Name: Een plaat-gebaseerde chemo test voor de beoordeling van de rat placenta Natural Killer Cell cytolytische functie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer een plaat-gebaseerde kleurmetrische test om de cytolytische functie van rat placenta Natural Killer Cell te beoordelen. Deze eenvoudige, kosteneffectieve methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van de hart Long en van het bloed van de nationale instituten van gezondheid onder toelage R00HL130456, het nationale Instituut van algemene medische wetenschappen van de nationale instituten van gezondheid onder toekenning P20GM104357, en door Mississippi INBRE, gefinancierd door een Institutional Development Award (IDeA) van de nationale instituten van de algemene medische wetenschappen van de nationale instituten voor gezondheid onder Grant Number P20GM103476. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de nationale instituten van de gezondheid.

Alle protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite aan de Universiteit van Mississippi Medical Center. De zorg en de behandeling van de dieren waren in overeenstemming met de nationale instituten van gezondheidsrichtlijnen voor ethische dierlijke behandeling.
1. cel van de lymfocyten isolatie van Placentas
<ol><li>Verwijder een placenta uit de rat baarmoeder (zwangerschap dag 19) en plaats in 10 mL ijskoude PBS8.</li>
	<li>Plaats een placenta op een 100 µm filter en zitten in een Petri schaaltje met 13,5 mL RPMI en 1,5 mL FBS (totale volume is 15 mL). Gebruik de platte kant van een spuit zuiger om de placenta te duwen door het filter in de Petri schaal.</li>
	<li>Bereid 3 15 mL kegelvormige buizen voor elk weefsel. Voeg 3 mL dichtheidsgradiënt medium (Zie de lijst van materialen) aan elke buis, dan voorzichtig overlay 5 ml gehomogeniseerd placenta in elke buis.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 25 min bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT) zonder rem. Verzamel de dunne witte Buffy Layer met een transfer pipet. Opmerking: Na centrifugeren, 3 lagen zichtbaar zijn, de rode RPMI aan de top, de witte Buffy Layer in het midden, en de duidelijke dichtheid gradiënt medium laag aan de onderkant. Gebruik een transfer pipet te trekken van de witte Buffy laag uit de buis. Combineer Buffy laag van alle buizen van dezelfde placenta in 1 tube.</li>
	<li>Voeg 10 mL RPMI aan gecombineerde Buffy lagen. Centrifugeer gedurende 10 min, 300 x g, bij 4 °c en gooi bovendrijvende.</li>
</ol>2. isolatie van natuurlijke killer cellen
<ol><li>Opnieuw op te schorten cel pellet in 50 l van ijskoude PBS</li>
	<li>Voeg Biotine-gelabelde CD3 antilichaam aan pelleted cellen volgens het Protocol van de fabrikant en meng goed met een pipet. Plaats de buis in een buis Rotator en incubeer 20 min bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 1 mL RPMI toe, Centrifugeer gedurende 10 min bij 400 x g en 4 °c, en gooi bovendrijvende.</li>
	<li>Hersuspendeer de pellet in 1 mL RPMI en Combineer met 150 l van magnetische kralen in een 1,5 mL micro centrifugebuis. Plaats de micro centrifugebuis in een buis Rotator en roteer terwijl het uitbroeden 30 min bij 4 °C. Opmerking: Trek de release buffer op dit moment en laat RT in de bioveiligheid te bereiken.</li>
	<li>Plaats de tubes in de magneet voor 1 min. Verzamel bovendrijvende en bewaar CD3-Cell populatie in een 15 mL Tube op ijs. Opmerking: Dit is de CD3- populatie van cellen.</li>
	<li>Haal de tube uit de magneet en voeg 1 mL RPMI toe. Meng de cellen en kralen 5 keer met een pipet.</li>
	<li>Herhaal stap 2,5.</li>
	<li>Centrifugeer de CD3- populatie van cellen voor 10 min bij 400 x g en 4 °c en gooi bovendrijvende. Hersuspendeer de Cell pellet in 50 l van ijskoude PBS</li>
	<li>Voeg Biotine-gelabeld CD161a antilichaam toe aan CD3- cellen volgens het Protocol van de fabrikant en meng goed. Plaats de tube in een buis Rotator en incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 1 mL RPMI toe, Centrifugeer gedurende 10 min bij 400 x g en 4 °c, en gooi bovendrijvende. Hersuspendeer de pellet in 1 mL RPMI en Combineer met 150 l van magnetische kralen in een 1,5 mL micro centrifugebuis.</li>
	<li>Plaats micro centrifugebuis in een buis Rotator en roteer terwijl het uitbroeden 30 min bij 4 °C.</li>
