Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Door dit protocol te volgen, zal de gebruiker in staat zijn om AAV vectoren van hoge zuiverheid en opbrengst geschikt voor in vitro of in vivo toepassingen te produceren. Dit protocol kan worden gebruikt voor het produceren en zuiveren van een reeks AAV-serotypen met verschillen in configuraties. Het combineren van deze twee elementen kan nuttig zijn om celtype en weefselspecifieke expressie te verkrijgen.

Productie van sommige serotypes kan geven aan een lagere opbrengst. Dit is de productie waarbij er nauwe serotypen zijn en op individuele basis moet worden geëvalueerd. Het aantonen van deze procedures zal Shelly Fripont, een technicus van ons laboratorium.

Na het kweken van de HEK-cellen, meng 360 microgram helper plasmide, 180 microgram plasmide codering van de vector capsid, en 180 microgram plasmide met het transgeen in 18 milliliter van 150 millimolar natriumchloride om de DNA-mix voor te bereiden. Verdeel deze mix over drie 50 milliliter conische buizen. Meng in een nieuwe conische buis 840 microgram PEI en zes milliliter natriumchloride van 150 millimolar om de PEI-mix voor te bereiden op zes celkweekschotels.

Voeg vervolgens zes milliliter van de PEI-mix, druppel voor druppel, toe aan een van de conische buizen die de DNA-mix bevatten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder vervolgens zes celkweekgerechten uit de couveuse.

In een laminaire flow kap, volledig aspirate het medium van elk gerecht. Spoel de gerechten af met vijf milliliter voorverwarmde DPBS om sporen van het medium te verwijderen. Kantel elke schotel voorzichtig om ervoor te zorgen dat DPBS gelijkmatig over het hele oppervlak wordt verdeeld.

Vervolgens, voorzichtig aspirate de DPBS. Voeg 12 milliliter DMEM een aan elke schotel langzaam, met een pipet geplaatst aan de rand van de schotel. Meng het PEI- en DNA-mengsel door het drie tot vijf keer op en neer te buigen.

Voeg twee milliliter van dit mengsel aan elk van de zes celkweek gerechten in een druppel voor druppel mode, zorg ervoor dat zorgvuldig te verdelen over het hele oppervlak. Herhaal dit proces met behulp van zes celkweek gerechten tegelijk tot het bereiken van 18 celkweek gerechten. Schud voorzichtig de celkweekschotels om het PEI DNA-mengsel te verdelen.

Incubeer de doorfecteerde cellen op 37 graden Celsius met 95 procent vochtigheid en vijf procent kooldioxide gedurende vijf uur. Voeg hierna nog eens 12 milliliter DMEM 10 toe aan elk van de 18 gerechten zonder het reeds bestaande medium te verwijderen. Doorgaan met het uitbroeden van de transfected cellen in dezelfde omstandigheden.

Gebruik na 72 uur na de transfectie een celschraper om de cellen zorgvuldig los te maken van elk kweekgerecht. Verzamel het medium en de cellen van twee kweekgerechten in een 15 milliliter conische buis, bewaard op ijs. Centrifugeer de buizen op 420 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten met de versnelling en vertraging van de centrifuge ingesteld op maximaal.

Gooi de supernatant voorzichtig van elke buis door het voorzichtig in een afvalcontainer te gieten. Plaats vervolgens de buizen met de celkorrels op ijs. We schorten elke pellet op in twee milliliter lysebuffer en mengen door vijf tot 10 keer op en neer te pipetten.

Trek de AAV uit drie buizen, samen. Om te beginnen, bevriezen de opnieuw opgehangen cellen door ze te plaatsen in een emmer met droogijs vermengd met ethanol. Ontdooi vervolgens de cellen door ze onmiddellijk in een waterbad te plaatsen dat op 37 graden Celsius is ingesteld.

Herhaal deze vries- en dooicyclus drie keer om de cellen te lyseen en de AAV-deeltjes vrij te geven. Na de derde ontdooiing stap, centrifuge op 1167 keer G en op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Breng de supernatants voorzichtig over om 50 milliliter conische buizen schoon te maken.

Voeg nuclease toe aan elke buis aan een laatste concentratie van 50 eenheden per milliliter supernatant. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, terwijl wervelende de buizen om de 10 minuten om ervoor te zorgen dat de nuclease is grondig gemengd met de supernatant. Centrifuge op 13490 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten om de supernatant te verduidelijken.

