Micro arrays gebruiken om micro-milieueffecten te ondervragen op cellulaire fenotypes bij kanker

Het bestuderen van de tumor micro-omgeving is moeilijk vanwege de complexiteit. We hebben micro-milieumicroarrays ontwikkeld die bestaan uit eenvoudige combinatorische micro-omgevingen die het mogelijk maken belangrijke drivers van tumorcelfenotypen te identificeren. Het grote voordeel van het MEMA-platform is dat omdat de micro-omgevingscondities allemaal zijn gedefinieerd, het eenvoudig is om micro-omgevingsfactoren te identificeren die fenotypes van belang stimuleren.

Het MEMA-platform is breed toepasbaar in andere niet-kankersystemen, waaronder primaire celstammen en stamcellen. Er zijn een aantal technische trucs en stappen die we hebben ontwikkeld om de natte bank werk te versnellen en het protocol te vereenvoudigen. Om te beginnen, gebruik maken van een touch pin printer om extracellulaire matrix print mengsel af te drukken in fiduciale vlekken in acht-well platen.

Gebruik pinnen met een diameter van 350 micrometer in een vier-keer-zeven printkopconfiguratie om de extracellulaire matrix voor de micro-milieumicroarrays af te drukken. Het collageenblok wordt op MEMA's afgedrukt als raster. De met PBS gevulde putten zorgen voor extra vochtigheid om uitdroging van de extracellulaire matrixprintmengselbronplaat te voorkomen.

Print de arrays in de acht-well platen als 20 kolommen door 35 rijen, voor een totaal van 700 plekken. Na het afdrukken, bewaar platen in een desiccator voor een minimum van drie dagen voorafgaand aan het gebruik. Ontwerp eerst een 96-putplaatlay-out met afstand die het gebruik van een multi-channel pipet met vier gesprede tips mogelijk maakt, zodat de behandeling van veel MEMA-platen in één keer kan worden gedaan.

Haal dan de liganden uit de vriezer, en ontdooien in ijs in een laminaire stroomkap. Kort flick en spin naar beneden elke buis. Gebruik de aanbevolen buffer van de fabrikant om de liganden te verdunnen tot een 200-voudig werkvoorraad.

Pipette 10 microliter van elke 200-keer ligand voorraad in de overeenkomstige goed binnen de 96-put plaat. Gebruik afdichtingsfolie om de platen te verzegelen en bewaar ze op min-20 graden Celsius. Maak ligand behandelingsplaten in batches en leg alle metadata vast voor downstream-analyse.

Voordat de cellen worden geculenturing, blokkeer de MEMA's met twee milliliters per put van niet-bezielende blokkeringsbuffer gedurende 20 minuten. Gebruik een Y-splitter met twee Pasteur pipetten om blokkerende buffer in meerdere putten tegelijk aan tezuilen en vervolgens de putten te wassen met PBS. Om uitdroging te voorkomen, laat u het uiteindelijke volume van PBS in de putten tot het klaar is voor celbeplating.

Voordat u een volledig MEMA-experiment uitvoert, optimaliseert u de concentratie van MCF7-celzaaien door een celtration-experiment uit te voeren. Een ideale plek, zoals hier getoond, heeft voldoende celnummers om gegevens te extraheren, maar niet zo veel dat de plek overdreven confluent is. In de MEMA, aspirate de resterende PBS en zaad MCF7 cellen op 30,000 tot 35.000 cellen per put in twee milliliters van zaaien medium.

Plaats de MEMA in een couveuse op 37 graden Celsius. Na hechting 's nachts in de couveuse, aspirate het medium en vervangen door twee milliliter van verminderde groei medium om de stimulerende impact van specifieke liganden te isoleren. Ontdooi vervolgens een eerder bevroren ligandbehandelingsplaat op ijs.