	<li>Plaats de buizen in een magneet voor 1 min. Verzamel bovendrijvende en negeer CD3-/CD161a- Cells.</li>
	<li>Verwijder de tube van de magneet en voeg 1 mL RPMI toe. Meng de cellen en kralen 5 keer met een pipet.</li>
	<li>Herhaal stap 2,12.</li>
	<li>Verwijder de microcentrifuge tubes uit de magneet en voeg 1 mL RT vrijgave buffer toe. Plaats de tube op de buis Rotator en draai tijdens de incubatie gedurende 15 minuten bij RT.</li>
	<li>Plaats buizen in magneet voor 1 min. Verzamel bovendrijvende in een nieuwe 15 mL conische buis op ijs. Opmerking: Dit is de populatie van NK-cellen.</li>
	<li>Verwijder de tube van de magneet en voeg 1 mL RT RPMI toe. Meng de cellen en kralen 5 keer met een pipet.</li>
	<li>Herhaal stap 2,16, het plaatsen van bovendrijvende in dezelfde buis. Meng goed en neem een 20 l Steekmonster om cellen te tellen Opmerking: Houd de tube op het ijs.</li>
	<li>Centrifugeer CD3-/CD161a+ cellen voor 10 min, 400 x g bij 4 °c, verwijder dan bovendrijvende. Hersuspendeer de cellen in RPMI (10% FBS, 1% pen/keelontsteking, 2 ng/mL IL-2) en zaad bij een concentratie van 3 x 105 cellen/goed in een 6-well plaat in 2,5 ml NK cel activatie media. Incubeer cellen voor 48 h bij 37 °C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.</li>
</ol>3. chemo test: het ophalen van NK-cellen of YAC1 uit cultuur of het passeren van cellen
Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder de motorkap. Alle celwanden moeten te allen tijde op het ijs worden gehouden.
<ol><li>Gebruik een glazen serologische pipet om YAC1 cellen en media te verzamelen uit de kolf, plaats in een 50 mL Tube op ijs, en meng goed. Neem 20 µ L om cellen te tellen.</li>
	<li>Draai de YAC1 cellen gedurende 10 min bij 300 x g en 4 °c. Tel cellen terwijl deze draaien.</li>
	<li>Voeg trypsine/EDTA aan elk goed in een NK cel 6-well plaat. Tik op de plaat en plaats in incubator.</li>
	<li>Nadat de cellen zijn uitgebroed met trypsine/EDTA voor ~ 5 min bij 37 ° c, schraap de plaat/kolf met een steriele plaat schraper. Voeg 1 mL NK Cell media toe aan elk goed.</li>
	<li>Verzamel cellen en media met serologisch pipet en verzamel in een 15 mL centrifugebuis. Neem 20 µ L om cellen te tellen.</li>
	<li>Draai de NK-cellen voor 10 min, 400 x g bij 4 °c. Tel de steekproef van cellen van stap 3,5 tijdens deze centrifugeren. Opmerking: Bekijk de kweek platen onder een Microscoop alvorens ze te teruggooi om er zeker van te zijn dat er geen cellen meer aan de bodem van de putten worden vastgehouden. Aangezien het experiment gebruikmaakt van NK-cellen en YAC1 cellen, moet u elk afzonderlijktellen.</li>
	<li>Tel cellen en opnieuw op te schorten bij de concentraties bepaald in optimalisatie proeven om te testen voor het juiste aantal target: effect ratio. Dit zal worden bereikt door het opnieuw opschorten van de pellet in hun overeenkomstige media om de volgende cel concentraties te maken: YAC1 bij 4 x 105 cellen/ml en NK-cellen op 2 x 107 cellen/ml.</li>
</ol>4. de test van de chemo analyse: het Protocol van de analyse
<ol><li>Gebruik een ronde bodem, cultuur behandeld 96-well plaat om het opzetten van de plaat, zoals voorgesteld in tabel 1. Deze tabel toont de experimentele controles en 3 sets van NK-experimentele kolommen. Dit kan worden uitgebreid tot een totaal van 10 NK-experimentele zuilen in een 96-well plaat.</li>
	<li>Centrifugeer de assay plaat bij 250 x g voor 4 min om er zeker van te zijn dat de effect-en doelcellen in contact zijn. Incubeer de 96-well plaat voor 5 uur in een bevochtigde kamer incubator bij 37 °C, 5% CO2 om voldoende contact te bereiken tussen target en effect cellen en target cel lysis door de effect cellen. Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken.</li>
	<li>45 min voorafgaand aan het oogsten supernatants, voeg 10 µ L van 10x lysis oplossing aan de doel cel toe maximum LDH versie putten (Wells 1E, 1F, 1G, en 1H) en plaats de plaat terug in de bevochtigde kamer.</li>
	<li>Na de incubatietijd is voltooid, centrifugeer de plaat op 250 x g voor 4 min. met behulp van een multikanaals pipetter, overdracht 50 µ l van alle putten naar een verse 96-goed platte bodem assay plaat. Opmerking: Raak niet de bodem van de putten aan zodat de cellen niet in de verse testplaat worden overgebracht. Gebruik geen gekweekte behandelde plaat als de verse assay plaat.</li>
