Name: Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Leer embryonale weefsels isoleren van kwartel- en kippenembryo's via microchirurgie en enzymatische digestie. Deze methode behoudt biologische eigenschappen voor genexpressie-analyse en functionele assays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn Isabel Alcobia dankbaar voor de kritische lezing van het manuscript, Mário Henriques voor video vertelling en Vitor Proa vanaf de betekening van de histologie van de Instituto de Histologia e Biologia doen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, voor technische ondersteuning. Wij zijn met name dank verschuldigd Paulo Caeiro en Hugo Silva uit de Unidade de audiovisuais (Unit audiovisuele media), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa voor hun uitstekende inzet voor de productie van deze video. Wij erkennen Leica Microsystems voor het vriendelijk het verstrekken van een stereoscoop uitgerust met een video systeem en Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A om bij te dragen met kwartel eieren bevrucht. Dit werk werd gesteund door Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Al deze experimenten volgen de verzorging van de dieren en de ethische richtsnoeren inzake de Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. bevrucht kwartel en kip ei incubatie
<ol><li>Plaats bevruchte eieren van Japanse kwartel (Coturnix coturnix japonica) in een bevochtigde incubator van 38 ° C gedurende 3 dagen. Incubeer de eieren (ei botte uiteinde) naar boven in de luchtkamer. Opmerking: Het bevochtigde milieu wordt bereikt door het plaatsen van een watercontainer onderin de incubator.</li>
	<li>Bevruchte eieren van kippen (Gallus gallus) 2.5 dagenlang in een bevochtigde incubator van 38 ° C incuberen. Incubeer de eieren in een horizontale positie en markeer de bovenzijde met behulp van een stukje houtskool te identificeren van de locatie van het embryo. Opmerking: Beginnen met 40 kwarteleitjes en 60 kippeneieren, bij de vaststelling van dit experiment.</li>
</ol>2. isolatie van kwartel endoderm met het potentiële domein van de serie grondbeginselen
Opmerking: Gebruik een horizontale laminar flow hood en gesteriliseerde instrumenten en materialen voor ei manipulatie procedures onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Verwijder de embryonale regio met het vermoedelijke grondgebied van serie grondbeginselen, de faryngaal boog regio met de 3rd en 4th bogen (3/4PAR), als beschreven7,8.<ol>
<li>Vul een kom groot borosilicaat glas (100 x 50 mm; 100 cm3) met 60 mL koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Met de hulp van gebogen schaar, tik op en een gat circulaire in de shell van een kwartel ei dat gedurende 3 dagen heeft zijn geïncubeerd. Maak het gat aan de andere kant van het ei botte en de dooier (met het embryo) overbrengen in de kom met koud PBS.</li>
		<li>Verwijder het embryo uit de dooier door het snijden van het vitelline membraan extern voor extra embryonale vaartuigen met gebogen schaar.</li>
		<li>Met de hulp van dunne pincet, het embryo transfer een kleine kom (60 x 30 mm; 15 cm3) gevuld met 10 mL koude PBS.</li>
		<li>Met een schuimspaan, het embryo te bewegen tot een 100 mm petrischaal met een zwarte basis (Zie Tabel van materialen) waarin 10 mL koude PBS en plaats deze onder een stereomicroscoop.</li>
		<li>Ontleden de 3/4PAR, als eerder beschreven8.</li>
		<li>Aspirate de 3/4PAR en overdracht aan een glazen schotel driekwart gevuld met koude PBS met behulp van een precisiepipet van 2 mL steriele Pasteur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoleren van de het vermoedelijke grondgebied van serie grondbeginselen (de 3/4PP endoderm) bevattende enzymatische spijsvertering met Pancreatine endoderm.<ol>
<li>Met de hulp van de spatel en dunne Tang, de 3/4PAR overdracht aan een glazen schotel driekwart gevuld met koude Pancreatine (8 mg/mL; 1:3 verdunning van 25 mg/mL met koude PBS).</li>
		<li>Incubeer gedurende 1 h op ijs voor enzymatische spijsvertering. Opmerking: De tijd van de enzymatische spijsvertering hangt af van de fase van ontwikkeling (tabel 1).</li>
		<li>Zet de glazen schotel onder de stereomicroscoop (40 x-60 x vergroting) te isoleren van de endoderm uit de 3/4PAR. Opmerking: Houd alle oppervlakken en oplossingen koud tijdens deze procedure. Wijzigen in een nieuwe koude Pancreatine oplossing als een lange tijd neemt om te ontleden de weefsels (> 15 min). Gebruiken als een bron van verlichting, LED-verlichting in de stereomicroscoop of opgenomen in de optische vezels, gelet op de beperkte warmtebelasting.</li>
