Name: Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Leer hoe je micro-omgevingsmicroarrays (MEMA) fabriceert om de effecten van gedefinieerde micro-omgevingen op tumorcelgedrag te bestuderen. Deze methode identificeert belangrijke drijfveren van cel fenotypes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH common Fund Library van Network Cellular signaturen (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H. en J. E. K).

Opmerking: Een overzicht van het gehele MEMA-proces, inclusief de geschatte tijd, wordt beschreven in het stroomdiagram in Figuur 1. Dit protocol Details de fabricage van MEMAs in 8-well platen. Het protocol kan worden aangepast voor andere platen of dia's.
1. bereiding van eiwitten, verdunningsmiddelen en kleurings buffers
<ol><li>Evenwichts flacons met ECMs, liganden en cytokines op kamertemperatuur (RT) en centrifugeer kort. Voeg het juiste volume van de juiste RT-buffer toe zoals aangegeven op het productgegevensblad. Volg de aanbeveling van de fabrikant voor voorraad concentraties. Opmerking: In tabel 1 en tabel 2vindt u een volledige lijst van de liganden en ecm's met hun voorraad en de uiteindelijke concentraties. Beide liganden en Ecm's worden meestal gebruikt bij de hoogste concentratie van het bereik dat door de fabrikant wordt aanbevolen en die een biologisch effect uitlokken in standaardcultuur testen van 2 dagen. Behandel eiwitten zachtjes en in bioveiligheidskasten onder laminaire stroming om verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Inincuberen flesjes met zachte schommelen bij RT voor 1 uur. Vortex eiwitten niet, want dit kan leiden tot denatureren.</li>
	<li>Aliquot eiwitten voor lange termijn opslag, zodat alle aliquots alleen voor eenmalig gebruik zijn om afbraak met herhaalde vries/dooi cycli te voorkomen. Bewaar gelyofiliseerde eiwitten bij-80 °C (tenzij anders aangegeven) totdat het nodig is. Zorg voor het verzamelen van alle metadata voor toekomstig gebruik, zoals: (i) eiwit naam, (II) datum voorbereid, (III) partij/partijnummer, (IV) leverancier, (v) catalogus nummer, (VI) concentratie, (VII) volume, en (VIII) Voorbereider.</li>
	<li>Bereid een verdunnings vloeistof buffer met 20% (v/v) glycerol, 10 mM EDTA, 200 mM tris-HCl, pH 7,2 en filter steriliseren. Bewaar deze buffer steriel en bewaar deze bij RT.</li>
	<li>Bereid de kleurings buffer voor met 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2en 0,02% Nan3 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filter en bewaar bij 4 °C.</li>
</ol>2. bereiding van een ECM-bron plaat
<ol><li>Verwijder aliciteerde voorraden ECM-eiwitten die moeten worden gedrukt en ontdooien op ijs. Noteer alle lotnummers voor het bijhouden van metagegevens.</li>
	<li>Veeg buisjes van ontdooide eiwitten zachtjes om een goede resuspensie te garanderen en in een centrifuge te draaien.</li>
	<li>
Maak ECM-print mengsels (Epm's) en een fluorescerende fiducial om te worden gebruikt door een vloeistof behandelings robot die de gerandomiseerde 384-well-bron platen zal maken. Opmerking: de 384-well bron platen worden gebruikt door een touch PIN array printer om de bedrukte arrays te maken in 8 well Plates.<ol>
<li>Label 1,5 mL micro centrifugebuizen voor elke EPM en de fiducial.</li>
		<li>Bereid elke EPM met een combinatie van 125 μL verdunningsmiddel buffer (zie stap 1,4) met het juiste volume ECM-voorraad en breng het mengsel tot een totaal volume van 250 μL met PBS. De uiteindelijke concentraties in elke EPM-buis zullen 1x ECM-eiwitten, 5 mM EDTA, 10% glycerol en 100 mM tris zijn.</li>
		<li>Maak een fluorescerende fiducial door het op te lossen in de door de fabrikant gespecificeerde juiste buffer en breng 250 μL over naar een gelabeld fiducial Tube.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. creatie van de bron plaat met behulp van een Liquid handler
<ol><li>Ontwerp een 384-well plate layout die de posities van de ECMs willekeurig maakt en is geoptimaliseerd voor de array printer PIN Head die wordt gebruikt. Ontwerp de plaatsing van de fiducial zodat deze wordt afgedrukt in de rij 1, kolom 1 positie van elk goed om te helpen in de matrix oriëntatie. Opmerking: In totaal worden 14 − 15 replicaten van elke ECM gebruikt om robuuste gegevens te garanderen. Neem extra replicaten van collageen of een andere ECM op die een robuuste bevestiging oplevert voor de beoordeling van de uniformiteit van de binding. De lay-out moet mogelijk meerdere 384-put-platen gebruiken, afhankelijk van het aantal ECMs van belang.</li>
	<li>Breng EPM-buizen over naar een vloeistof behandelaar, houd tubes bij 4 °C met een gekoeld buisrek of met een vloeibare Handling robot die zich in een koude ruimte bevindt.</li>
	<li>Gebruik de software van de Liquid handler om een programma uit te voeren om 15 μL van elke EPM en de fiducial over te brengen naar de vooraf aangewezen putten binnen de 384-bron plaat (en).</li>
	<li>Pipet in alle ongebruikte putjes om de luchtvochtigheid te verhogen en te beschermen tegen uitdroging tijdens het drukproces. Opmerking: Zie afbeelding 2 voor een voorbeeld van een 384-bron plaat set die is geoptimaliseerd voor een 4 x 7-pins kop en bevat een collageen I-blok en PBS.</li>
	<li>Afdichtings plaat (en) en houd deze bij 4 °C tot u klaar bent om af te drukken.</li>
</ol>4. Mema's printen met een array Printing robot
Opmerking: Het volgende deel van het protocol beschrijft specifiek de voorbereiding en het gebruik van MEMA om de impact van verschillende micro-milieu proteïnen op de groei en proliferatie van MCF7 cellen te onderzoeken. Het protocol kan echter gemakkelijk worden aangepast om verschillende liganden, Ecm's en cellen te gebruiken om andere cellijnen en eindpunten van belang te bestuderen.