	<li>
Maak assay reagens.
	<ol>
<li>Na assay buffer heeft bereikt kamertemperatuur, Voeg 12 mL van de test buffer op een substraat mix fles. Omkeren en schud zachtjes tot volledig opgelost. 1 fles is genoeg voor 2 96-goed platen. Opmerking: Assay buffer moet worden beschermd tegen licht tijdens het ontdooien. Meng onmiddellijk voorafgaand aan gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 50 µ L van assay reagens toe aan alle putten in de assay plaat van stap 4,6. Bedek de plaat met folie om het te beschermen tegen licht en incuberen voor 30 min bij kamertemperatuur. Opmerking: Nieuw gemaakt assay reagens moet worden opgeslagen in een vriezer. Reagens is goed voor ongeveer 8 weken.</li>
	<li>Voeg 50 µ L van stop oplossing voor elk goed. Lees de plaat binnen 1 uur na het toevoegen van stop-oplossing en registreer de absorptie op 490 nm. Representatieve gegevens worden weergegeven in tabel 2.</li>
</ol>5. berekening van de resultaten
<ol><li>Bereken de gemiddelde absorptiewaarde van de Cultuurmiddel grote achtergrond putten en aftrekken van alle absorptiewaarden voor experimentele, target cel spontane LDH release en effect cel spontane LDH release Wells.</li>
	<li>Bereken de gemiddelde absorptiewaarden voor de volume correctie controleputten en aftrekken van de absorptiewaarden verworven voor de doelgroep cel maximale LDH release Control Wells.</li>
	<li>Gebruik de gecorrigeerde waarden uit de stappen 5,1 en 5,2 in de volgende formule om het percentage chemo voor elke effect meter te berekenen: doel goed. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58961/58961eq1.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Mediators%3A+A+causal+link+to+hypertension+during+pregnancy-+Studies+in+Preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia.</a> British Journal of Pharmacology. , (2018).</li>
<li>Elfarra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+mediate+pathophysiology+in+response+to+reduced+uterine+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure.</a> Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).</li>
<li>Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+of+the+lytic+action+of+immune+lymphoid+cells+on+51-Cr-labelled+allogeneic+target+cells+in+vitro%3B+inhibition+by+isoantibody+and+by+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs.</a> Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).</li>
<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).</li>
<li>Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+for+Assessment+of+Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Using+Image+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry.</a> PLoS One. 10 (10), 0141074(2015).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Karimi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cytotoxicity+by+bioluminescence+imaging+outperforms+the+standard+chromium-51+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay.</a> PLoS One. 9 (2), 89357(2014).</li>
<li>Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+gastroschisis+experimental+model+and+the+influence+of+the+mother%27s+diet+enriched+with+glutamine+in+the+fetal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cir%C3%BArgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology.</a> Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).</li>
<li>Lv, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+distinction+of+rat+liver+natural+killer+cells+from+spleen+natural+killer+cells+under+normal+and+acidic+conditions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+and+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro.</a> Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).</li>
<li>Flieger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+cellular+cytotoxicity+test+based+on+the+differential+assessment+of+living+and+killed+target+and+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells.</a> Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).</li>
<li>Jang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+flow+cytometry-based+natural+killer+cytotoxicity+assay+involving+calcein+AM+staining+of+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells.</a> Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengeling, financieel of anderszins, worden verklaard door de auteurs.