		<li>Om te isoleren van de endoderm uit de omliggende weefsels, twee RVS microscalpels in pin houders te gebruiken. Opmerking: Gebruik microscalpels met een diameter tussen 0,1 mm en 0,2 mm en nikkel pin houders met een kaak opening diameter van 0 mm tot 1 mm.<ol>
<li>Verwijder eerst de neurale buis en mesoderm aangesloten op het dorsale oppervlak van de faryngaal endoderm.</li>
			<li>Met de dorsale zijde omhoog, los en verwijder voorzichtig het mesenchym tussen de faryngaal bogen en bloot de faryngaal zakjes. Voer deze procedure uit op beide zijden van de 3/4PAR.</li>
			<li>Verwijder de buis van het hart en het mesenchym rondom de anterior zakjes.</li>
			<li>Met de ventrale zijde omhoog, knip het ectoderm van de 2nd en 3rd faryngaal bogen en verwijder voorzichtig het mesenchym gekoppeld aan het zakken. Herhaal deze procedure aan de andere kant van de 3/4PAR. In dit stadium moet de grondbeginselen van de schildklier zichtbaar zijn.</li>
			<li>Verwijder eventuele resterende mesenchymale cellen gekoppeld aan de faryngaal endoderm met de twee microscalpels.</li>
			<li>Maken van een transversale afgesneden tussen de 2nd en 3rd PP, distantieert de faryngaal endoderm met de 3rd en 4th zakjes van het voorste deel van de met de grondbeginselen van de schildklier en 2nd endoderm faryngaal etui.</li>
			<li>Met de hulp van de spatel en dunne Tang, de geïsoleerde 3/4PP endoderm overdracht aan een glazen schotel driekwart gevuld met 100% koude foetale runderserum (FBS).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Houd het glas schotel met de geïsoleerde weefsels op ijs tijdens de voorbereiding van in-vitro-assay. Als alternatief, de geïsoleerde weefsels ruimtelijk kunnen worden bewaard en ter plaatse geanalyseerd voor gen-expressie.</li>
</ol>3. isolatie van kip somatopleura mesoderm
Opmerking: Uitvoeren ei manipulatie procedures onder steriele omstandigheden met behulp van een horizontale laminar flow hood en gesteriliseerde instrumenten en materialen.
<ol><li>Verwijder het embryonale grondgebied met het mesoderm somatopleura op het niveau van somieten 19-24 (ss19-24).<ol>
<li>Verwijder de kip-ei uit de incubator na 2,5 dagen incubatie.</li>
		<li>Open met een gebogen schaar, een klein gaatje in de shell. Invoegen van een naald en 2 mL albumine gecombineerd met een 10 mL spuit te verlagen van albumine volume binnen het ei en voorkoming van beschadiging van het embryo (gevestigd onder de gemarkeerde regio van de shell). Gooi de aanzuiging albumine.</li>
		<li>Een circulaire gesneden (maximaal tweederde van de bovenste oppervlakte) gat in de gemarkeerde regio van de shell met gebogen schaar.</li>
		<li>Snijd het vitelline membraan extern aan de extraembryonic schepen terwijl het embryo met een dunne Tang.</li>
		<li>Onder een stereomicroscoop, plaats het embryo in een 100 mm petrischaal met een zwarte basis met 10 mL koude PBS. Opmerking: Gebruik een stereomicroscoop vanaf dit punt naar voren voor geleidelijke vergroting van microchirurgie procedures.</li>
		<li>Gebruik vier dunne insect pins te houden van het embryo naar de onderkant van de plaat. Plaats de pinnen in de extraembryonic regio die een vierkante vormen.</li>
		<li>Het uitvoeren van twee sneden tussen de somieten 19 en 24 dwars op de as van het embryo en over het grondgebied van alle embryo's, met behulp van wecker oog schaar.</li>
		<li>Ontgrendel de embryo-sectie, ss19-24, door snijden marginale embryonale randen.</li>
		<li>Aspirate de ss19-24-weefsels en transfer naar een glazen schotel driekwart gevuld met koude PBS met behulp van een precisiepipet van 2 mL steriele Pasteur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De laterale mesoderm uit somatopleura regio (ss19-24) isoleren door enzymatische spijsvertering met Pancreatine (8 mg/mL; 1:3 verdunning van 25 mg/mL met koude PBS).<ol>
<li>Met de hulp van dunne Tang, spatel en overdracht schotel de ss19-24-weefsels met een glas driekwart gevuld met koude Pancreatine oplossing.</li>
		<li>Incubeer gedurende 30 min op ijs voor enzymatische spijsvertering.</li>
		<li>Onder de stereomicroscoop, isoleren het mesoderm uit de omliggende weefsels met behulp van twee microscalpels in een houder. Opmerking: Houd alle oppervlakken en oplossingen koud tijdens deze procedure. Wijzigen in een nieuwe koude Pancreatine oplossing als een lange tijd neemt om te ontleden de weefsels (> 10 min.). Gebruiken als een bron van verlichting, LED-verlichting in de stereomicroscoop of opgenomen in de optische vezels, gelet op de beperkte warmtebelasting.</li>