<ol><li>
Met behulp van een touch PIN printer, afdrukken EPMs en fiducial spots in 8 put platen. Druk meerdere replicaten van elke ECM-voorwaarde af om de reproduceerbaarheid te garanderen. Opmerking: andere plaat formaten of-dia's kunnen worden gebruikt voor afdrukken, maar buffer optimalisatie kan nodig zijn om optimale spot vorming te bereiken.<ol>
<li>Print de ECMs voor de MEMA met behulp van 350 μm diameter pinnen gerangschikt in een 4 x 7 printkop configuratie. Print de arrays in de 8-well platen als 20 kolommen door 35 rijen, voor een totaal van ~ 700 vlekken. Grotere arrays zijn mogelijk in deze platen, maar komen met een trade-off van verhoogde randeffecten in zowel celbinding als kleuring.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na het printen, bewaar de platen in een exsiccator gedurende minimaal 3 dagen voorafgaand aan het gebruik.</li>
</ol>5. creatie van ligand behandelings platen
<ol><li>Ontwerp een 96-well plate layout inclusief liganden van belang. Om de behandeling van veel MEMA platen tegelijk te vergemakkelijken, ontwerpt u deze plaat met spatiëring die het mogelijk maakt om een meerkanaals pipet te gebruiken met 4 verdeelde tips om vloeistoffen over te brengen tussen de putjes van 8-well MEMAs en een 96-well plate. Opmerking: In dit protocol wordt de volledige set van liganden die worden vermeld in tabel 2 gebruikt.</li>
	<li>Liganden op ijs ontdooien. Knip en draai elke Tube kort.</li>
	<li>Verdun de liganden met de door de fabrikant aanbevolen buffer (meestal PBS) tot een 200x werkvoorraad.</li>
	<li>Pipet keer 10 μL van elke 200x ligand kolf in de overeenkomstige put binnen de 96-well plate.</li>
	<li>Afdichting en bewaar de platen bij-20 °C. Opmerking: Maak ligand-behandelings platen in batches, waarbij alle metagegevens voor downstream-analyse worden vastgelegd.</li>
</ol>6. culturing cellen op MEMAs
<ol><li>Blok Mema's gedurende 20 minuten met 2 mL per put van een niet-fouling blokkerende buffer met 1% niet-fouling blokkerende middel (tabel met materialen) in dubbel gedestilleerd water (DDH2O).</li>
	<li>Aanzuig buffer en drievoudige spoel putten met PBS. Om uitdroging te voorkomen, laat u het laatste volume van PBS in putjes tot het celbeplating klaar is. Opmerking: Het is zeer nuttig om twee bench arbeiders voor celkweek stappen op MEMAs hebben. Een werkbank medewerker kan aspiratie stappen uitvoeren, terwijl de tweede de additie stappen uitvoert. Het wordt aanbevolen om een 1 mL multichannel pipet te gebruiken met tips die zijn gespatieerd om de 8-Wells plaat te passen voor pipetteren en een Y-Splitter met twee Pasteur-pipetten om meerdere putten tegelijk te aspireren.</li>
	<li>Zaad 2 x 105 MCF7 cellen per goed in 2 ml van dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) medium met 10% foetaal runderserum (FBS). Opmerking: Voorafgaand aan een volledig MEMA-experiment, voert u een celtitratie-experiment uit om celaantallen zodanig te optimaliseren dat MEMA-vlekken hoge celaantallen hebben (maar niet Confluent zijn) aan het einde van de gewenste experimentele duur.</li>
	<li>Na 2 − 18 h van adhesie, aspiraat medium en vervangen door 2 ml verlaagd groeimedium (DMEM met 0,1% FBS). Opmerking: Verlaagd serum (bijv. 0,1% FBS) of groeifactor-verarmd omstandigheden kunnen op dit moment worden gebruikt om de stimulerende impact van specifieke liganden te isoleren.</li>
	<li>Een ligand-behandelings plaat op ijs ontdooien. Centrifugeer de ontdooide plaat bij 200 x g gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Breng 200 μL medium van elke put in de kweek plaat over naar de juiste put in de behandelings plaat. Pipet omhoog en omlaag om ligand volume te mengen met medium en breng dit mengsel terug naar de juiste put in de MEMA plaat.</li>
	<li>Licht rots met de hand en retourneer MEMA platen naar de incubator. Cultuur voor de duur van het experiment in aanwezigheid van de ligand/ECM combinatie bij 37 °C en 5% CO2. Opmerking: Een typische MEMA experiment loopt voor 72 h; experimenten met langere duur kunnen vervanging van medium en herbehandeling met ligand vereisen.</li>
	<li>Pulse MEMA Wells bij 71 h met 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) voor een uiteindelijke concentratie van 10 μM. inbroed in experimentele omstandigheden met EdU gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Opmerking: Andere Live Cell behandelingen kunnen ook op dit moment worden gebruikt.</li>
</ol>7. fixatie en kleuring van de Mema's
<ol><li>Na 72 h en eventuele Live-cel behandelingen, aspiraat Wells. Fixeer Mema's in 2 mL per put van 2% Paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 min bij RT.</li>
	<li>Aspirate PFA. Permeabilize met 2 ml per put van 0,1% nietionogene oppervlakteactieve stof gedurende 15 min.</li>
	<li>Aspireren de nonionische oppervlakteactieve stof en wassen met 2 mL per put van PBS. De aspirate PBS. Was met 2 mL PBS met 0,05% Polysorbaat 20 (PBS-T). Opmerking: Het MEMA-oppervlak is hydrofoob en het niet wassen met PBS-T vóór de incubatie van vlekken en antilichamen zal resulteren in de vorming van holtes in putten tijdens incubatie stappen en aanleiding geven tot kleurings artefacten.</li>
	<li>Aspirate PBS-T. Voeg EdU-detectie reactie reagentia toe. Incuberen voor 1 uur op RT, schommelen en beschermd tegen licht. Na 1 uur incubatie, dorst lessen-reactie met de meegeleverde commerciële dorst lessen-buffer. Opmerking: EdU detectie en vlekken/antilichaam stappen kunnen worden uitgevoerd in 1,5 mL per goed om de kosten te verlagen.</li>