Er zijn een aantal belangrijke belangrijkste nota's om voor optimale resultaten te overwegen. De steriliteit van de gebruikte cellen is zeer belangrijk. Na het verzamelen van de placenta is het belangrijk dat de voorbereiding en isolatie van de NK-cellen onder steriele omstandigheden in een Biosafety-kabinet wordt uitgevoerd. Omdat alle cellen LDH op cellulaire beschadigingen vrijgeven, moet er ook voor worden gezorgd dat NK-cellen na isolatie en tijdens het co-cultuur proces een hoge levensvatbaarheid krijgen. Te veel s...

Preeclampsia is een hypertensieve wanorde van zwangerschap die door foetale de groeibeperking, eind orgaanschade en chronische immune activering wordt gekenmerkt. Chronische immuun activering bij vrouwen met Preeclampsia leidt tot verhoogde circulerende en placenta inflammatoire cytokines, een onevenwichtigheid in CD4+ T cellen populaties, en een verhoogde populatie van activated Natural Killer (NK) cellen1. Studies onlangs gepubliceerd door ons lab tonen een rol voor NK-cellen in het veroorzaken van een aantal van de pathofysiologie geassocieerd met Preeclampsia in de verminderde uteriene bloeddruk (RUPP) Rat model van Preeclampsia. Gebruikend Stroom Cytometry om oppervlakte uitdrukking van activerings markeringen op NK cellen te meten, werd een verhoogde bevolking van geactiveerde NK cellen in de omloop en de placentas van RUPP ratten in vergelijking met normale zwangere (NP) ratten waargenomen2.
Om de flow Cytometry observaties te bevestigen, werden functionele studies uitgevoerd om de chemo activiteit van NK-cellen die geïsoleerd zijn van de placenta van NP en RUPP ratten te beoordelen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de beoordeling van de chemo functie van chemo CD8+ T-cellen en NK-cellen. De gouden standaard voor functionele chemo-analyse is de chromium-vrijgave assay3. Andere ontwikkelde protocollen gebruikt omvatten flow Cytometry4, image Cytometry5, calceïne release6, en meest recent bioluminescentie7. Deze video zal een gedetailleerd protocol over het gebruik van de gerenommeerde lactaatdehydrogenase (LDH) release assay te meten chemo-functie van NK-cellen met behulp van een commercieel beschikbare LDH chemo graad assay kit.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>Fisher</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;L Filter</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td>Nylon Mesh</td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Fisher</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>Fisher</td><td>14823436</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Fisher</td><td>7203510</td><td></td></tr><tr><td>6-well cell culture plate</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>96-well Tissue Culture Plate</td><td>CELLTREAT</td><td>229190</td><td>Steriel, Ronde Bodem</td></tr><tr><td>AOPI</td><td>Nexcelom</td><td>CS201065ML</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Fisher</td><td>8100241</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Disposable Counting Chambers</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Image Cytometer</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit</td><td>Promega</td><td>G1780</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Flowcomp Flexi Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11061D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry Tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Fisher</td><td>NC0460539</td><td>Dichtheidsgradiënt medium; 4 x 250 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH3025801</td><td>10 x 500 mL</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>9720500</td><td>Zonder Pad</td></tr><tr><td>Purified Mouse anti-Rat CD161a</td><td>BD Biosciences</td><td>555006</td><td></td></tr><tr><td>Purified Mouse anti-Rat CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>554829</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Rat IL-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>502-RL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td>1640 Medium</td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>YAC-1 cell</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr></tbody></table>