		<li>Tijdens mesoderm isolatie, verwijdert u eerst het ectoderm aan de oppervlakte gevolgd door zorgvuldige detachement van de weefsels ventrally gelegen splancnopleura.</li>
		<li>Los het recht laterale mesoderm van de somatopleura in een parallel beweging te snijden aan de neurale buis.</li>
		<li>Herhaal het mesoderm scheiding van de linkerkant van het embryo. Opmerking: Zorg dat langzame microscalpel bewegingen tijdens deze procedure. De blootgestelde extra-cellulaire matrix eiwitten vasthouden aan weefsels en instrumenten vloeiende bewegingen te voorkomen.</li>
		<li>Met behulp van een spatel en dunne pincet overdracht de geïsoleerde mesoderm naar een glazen schotel driekwart gevuld met koude FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Houd het glas schotel met de geïsoleerde weefsels op ijs tijdens de voorbereiding van in-vitro-assay.</li>
</ol>4. In vitro organotypic assay: heterospecific vereniging van kwartel 3/4PP endoderm en mesoderm van kip somatopleura
<ol><li>Bereid het kweekmedium met RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen/Strep3,5.</li>
	<li>Het plaatsen van een metalen rooster in een 35 mm petrischaal met 5 mL gestolde voedingsbodem. Opmerking: Verwijder de overmaat vloeistof niveau de middellange oppervlak met de bovenkant van het raster.</li>
	<li>Met de hulp van dunne Tang, dompel een membraanfilter in het kweekmedium en plaats het op de bovenkant van het raster dat één oppervlak in contact met lucht. Opmerking: Een kwart van het gebied van de membraan (met de diameter van 13 mm) is geschikt voor de vereniging van weefsel.</li>
	<li>Onder de stereomicroscoop, associëren de geïsoleerde weefsels op de bovenkant van het membraanfilter. Eerst de 3/4PP endoderm (stap 2) van de glazen schotel overbrengen door zachte glijden met behulp van een transplantatie lepel of spatel, en dun pincet. Herhaal deze procedure voor de geïsoleerde mesoderm (stap 3). Opmerking: Met de hulp van een microscalpel, meng de weefsels te maximaliseren van de vereniging.</li>
	<li>Zorgvuldig plaatst de omliggende weefsels in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2 voor 48 h. gekweekte weefsels kunnen worden geënt op het chorion membraan (CAM). Opmerking: Ectopische orgel vorming in de CAM was eerder gedetailleerde8.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model%3A+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualuzed+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li>
<li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li>
<li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
<li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De embryonale weefsels isolatie procedure hier is verbeterd van vorige technieken voor de productie van kwartel-kip chimeer embryo's in verschillende biologische contexten3,5,6.
Deze aanpak is geschikt voor het isoleren van pure embryonale weefsels zonder genetische manipulatie of het gebruik van weefsel-specifieke markers, die vaak onbepaald zijn, beperking van het gebruik van genetisch gemodificeerd...

In de vroege jaren 1970, werd een elegante kwartel-kip chimera-systeem ontwikkeld door Le Douarin, opening van nieuwe wegen om te begrijpen van de rol van cel migratie en cellulaire interacties tijdens ontwikkeling1,2. Het model is ontwikkeld op de vooronderstelling dat cel uitwisseling tussen de twee soorten embryogenese, later bevestigd wanneer gebruikt bij het bestuderen van tal van ontwikkelings processen, met inbegrip van de vorming van het zenuwstelsel en de hematopoietische niet aanzienlijk zou storen systemen1. De laatste als voorbeeld nemen, de cyclische golven van hematopoietische progenitorcellen koloniseren de serie epitheliale grondbeginselen werd het eerst waargenomen met behulp van de kwartel-kip chimera systeem3. Daarvoor was het toekomstige grondgebied van de zwezerik, de endoderm van de derde en vierde faryngaal zakjes (3/4PP), mechanisch en enzymatisch geïsoleerd van kwartel (q) embryo's in 15 tot 30 - Somiet stadium [embryonale dag (E) 1.5-E2.5]. Deze fasen overeen met kip, Hamburger en Hamilton4 (HH) - fasen 12-17. De isolatie procedures gestart met het gebruik van tripsine enzymatisch verwerpen de endoderm uit de bijgevoegde mesenchym. De geïsoleerde endoderm was geënt op de somatopleura-regio van een embryo van de kip (c) host op E3-E3.5 (HH-etappes 20-21). Deze heterologe mesenchym werd beschouwd als "tolerant" serie epitheel ontwikkeling ook bijdragen aan de vorming van orgel3. Daarna opeenvolgende golven van kip host bloed overgedragen voorlopercellen geïnfiltreerd de kwartel donor serie epitheliale tegenhanger bij te dragen tot thymus vorming in de host embryo3.