	<li>Zuig de dorst lessen-buffer op en was met PBS-T voordat u met vlekken of antilichamen inbroed.</li>
	<li>Inincuberen MEMA putten met antilichamen tegen Histon H3K9me3 (1:1000) en fibrillarin (1:400) in kleurings buffer met 2% (w/v) boviene serumalbumine (BSA), 1 mM MgCl2 en 0,02% Nan3 's nachts bij 4 °c. Opmerking: Voer antilichaamtitraties uit om optimale concentraties te bepalen voordat u ze op een volledige MEMA-set gebruikt.</li>
	<li>Na primair antilichaam of vlek incubatie, was Wells 2x met PBS en één keer met PBS-T.</li>
	<li>Voeg secundaire antilichamen toe (Donkey anti-muis IgG en Donkey anti-konijn IgG, beide 1:300) en 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Inincuberen voor 1 uur bij RT in het donker.</li>
	<li>Was Wells 2x met 2 mL per putje van PBS en laat ze in de laatste 2 mL PBS.</li>
	<li>Ga verder naar Imaging of bewaar gekleurd MEMAs voor latere beeldvorming in PBS bij 4 °C beschermd tegen licht.</li>
</ol>8. beeldvorming van Mema's
<ol><li>Afbeelding MEMA op een geautomatiseerd beeldvormings systeem met geschikte fluorescerende detectie kanalen.</li>
	<li>Uitvoer resulterende afbeeldingsgegevens naar een beeldbeheersysteem. Segmenteer cellen en bereken intensiteitsniveaus met CellProfiler8.</li>
</ol>9. gegevensanalyse
Opmerking: Gegevensanalyse bestaat uit normalisatie, variatie correctie en samenvatting van de onbewerkte CellProfiler afgeleide gegevens. In dit geval wordt de R-omgeving met aangepaste code gebruikt om alle stappen uit te voeren. Echter, elke statistische omgeving of softwareprogramma kan worden gebruikt om de equivalente acties uit te voeren. Een voorbeeld van de open source aangepaste code voor de R-omgeving voor analyse is beschikbaar op: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
<ol><li>De gesegmenteerde afbeeldingsgegevens vooraf verwerken en normaliseren.</li>
	<li>Bepaal het aantal steun cellen met behulp van de DAPI gebeitste kernen.</li>
	<li>Auto-Gate EdU-intensiteit om cellen te labelen als EdU+. Meet de proliferatie met behulp van het aandeel van EdU+ -cellen op elke plek.</li>
	<li>Mediaan vat cytoplasmische vlekken en nucleaire morfologie metingen op het niveau van de spot.</li>
	<li>Voer verwijdering van ongewenste variatie (RUV) normalisering op de gegevens om gegevenskwaliteit9te verbeteren. Opmerking: Deze aanpak wordt toegepast op elke intensiteit en morfologie signaal onafhankelijk als een matrix met matrices met behulp van de rijen en vlekken als de kolommen zoals eerder beschreven9.</li>
	<li>Bivariate löss normalisering toepassen op de RUV genormaliseerde restanten met behulp van de array rij en array kolom als de onafhankelijke variabelen om te corrigeren voor ruimtelijke of intensiteit gerelateerde effecten.</li>
	<li>Zodra de normalisatie is voltooid, de mediaan vat de replicaten voor elke micro-omgeving voorwaarde voor rapportage en verdere analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>LaBarge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).</li>
<li>Watson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-Mediated+Mechanisms+of+Resistance+to+HER2+Inhibitors+Differ+between+HER2%2B+Breast+Cancer+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes.</a> Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).</li>
<li>Ranga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+niche+microarrays+for+systems-level+analyses+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate.</a> Nature Communications. 5, 4324(2014).</li>
<li>Malta, D. F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+microarrays+to+study+inductive+signaling+for+endoderm+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification.</a> Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGagnon-Bartsch%2C+JA+%22University+of+California%2C+Berkeley%2C+Department+of+Statistics%2C+University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley</a>. , Report No. 820 (2013).</li>
<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiated+state+of+normal+and+malignant+cells+or+how+to+define+a+%22normal%22+cell+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture.</a> International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).</li>
<li>Serban, M. A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+extracellular+matrices%3A+solutions+for+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle.</a> Methods. 45 (1), 93-98 (2008).</li>
<li>Kaylan, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+lung+tumor+cell+drug+responses+as+a+function+of+matrix+context+and+genotype+using+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays.</a> Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).</li>
<li>Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Microenvironments+Impose+a+Continuum+of+Cellular+Responses+to+a+Single+Pathway-Targeted+Anti-cancer+Compound%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound.</a> Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het belang van "dimensionaliteit" en context is een motiverende factor geweest in de ontwikkeling van in-vitro cultuur systemen als hulpmiddelen bij de karakterisering van kankercellen door hun interactie met de micro-omgeving11, en het vermogen van in vitro cultuur systemen die de in vivo-omgeving nabootsen, zijn een drijvende kracht achter de zoektocht naar verbetering van die cultuur systemen. In-vitro systemen blijven echter belangrijke instrumenten voor kankeronderzoek, juist vanwege hun verm...