een plaat-gebaseerde chemo test voor de beoordeling van de rat placenta natural killer cell cytolytische functie

A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function

Het is algemeen bekend dat deciduale Natural Killer (NK) cellen een cruciale rol spelen bij het opzetten en onderhouden van een normale zwangerschap. Recente studies hebben aangetoond een veranderde populatie van circulerende en deciduale NK cellen bij vrouwen die last hebben van ongunstige zwangerschap complicaties, zoals terugkerende miskraam en Preeclampsia. De studies van onze groep hebben aangetoond dat de hypertensie in zwangerschap met een verhoogde bevolking van geactiveerde NK cellen in de placenta wordt geassocieerd die op de uitdrukking van de markeringen van de oppervlakte activering wordt gebaseerd. Dit manuscript geeft een gedetailleerd protocol om de chemo-functie van NK-cellen geïsoleerd van placenta in een Preeclampsia dierlijk model van chirurgisch geïnduceerde placenta ischemie te beoordelen. De volgende stappen worden in detail beschreven: generatie van één cel schorsing, NK cel isolatie, ex vivo stimulatie, effect: doel cel co-cultuur, en de chemo analyse.

Placentale NK-cellen verkregen uit NP en RUPP ratten werden uitgebroed voor 5 uur met doelcellen in hun respectieve media op een verhouding van 50:1 (NK: target). De absorptie werd geregistreerd bij 490 nm en de ruwe gegevens worden getoond in lijst 2. De gemiddelde absorptie van de Cultuurmiddel grote achtergrond en de de controleputten van de volume correctie werden berekend. Deze gemiddelden werden afgetrokken van de aangewezen putten die in het Protocol van de fabrikant worden vermeld en zijn vertege...

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren en beoordelen van de chemo-functie van Natural killer cellen van placentas door een colorimetrische plaat assay. De verminderde uteriene bloeddruk rat model van placentale ischemie werd gekozen om de antilichaam-gemedieerde isolatie en beoordeling van de chemo-functie van Natural killer cellen aan te tonen.

Een plaat-gebaseerde chemo test voor de beoordeling van de rat placenta Natural Killer Cell cytolytische functie

It is well known that decidual natural killer (NK) cells play a critical role in establishment and maintenance of normal pregnancy. Recent studies have ...

Deze methode helpt bij het vergelijken van de cytotoxische activiteit van verschillende celtypen met behulp van een eenvoudige, goedkope methode die geen gespecialiseerde apparatuur vereist. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet het gebruik van gevaarlijke stoffen vereist, het is goedkoop en vereist niet het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. Deze methode kan worden toegepast om cytotoxische activiteit van andere celtypen zoals CD8 plus cytolytische cellen te meten of zelfs om spontane dood van cellen te beoordelen zonder uitbroeding, zonder cytolytische effectorcellen.Individuen die nieuw zijn bij deze techniek zullen waarschijnlijk worstelen met de optimalisatie van doel tot effector celverhouding. Mijn advies is om een grondige zoektocht van de literatuur te doen om de verhoudingen die je zou testen bij het optimaliseren van het protocol te bepalen. Hoewel deze methode geen gespecialiseerde vaardigheden vereist, anders dan pipetting nauwkeurig, zijn de isolatie van mononucleaire cellen en de opstelling van de testplaat stappen die gemakkelijker kunnen worden begrepen en nagebootst als ze visueel worden waargenomen.Het aantonen van de procedure zal Ch

a-plate-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-rat-placental-natural