Centrifuge ontdooide plaat op 200 keer g gedurende een minuut. Breng 200 microliter medium van elke put in de MEMA-kweekplaat over naar de juiste put in de ligandbehandelingsplaat. Pipet op en neer om de ligand met het medium te mengen en dit mengsel terug te brengen naar de juiste put in de MEMA-cultuurplaat.

Licht gesteente met de hand en breng de MEMA-platen terug naar de couveuse om de ligand-ECM-combinatie te verkrachteren bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Voeg na 71 uur 100 keer EdU toe aan de MEMA-putten voor een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar. Broed het nog een uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Na de laatste incubatie, aspirate de putten. Fix MEMAs in twee milliliter per put van 2%PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Dan aspirate de PFA uit de putten.

Permeabiliseren met twee milliliter per put van 0,1% nonionische oppervlakteactieve gedurende 15 minuten. Aspirate de oppervlakteactieve, en dan was de putten met twee milliliter PBS en PBS-T, sequentieel. Voeg daarna 1,5 milliliter EdU-detectiereactiereagentia toe aan elke put.

Een uur lang uitbroeden bij kamertemperatuur, schommelend en beschermd tegen licht. Dan blus de reactie met 1,5 milliliter commerciële blusbuffer per put. Spoel opnieuw aan en was met PBS-T voorafgaand aan het uitbroeden met geoptimaliseerde concentraties vlekken of antilichamen.

Incubeer MEMA putten met primaire antilichamen in kleuring buffer, schommelen op vier graden Celsius 's nachts. Na primaire antilichaam incubatie, was putten met PBS, gevolgd door PBS-T. Voeg secundaire antilichamen toe in 0,5 microgram per milliliter DAPI, verdund in kleuringbuffer.

Incubeer, schommelen voor een uur op kamertemperatuur in het donker. Was putten twee keer met twee milliliter per put van PBS, en laat ze in de laatste twee milliliter PBS. Om beeld bevlekte MEMA, plaats het op de microscoop stadium van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem met de juiste tl-detectie kanalen.

Resulterende beeldgegevens naar een beeldbeheersysteem. Segmenteer cellen en bereken intensiteitsniveaus met CellProfiler. In dit protocol geven celcyclusprofielen van binned DAPI-intensiteitswaarden versus celtellingen van één acht-putplaat cellen aan in G1 versus G2-celcyclusfase.

Dit komt overeen met twee nDNA-gehalte in cellen in de vroege groeifase, en vier nDNA-inhoud in cellen die op het punt staan mitose te ondergaan. De impact van de micro-omgeving van liganden en ECM op zowel celnummer als EdU-integratie wordt weergegeven. Rood geeft een hoger celnummer aan en blauw is een lager celnummer.

Veel van de effecten zijn ligand-gedreven, omdat de ECM-aandoening geen sterk effect had op celnummer of EdU-positiviteit. Natagen 1 is een duidelijke uitzondering, omdat de aanwezigheid van dit ECM-molecuul de celbinding en groei van MCF7 remt. Liganden zoals FGF6 en neuregulin-1 alpha verbeteren het celaantal en hebben hoge percentages EdU-integratie, terwijl liganden zoals amphiregulin en neuregulin-1 SMDF celbinding en groei van cellen remmen.

Een voorbeeld van MCF7 cellen groeien op een MEMA plek behandeld met neuregulin-1 alpha toont hoge tarieven van EdU integratie, aangegeven door roze kernen. In deze afbeelding is groene vlek een celmasker en blauw IS DAPI. Aangezien een volledig MEMA-experiment duur is, is het erg belangrijk om optimalisatiestappen uit te voeren, zoals cel- en serumtitraties, voordat het volledige experiment wordt uitgevoerd.

Zodra micro-milieuomstandigheden van belang worden geïdentificeerd met behulp van het MEMA-platform, kunnen de specifieke liganden en extracellulaire matrixeiwitten dieper worden bestudeerd met behulp van traditionele 2D- en 3D-celkweeksystemen.