Het kweken van kanker cellijnen op plastic in tweedimensionale (2D) monolagen blijft een van de belangrijkste werkpaarden voor kanker onderzoekers. Echter, de micro-omgeving wordt steeds meer erkend voor haar vermogen om cellulaire fenotypes beïnvloeden. Bij kanker, de tumor micro omgeving is bekend dat het beïnvloeden van meerdere cellulaire gedrag, met inbegrip van de groei, overleving, invasie, en reactie op therapie1,2. Traditionele monolaag celculturen hebben doorgaans geen invloed op de micro-omgeving, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van complexere driedimensionale (3D) assays om cellen te kweken, inclusief in de handel verkrijgbare gezuiverde kelder membraan extracten. Echter, deze gezuiverde matrices zijn meestal ingewikkeld om te gebruiken en lijden aan technische problemen zoals batch variabiliteit3 en complexe composities3. Als gevolg hiervan kan het moeilijk zijn om functie toe te wijzen aan specifieke eiwitten die invloed kunnen hebben op cellulaire fenotypes3.
Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we de micro Environment Microarray (MEMA) technologie ontwikkeld, die de micro-omgeving verlaagt tot eenvoudige combinaties van extracellulaire matrix (ECM) en oplosbare groeifactor eiwitten4,5 . Het MEMA-platform maakt identificatie mogelijk van dominante micro-omgevingsfactoren die van invloed zijn op het gedrag van cellen. Met behulp van een array-indeling, kunnen duizenden combinaties van micro-omgevingsfactoren worden getest in één experiment. De MEMA hier beschreven ondervraagt ~ 2.500 verschillende unieke micro voorwaarden. ECM-eiwitten gedrukt in goed platen vormen groei pads waarop cellen kunnen worden gekweekt. Oplosbare liganden worden toegevoegd aan individuele putten, waardoor unieke combinatorische micro-omgevingen (ECM + ligand) worden gemaakt op elke andere plek waar de cellen worden blootgesteld. Cellen worden meerdere dagen gecultiveerde, vervolgens vast, gekleurd en afbeelding gemaakt om cellulaire fenotypes te beoordelen als gevolg van blootstelling aan deze specifieke combinaties van micro omgevingen. Omdat de micro-omgevingen eenvoudige combinaties zijn, is het eenvoudig om eiwitten te identificeren die belangrijke fenotypische veranderingen in cellen stimuleren. Mema's zijn met succes gebruikt voor het identificeren van factoren die invloed hebben op meerdere cellulaire fenotypes, met inbegrip van die die de beslissingen van de cel van het lot stimuleren en de respons op therapie4,5,6,7. Deze antwoorden kunnen worden gevalideerd in eenvoudige 2D-experimenten en kunnen vervolgens worden beoordeeld onder omstandigheden die meer volledig even de complexiteit van de tumor-micro omgeving. Het MEMA-platform is zeer aanpasbaar aan een verscheidenheid aan celtypen en eindpunten, op voorwaarde dat er goede fenotypische biomarkers beschikbaar zijn.

