertemperatuur en plaats het vervolgens op ijs voor verder gebruik. Bereid een milliliter RPMI medium met een microliter van DMSO noemen dit DMSO Resuspension Buffer.Bereid een milliliter RPMI-medium voor met één microliter van 200 micromolar MLi-2 of alternatieve LRRK2 kinaseremmer en noem deze MLi-2 Resuspension Buffer. Na de incubatietijd van 30 minuten, centrifuge beide buizen op 335G gedurende vijf minuten, zoals voorheen. Gooi de supernatant voorzichtig in elke buis weg zonder de neutrofiele pellet te verstoren.Voor de DMSO gelabelde buis, voorzichtig resuspend pellet in een milliliter van DMSO Resuspension Buffer. En voor de MLi-2 gelabelde buis, resuspend pellet in een milliliter van MLi-2 Resuspension Buffer. Breng geresuspended cell pellets over naar overeenkomstige centrifugatiebuizen met het label DMSO en MLi-2 en centrifuge beide buizen drie minuten op 335G.Bereid tijdens de centrifugatiestap de lysebuffer voor. Voeg in de rookkap voorzichtig 0,25 microliter 0,5 molaire DIFP-oplossing toe, evenals 0,25 microliter van één milligram per milliliter microcystin-LR aan de 0,25 milliliter lysebuffer. Meng en laat op ijs tot gebruik.Onmiddellijk na de centrifugatie, zorgvuldig en volledig verwijderen van alle supernatant met een pipet zonder verstoring van de neutrophil pellet en plaats buizen op ijs. Voeg onmiddellijk 100 microliter lysebuffer met DIFP en microcystine-LR toe aan elke buis. Met behulp van een 100 tot 200 microliter pipet, resuspend de cel pellets door pipet op en neer ongeveer vijf tot 10 keer.Lig cellen 10 minuten op ijs. Dan, centrifuge buizen op 20.000 keer G gedurende 15 minuten op vier graden Celsius om celpuin te verwijderen. Breng DMSO en MLi-2 supernatant met neutrofiele lysates over in nieuwe centrifugatiebuizen.Gooi puin pellets. Neutrophil lysates zijn nu klaar voor gebruik of kunnen worden gesnapt bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen op min 80 graden voor toekomstige analyse. Aan de hand van gegevens uit de openbaar beschikbare importdatabase toont deze grafiek aan dat een overvloed aan LRRK2- en Rab10-eiwitten bijzonder hoog is in menselijke perifere bloednecofielen en monocyten.Het isoleren van menselijke perifere bloednepelfielen met deze procedure resulteert in een hoge onzuivere opbrengst van cellen. De tabel aan de bovenkant toont het totale aantal cellen geïsoleerd van 10 milliliter perifeer bloed van drie gezonde donoren. Ook worden de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de geïsoleerde cellen getoond, evenals de totale eiwitlysaatopbrengst.Na behandeling met en zonder de LRRK2 kinaseremmer, MLi-2, worden neutrofielen gelysed in aanwezigheid van de krachtige proteaseremmer, DIFP. Voor figuur B aan de linkerkant werden 10 microgram hele celextracten per rijstrook onderworpen aan multiplex-kwantitatieve immunoblot-analyse met de aangegeven antilichamen. De figuur aan de rechterkant, C, toont het belang van DIFP voor de preventie van proteolytische afbraak, met name van de grote LRRK2 eiwit.Ter vergelijking: hoge concentraties PMSF alleen al zijn minder effectief. Hier is gebleken dat LRRK2-gecontroleerde Rab10 fosforylatie aanzienlijk wordt verhoogd met ongeveer drievoudig in perifere bloed neutrofielen afkomstig van patiënten met de erfelijke ziekte van Parkinson herbergen een heterozygoot VPS35 D620N mutatie in vergelijking met controles. De bovenste grafiek toont de multiplex immunoblot analyse en de onderkant, de kwantificering daarvan.Dit suggereert dat de VPS35 D620N mutatie activeert LRRK2 kinase pad van activiteit door een nog onbekend mechanisme. Samengevat presenteren we een facile en robuuste test om LRRK2 kinase pathway activiteit te meten door rab eiwit fosforylatie, zoals Rab10, in de menselijke perifere afgeleide neutrofielen te controleren, deze methode stelt ons in staat om LRRK2-trajectactiviteit te beoordelen en te bepalen hoe mutaties, ziektetoestanden of remmers LRRK2-trajectactiviteit moduleren.

human-peripheral-blood-neutrophil-isolation-for-interrogating

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Leucine Rich Herhaal Kinase 2 is een grote multidomein kinase, mutaties in die de meest voorkomende genetische oorzaak van de ziekte van Parkinson. Analyse van de kinase-activiteit van dit eiwit heeft zich bewezen als een essentieel instrument in het begrijpen van de biologie en de disfunctie van dit eiwit te zijn. In dit...

Het testen van de kinase-activiteit van LRRK2 In vitro</em

Leucine rich repeat kinases 1 en 2 (LRRK1 en LRRK2) zijn multidomain eiwitten die zowel GTPase en kinase domeinen coderen en die gefosforyleerd zijn in cellen. Hier presenteren we een protocol om LRRK1 en LRRK2 label in cellen met 32p orthofosfaat, waardoor een middel om hun algemene cellulaire fosforylering te meten.

Metabole Labeling van leucine rich repeat Kinasen 1 en 2 met radioactieve fosfaat

Lipoxygenase (LOX) isozymen kunnen producten genereren die neuro-inflammatie en neurodegeneratie kunnen verhogen of verminderen. Een gen-omgeving interactiestudie kan LOX isozym-specifieke effecten identificeren. Met behulp van het 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model van nigrostriatale schade in twee LOX isozym-deficiënte transgene lijnen maakt het mogelijk om de bijdrage van LOX-isozymen aan dopaminerge integriteit en ontsteking te vergelijken.

Gen-omgeving Interactiemodellen om gevoeligheidsmechanismen bij de ziekte van Parkinson te ontmaskeren

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

De huidige studie beschrijft een eenvoudige methode voor het opsporen van endogene niveaus van Rab10 fosforylering door leucine-rijke herhalen kinase 2.

Rab10 fosforylering detectie door LRRK2 activiteit met behulp van SDS-pagina met een fosfaat-bindende-Tag

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Dit werk analyseert de vectordosis en blootstellingstijd die nodig is om neuro-inflammatie, neurodegeneratie en motorische stoornissen te induceren in dit preklinische model van de ziekte van Parkinson. Deze vectoren die coderen voor de menselijke α-synucleïne worden afgeleverd in de substantia nigra om de synucleïnepathologie geassocieerd met de ziekte van Parkinson samen te vatten.

Analyse van het muismodel van de ziekte van Parkinson geïnduceerd door Adeno-geassocieerde virale vectoren die coderen voor menselijk α-synucleïne

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Leer neutrofielen isoleren uit menselijk perifeer bloed voor het meten van LRRK2 kinase activiteit via Rab10 fosforylatie. Deze methode helpt onderzoekers bij het identificeren van patiënten met erfelijke Parkinson.

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie (Video) | JoVE Journal

Menselijke perifere bloed neutrofiele isolatie voor het ondervragen van de Parkinson Geassocieerde LRRK2 Kinase Pathway door de beoordeling van Rab10 fosforylatie

Meer video's verkennen