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Cytotoxiciteit assays op natural killer cellen lytische reacties maatregel om de HIV-geïnfecteerde cellen wordt beperkt door de zuiverheid van de doelcellen. Tonen we hier de isolatie van een sterk gezuiverde populatie van HIV-1 geïnfecteerde primaire T-cel ontploffing door gebruik te maken van het vermogen van HIV-1 s tot down-moduleren CD4.

Bereiding en het gebruik van HIV-1 geïnfecteerde primaire CD4 + T-cellen als doelcellen in Natural Killer Cell Cytotoxische Assays

This video demonstrates an assay to measure the cytotoxicity of natural killer cells against cancer cells using the Calcein AM stain. The reduced number of fluorescent cancer cells following co-culture with natural killer cells indicates natural killer cell-mediated cytotoxicity toward cancer cells.

Calcein Acetoxymethyl Staining to Evaluate Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity toward Cancer Cells

This video demonstrates an in vitro technique to measure the cytotoxic ability of cytokine-induced killer (CIK) cells against cancer cells. Upon co-culturing target cancer cells with CIK cells, the dead cancer cells are identified using a fluorescent viability dye and are quantified using flow cytometry, estimating the cytotoxic effect of CIK cells.

An In Vitro Assay to Study the Cytotoxic Capability of Cytokine-Induced Killer Cells

This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

This video demonstrates performing a lactate dehydrogenase release assay to determine the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the target cancer cells. The assay quantifies the release of the cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme from cancer cells by measuring the absorbance of the red-colored product formed.

An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells

Marginerende leverleukocyten vertonen unieke kenmerken en verschillende immunologische functies in vergelijking met andere leukocytenpopulaties. Hier beschrijven we een methode voor selectieve oogst van deze specifieke levercelpopulatie, door geforceerde perfusie van de lever van ratten of muizen. Marginerende leverleukocyten lijken cruciaal te zijn bij het bepalen van de vatbaarheid voor levergerelateerde ziekten en metastasen.

Selectief oogsten van Marginating-lever leukocyten

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Ontduiking van natuurlijke killer (NK) celgemedieerde uitroeiing door kankercellen is belangrijk voor kanker initiatie en progressie. Hier presenteren we twee niet-radioactiviteit-gebaseerde protocollen om NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit te evalueren in de richting van levertumorcellen. Daarnaast wordt een derde protocol gepresenteerd om NK-celmigratie te analyseren.

Meting van Natural Killer Cell-Gemedieerde Cytotoxiciteit en Migratie in de context van levertumorcellen

Een protocol voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen door therapeutische antilichamen in menselijke natural killer cellen wordt hier beschreven. Dit kunstmatige stimulatieplatform maakt het mogelijk om stroomafwaartse effectorfuncties te onderzoeken, zoals degranulatie, chemokine / cytokineproductie en signaalroutes gemedieerd door de FcγRIIIa- en Fc-delen van antilichamen die betrokken zijn bij binding.

Beoordeling van menselijke natural killer celgebeurtenissen gedreven door FcγRIIIa betrokkenheid bij de aanwezigheid van therapeutische antilichamen

Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen - Hoechst 33342 en propidium jodide.

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Leer een plaat-gebaseerde kleurmetrische test om de cytolytische functie van rat placenta Natural Killer Cell te beoordelen. Deze eenvoudige, kosteneffectieve methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur.

Een plaat-gebaseerde chemo test voor de beoordeling van de rat placenta Natural Killer Cell cytolytische functie

Meer video's verkennen