<table><tbody><tr><td>Aushon 2470</td><td>Aushon BioSystems</td><td></td><td>Arrayer robotsysteem dat in het protocol wordt gebruikt</td></tr><tr><td>Nikon HCA</td><td>Nikon</td><td></td><td>High Content Imaging systeem ontworpen rond Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope</td></tr><tr><td>BioTek Precision XS liquid Handler</td><td>BioTek</td><td></td><td>Robot voor vloeistofverwerking die in het protocol wordt gebruikt</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride bufferoplossing</td><td>Sigma</td><td>T2069</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kolliphor P338</td><td>BASF</td><td>50424591</td><td></td></tr><tr><td>384-well microarray plaat, cilindrische put</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab1055</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 8-well dish</td><td>Thermo Fisher</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% oplossing</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Mask</td><td>Molecular Probes</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>Click-iTEdU Alexa Fluor</td><td>Molecular Probes</td><td>C10357</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Promo Kine</td><td>PK-CA70740043</td><td></td></tr><tr><td>ALCAM</td><td>R & D Systems</td><td>656-AL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-20 (CDH20)</td><td>R & D Systems</td><td>5604-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-6 (CDH6)</td><td>R & D Systems</td><td>2715-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-8 (CDH8)</td><td>R & D Systems</td><td>188-C8</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CD44</td><td>R & D Systems</td><td>3660-CD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CEACAM6</td><td>R & D Systems</td><td>3934-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Collagen I</td><td>Cultrex</td><td>3442-050-01</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Collagen Type II</td><td>Millipore</td><td>CC052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Collagen Type III</td><td>Millipore</td><td>CC054</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Collagen Type IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Collagen Type V</td><td>Millipore</td><td>CC077</td><td>ECM</td></tr><tr><td>COL23A1</td><td>R & D Systems</td><td>4165-CL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Desmoglein 2</td><td>R & D Systems</td><td>947-DM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>E-cadherin (CDH1)</td><td>R & D Systems</td><td>648-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ECM1</td><td>R & D Systems</td><td>3937-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>R & D Systems</td><td>1918-FN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>GAP43</td><td>Abcam</td><td>ab114188</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-500K</td><td>R & D Systems</td><td>GLR002</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-50K</td><td>R & D Systems</td><td>GLR001</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R & D Systems</td><td>720-IC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L6274</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin-5</td><td>Abcam</td><td>ab42326</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Lumican</td><td>R & D Systems</td><td>2846-LU</td><td>ECM</td></tr><tr><td>M-Cad (CDH15)</td><td>R & D Systems</td><td>4096-MC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Nidogen-1</td><td>R & D Systems</td><td>2570-ND</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteoadherin/OSAD</td><td>R & D Systems</td><td>2884-AD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteopontin (SPP)</td><td>R & D Systems</td><td>1433-OP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>P-Cadherin (CDH3)</td><td>R & D Systems</td><td>861-PC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>R & D Systems</td><td>ADP6</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Tenascin C</td><td>R & D Systems</td><td>3358-TC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>VCAM1</td><td>R & D Systems</td><td>ADP5</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>R & D Systems</td><td>2308-VN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>R & D Systems</td><td>2667-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Decorin</td><td>R & D Systems</td><td>143-DE</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>R & D Systems</td><td>3548-F2</td><td>ECM</td></tr><tr><td>SPARC/osteonectin</td><td>R & D Systems</td><td>941-SP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Thrombospondin-1/2</td><td>R & D Systems</td><td>3074-TH</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Brevican</td><td>R & D Systems</td><td>4009-BC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Elastin</td><td>BioMatrix</td><td>5052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibrillin</td><td>Lynn Sakai Lab OHSU</td><td>N/A</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ANGPT2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>623-AN-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL1B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>201-LB-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL8</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>208-IL-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>291-G1-200</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TNFRSF11B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>185-OS</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>507-BP-020</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FLT3LG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>308-FK-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>275-GR-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>DLL4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1506-D4-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>HGF</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>294-HGN-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Wnt5a</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>645-WN-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CTGF</td><td>Life_Technologies_Own</td><td>PHG0286</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>LEP</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>398-LP-01M</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma_Aldrich_Own</td><td>SRP4037-50UG</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FGF6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>238-F6</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>207-IL-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TGFB1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>246-LP-025

micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Het begrijpen van de impact van de micro-omgeving op het fenotype van cellen is een moeilijk probleem vanwege het complexe mengsel van zowel oplosbare groeifactoren als matrix-geassocieerde eiwitten in de micro-omgeving in vivo. Bovendien, gemakkelijk beschikbare reagentia voor het modelleren van micro-omgevingen in vitro meestal gebruik maken van complexe mengsels van eiwitten die zijn niet volledig gedefinieerd en lijden aan batch variabiliteit. Het micro Environment Microarray-platform (MEMA) maakt het mogelijk om duizenden eenvoudige combinaties van micro-milieu proteïnen te beoordelen voor hun impact op cellulaire fenotypes in één enkele test. De mema's worden bereid in goed platen, die het mogelijk maakt de toevoeging van individuele liganden om putten met opgesteld extracellulaire matrix (ECM) eiwitten scheiden. De combinatie van de oplosbare ligand met elke gedrukte ECM vormt een unieke combinatie. Een typische MEMA-test bevat meer dan 2.500 unieke combinatorische micro-omgevingen waarin cellen worden blootgesteld aan een enkelvoudige test. Als test case werd de borstkanker cellijn MCF7 verguld op het MEMA-platform. Analyse van deze assay geïdentificeerd factoren die zowel verbeteren en remmen van de groei en de proliferatie van deze cellen. Het MEMA-platform is zeer flexibel en kan worden uitgebreid voor gebruik met andere biologische vragen buiten kankeronderzoek.