Verwijder hierna de zuiger van een spuit van 10 milliliter, bevestig een filter van 0,45 micrometer aan de spuit en plaats deze bovenop een schone conische buis van 50 milliliter. Vul de spuit voorzichtig met de verduidelijkte supernatant. Gebruik de zuiger om het lysaat door het filter te forceren.

Bereid vervolgens elk van de iodixanolfracties voor in vier afzonderlijke conische buizen van 50 milliliter, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Pipette acht milliliter van 15 procent iodixanol in elk van de drie ultracentrifugebuizen. Pipette 5,5 milliliter van 25 procent iodixanol in een schone 50 milliliter conische buis.

Met behulp van een niet-afgestudeerde Pasteur pipet, zorgvuldig laag 5,5 milliliter van 25 procent iodixanol oplossing onder de 15 procent iodixanol oplossing. Voeg de oplossingen van 40 procent en 60 procent toe zoals beschreven in het tekstprotocol. Iodixanol fracties mogen niet mengen op gelaagdheid.

Met behulp van een Pasteur pipet, laag de ruwe lysate op de top van de 15 procent iodixanol gradiënt, druppel voor druppel, om te voorkomen dat verstoring van de interface tussen de ruwe lysaat en de iodixanol oplossing. Vul elke ultracentrifugatiebuis met lysebuffer totdat de meniscus de basis van de buisnek bereikt, om ervoor te zorgen dat de buis niet instort onder de zeer hoge krachten die tijdens ultracentrifugatie worden gegenereerd. Sluit de buizen met de juiste deksels.

Zorg er met behulp van een digitale weegschaal voor dat alle drie de ultracentrifugatiebuizen hetzelfde gewicht hebben. Het gewicht zo nodig aanpassen, door meer lyse buffer toe te voegen bovenop het ruwe lysaat. Gebruik een titanium rotor met vaste hoek om de buizen op 301580 keer G en bij 12 graden Celsius gedurende een uur en 40 minuten te centrifugeren met maximale acceleratie en vertraging.

Bevestig vervolgens een naald aan een spuit van vijf milliliter. Verwijder de afstandsaar van de buizen in de rotor en herstel de buizen na centrifugalisatie. Aspirate alleen de 40 procent iodixanol fractie die de vector deeltjes bevat.

Verwerk het monster of bewaar het op vier graden Celsius. Hier wordt een protocol aangetoond dat kan worden gebruikt om AAV-vectoren te produceren met een verscheidenheid aan capsids, genoomconfiguraties, promotortypen en transgene ladingen. In dit voorbeeld produceerden en gezuiverd we twee verschillende AAV-vectoren die het groene fluorescerende eiwit uitdrukten uit een zelf-complementair genoom.

De twee vectoren onderscheiden zich door verschillende capsids:PHPB en AAV9. Zij werden geleverd, via staartaderinjectie, in volwassen C57 zwarte zes muizen. Om de niveaus van transgene expressie drie weken na injectie te evalueren, worden secties gekleurd met primaire antilichamen tegen GFP met detectie met behulp van secundaire antilichamen geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof.

Fluorescentieintensiteitsmetingen tonen een aanzienlijke toename van de GFP-expressie wanneer de PHPB-vector wordt gebruikt ten opzichte van AAV9. Toename van GFP werden waargenomen in het cerebrum, het cerebellum en in de hersenstam. Het nauwkeurig verzamelen van de vector met een fractie is cruciaal voor dit protocol.

In het geval dat dit niet goed gebeurt, worden de vectoropbrengst en de vectorzuiverheid negatief beïnvloed. In staat zijn om AAV-vectoren te produceren, zullen kleine laboratoria in staat zijn om te profiteren van tal van experimentele mogelijkheden om genen in het centrale zenuwstelsel te leveren. Dit protocol vereist het gebruik van een ultracentrifuge en het is belangrijk om een goede training te krijgen voordat dit wordt behandeld om ongelukken te voorkomen.

Bovendien worden AAV-vectoren vaak geclassificeerd als biohazards en daarom moet u lokale regelgeving raadplegen voordat u ze behandelt en beheert.