Om de micro-milieueffecten op celgroei en proliferatie te vereenvoudigen en om voorwaarden te identificeren die de celgroei en-proliferatie bevorderen of remmen, werd de borstkanker cellijn MCF7 op een set van acht 8-goed-Mema's, zoals beschreven in het Protocol, gesebeerd. Deze test blootgestelde de cellen aan 48 verschillende ECMs en 57 verschillende liganden, voor een totaal van 2736 combinatorische micromilieuvoor waarden. Na 71 h in de cultuur werden cellen gepulseerd met EdU, vast, doordrongen en gekleurd met DAPI,...

Het doel van de hier gepresenteerde methode is om te laten zien hoe micro Environment micro arrays (MEMA) kunnen worden gefabriceerd en gebruikt voor het ondervragen van de impact van duizenden eenvoudige combinatorische micro-omgevingen op het fenotype van gekweekte cellen.

Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Het bestuderen van de tumor micro-omgeving is moeilijk vanwege de complexiteit. We hebben micro-milieumicroarrays ontwikkeld die bestaan uit eenvoudige combinatorische micro-omgevingen die het mogelijk maken belangrijke drivers van tumorcelfenotypen te identificeren. Het grote voordeel van het MEMA-platform is dat omdat de micro-omgevingscondities allemaal zijn gedefinieerd, het eenvoudig is om micro-omgevingsfactoren te identificeren die fenotypes van belang stimuleren.Het MEMA-platform is breed toepasbaar in andere niet-kankersystemen, waaronder primaire celstammen en stamcellen. Er zijn een aantal technische trucs en stappen die we hebben ontwikkeld om de natte bank werk te versnellen en het protocol te vereenvoudigen. Om te beginnen, gebruik maken van een touch pin printer om extracellulaire matrix print mengsel af te drukken in fiduciale vlekken in acht-well platen.Gebruik pinnen met een diameter van 350 micrometer in een vier-keer-zeven printkopconfiguratie om de extracellulaire matrix voor de micro-milieumicroarrays af te drukken. Het collageenblok wordt op MEMA's afgedrukt als raster. De met PBS gevulde putten zorgen voor extra vochtigheid om uitdroging van de extracellulaire matrixprintmengselbronplaat te voorkomen.Print de arrays in de acht-well platen als 20 kolommen door 35 rijen, voor een totaal van 700 plekken. Na het afdrukken, bewaar platen in een desiccator voor een minimum van drie dagen voorafgaand aan het gebruik. Ontwerp eerst een 96-putplaatlay-out met afstand die het gebruik van een multi-channel pipet met vier gesprede tips mogelijk maakt, zodat de behandeling van veel MEMA-platen in één keer kan worden gedaan.Haal dan de liganden uit de vriezer, en ontdooien in ijs in een laminaire stroomkap. Kort flick en spin naar beneden elke buis. Gebruik de aanbevolen buffer van de fabrikant om de liganden te verdunnen tot een 200-voudig werkvoorraad.Pipette 10 microliter van elke 200-keer ligand voorraad in de overeenkomstige goed binnen de 96-put plaat. Gebruik afdichtingsfolie om de platen te verzegelen en bewaar ze op min-20 graden Celsius. Maak ligand behandelingsplaten in batches en leg alle metadata vast voor downstream-analyse.Voordat de cellen worden geculenturing, blokkeer de MEMA's met twee milliliters per put van niet-bezielende blokkeringsbuffer gedurende 20 minuten. Gebruik een Y-splitter met twee Pasteur pipetten om blokkerende buffer in meerdere putten tegelijk aan tezuilen en vervolgens de putten te wassen met PBS. Om uitdroging te voorkomen, laat u het uiteindelijke volume van PBS in de putten tot het klaar is voor celbeplating.Voordat u een volledig MEMA-experiment uitvoert, optimaliseert u de concentratie van MCF7-celzaaien door een celtration-experiment uit te voeren. Een ideale plek, zoals hier getoond, heeft voldoende celnummers om gegevens te extraheren, maar niet zo veel dat de plek overdreven confluent is. In de MEMA, aspirate de resterende PBS en zaad MCF7 cellen op 30,000 tot 35.000 cellen per put in twee milliliters van zaaien medium.Plaats de MEMA in een couveuse op 37 graden Celsius. Na hechting 's nachts in de couveuse, aspirate het medium en vervangen door twee milliliter van verminderde groei medium om de stimulerende impact van specifieke liganden te isoleren. Ontdooi vervolgens een eerder bevroren ligandbehandelingsplaat op ijs.Centrifuge ontdooide plaat op 200 keer g gedurende een minuut. Breng 200 microliter medium van elke put in de MEMA-kweekplaat over naar de juiste put in de ligandbehandelingsplaat. Pipet op en neer om de ligand met het medium te mengen en dit mengsel terug te brengen naar de juiste put in de MEMA-cultuurplaat.Licht gesteente met de hand en breng de MEMA-platen terug naar de couveuse om de ligand-ECM-combinatie te verkrachteren bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Voeg na 71 uur 100 keer EdU toe aan de MEMA-putten voor een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar. Broed het nog een uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Na de laatste incubatie, aspirate de putten. Fix MEMAs in twee milliliter per put van 2%PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Dan aspirate de PFA uit de putten.Permeabiliseren met twee milliliter per put van 0,1% nonionische oppervlakteactieve gedurende 15 minuten. Aspirate de oppervlakteactieve, en dan was de putten met twee milliliter PBS en PBS-T, sequentieel. Voeg daarna 1,5 milliliter EdU-detectiereactiereagentia toe aan elke put.Een uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur, schommelend en beschermd tegen licht. Dan blus de reactie met 1,5 milliliter commerciële blusbuffer per put. Spoel opnieuw aan en was met PBS-T voorafgaand aan het uitbroeden met geoptimaliseerde concentraties vlekken of antilichamen.Incubeer MEMA putten met primaire antilichamen in kleuring buffer, schommelen op vier graden Celsius 's nachts. Na primaire antilichaam incubatie, was putten met PBS, gevolgd door PBS-T. Voeg secundaire antilichamen toe in 0,5 microgram per milliliter DAPI, verdund in kleuringbuffer.Incubeer, schommelen voor een uur op kamertemperatuur in het donker. Was putten twee keer met twee milliliter per put van PBS, en laat ze in de laatste twee milliliter PBS. Om beeld bevlekte MEMA, plaats het op de microscoop stadium van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem met de juiste tl-detectie kanalen.Resulterende beeldgegevens naar een beeldbeheersysteem. Segmenteer cellen en bereken intensiteitsniveaus met CellProfiler. In dit protocol geven celcyclusprofielen van binned DAPI-intensiteitswaarden versus celtellingen van één acht-putplaat cellen aan in G1 versus G2-celcyclusfase.Dit komt overeen met twee nDNA-gehalte in cellen in de vroege groeifase, en vier nDNA-inhoud in cellen die op het punt staan mitose te ondergaan. De impact van de micro-omgeving van liganden en ECM op zowel celnummer als EdU-integratie wordt weergegeven. Rood geeft een hoger celnummer aan en blauw is een lager celnummer.Veel van de effecten zijn ligand-gedreven, omdat de ECM-aandoening geen sterk effect had op celnummer of EdU-positiviteit. Natagen 1 is een duidelijke uitzondering, omdat de aanwezigheid van dit ECM-molecuul de celbinding en groei van MCF7 remt. Liganden zoals FGF6 en neuregulin-1 alpha verbeteren het celaantal en hebben hoge percentages EdU-integratie, terwijl liganden zoals amphiregulin en neuregulin-1 SMDF celbinding en groei van cellen remmen.Een voorbeeld van MCF7 cellen groeien op een MEMA plek behandeld met neuregulin-1 alpha toont hoge tarieven van EdU integratie, aangegeven door roze kernen. In deze afbeelding is groene vlek een celmasker en blauw IS DAPI. Aangezien een volledig MEMA-experiment duur is, is het erg belangrijk om optimalisatiestappen uit te voeren, zoals cel- en serumtitraties, voordat het volledige experiment wordt uitgevoerd.Zodra micro-milieuomstandigheden van belang worden geïdentificeerd met behulp van het MEMA-platform, kunnen de specifieke liganden en extracellulaire matrixeiwitten dieper worden bestudeerd met behulp van traditionele 2D- en 3D-celkweeksystemen.

using-microarrays-to-interrogate-microenvironmental-impact-on

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een combinatorische functionele screening methode voor het verkrijgen van inzicht in de effecten van de moleculaire samenstelling van micro-omgevingen op cellulaire functies beschreven. De methode maakt gebruik van bestaande micro-array gebaseerde technologieën voor het genereren van arrays van gedefinieerde combinatorische micro-omgevingen die ondersteuning bieden voor celadhesie en functionele analyse.

Fabricage en gebruik van micro-omgeving microarrays (MEArrays)

This video describes the technique to study the protein expression in miRNA transfected lung cancer cells by using antibody microarray to measure specific gene expression. In the featured protocol, we perform antibody microarray for the identification of the activity of a combinatorial miRNA treatment in halting cell cycle and angiogenesis.

Antibody Microarray: A Technique to Study the Protein Expression of miRNA Treated Lung Cancer Cells

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

miRNA therapeutics hebben aanzienlijke potentieel bij het reguleren van de progressie van kanker. Hier gedemonstreerd worden analytische benaderingen gebruikt voor de identificatie van de activiteit van een combinatorische miRNA behandeling in het stoppen van de celcyclus en angiogenese.

Analyse van combinatoriële miRNA behandelingen te reguleren celcyclus en angiogenese

Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een diermodel dat directe testen van de effecten van tumorhypoxie op metastase en het ontcijferen van de werkingsmechanismen mogelijk maakt. Hoewel de hier beschreven experimenten zich richten op Ewing-sarcoom, kan een vergelijkbare aanpak worden toegepast op andere tumortypen.

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

Leer hoe je micro-omgevingsmicroarrays (MEMA) fabriceert om de effecten van gedefinieerde micro-omgevingen op tumorcelgedrag te bestuderen. Deze methode identificeert belangrijke drijfveren van cel fenotypes.

Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker

Meer video's verkennen