Meer recentelijk, een gewijzigde versie van deze aanpak werd ook bewezen als belangrijk voor de studie van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van zwezerik vorming5. In dit opzicht waren de weefsels die betrokken zijn bij de vorming van de ectopische thymus in chimeer embryo's3 geïsoleerd, zowel van de donor- en ontvangende embryo's, en bijbehorende ex vivo. Een verbeterde protocol is gebruikt voor het isoleren van de kwartel 3/4PP endoderm (E2.5-E3) en de kip somatopleura mesoderm (E2.5-E3). Kort, embryonale weefsels werden geïsoleerd door microchirurgie en onder voorbehoud van de in vitro Pancreatine spijsvertering. Ook werden de voorwaarden van enzymatische spijsvertering, temperatuur en tijd van incubatie geoptimaliseerd volgens weefseltype en ontwikkelingsstadium (tabel 1).
Vervolgens werden de geïsoleerde weefsels geassocieerd in een organotypic in vitro systeem voor 48 h, als eerder gemeld5,6. De in vitro vereniging van weefsels bootst de lokale cellulaire interacties in het embryo, het overwinnen van enkele beperkingen van de in vivo manipulatie. Dit systeem is met name nuttig zijn te onderzoeken van cellulaire interacties in complexe morfogenisch gebeurtenissen, zoals de ontwikkeling van het faryngaal apparaat.
De bijdrage van elk weefsel in de thymus histogenesis, alsmede het vermogen van de vereniging van de heterospecific voor het genereren van een thymus kan worden verder onderzocht met behulp van de CAM methodologie, eerder gedetailleerde5,7,8. Bondig, waren de gekweekte weefsels geënt op de nok van cE8 embryo's en kunnen ontwikkelen in ovo voor 10 dagen. Thymus vorming werd vervolgens door morfologische analyse in de geoogste explantaten beoordeeld. Zoals in de klassieke studies van kwartel-kip3, werd de kwartel serie epitheel gekoloniseerd door hematopoïetische voorlopercellen (HPCs), afgeleid van het embryo van de kip, die later werd aangetoond bij te dragen tot orgel ontwikkeling9,10 . De HPCs migreerden vanuit het embryo aan de ectopische chimeer zwezerik tot en met de zeer gevacuoliseerd CAM5,7,-8. Kwartel afgeleide serie epitheel kan worden geïdentificeerd door immunohistochemistry met soortspecifieke antilichamen (dat wil zeggen, QCPN - MAb kwartel PeriNuclear), het overwinnen van de noodzaak van weefsel-specifieke moleculaire merkers.
Deze experimentele methode kunt als de aanpak in twee stappen gemeld in vorige publicatie8, u de modulering van de seingeving trajecten door regelmatige toediening van farmacologische agenten tijdens in vitro en in ovo ontwikkeling. Ook, explantaten geoogst kunnen worden op elk tijdstip van de cursus van het experiment8.
Tot slot, het protocol van de isolatie hier gedetailleerde staat het behoud van de natuurlijke eigenschappen en 3D-architectuur van embryonale weefsels, met name nuttig voor de detaillering ter plaatse van de genexpressie-patronen van embryonale gebieden anders ontoegankelijk door conventionele methoden. Transcriptome analyse benaderingen, met inbegrip van RNA-seq of microarrays, kunnen daarnaast ook worden toegepast in geïsoleerde weefsels zonder genetische tellers terwijl het verstrekken van een weefsel-specifieke hoge-doorvoer "omics" analyse.

<table><tbody><tr><td>Kip bevruchte eieren (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Pluimveehouderij&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwartel bevruchte eieren (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Vogelboerderij&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP centrifugebuizen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP centrifugebuizen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm pyrex schalen</td><td>Duran group</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm pyrex schalen</td><td>Duran group</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Metaal rooster</td><td>Goodfellows</td><td></td><td>fijnmazige  roestvrijstalen rooster</td></tr><tr><td>Membraanfilter</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Isopore membraanfilter</td></tr><tr><td>Petrischaal, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112 </td><td></td></tr><tr><td>60 x 30 mm pyrex kommen (Klein formaat)</td><td></td><td></td><td>uit de supermarkt </td></tr><tr><td>100 x 50 mm pyrex kommen (Groot formaat)</td><td></td><td></td><td>uit de supermarkt </td></tr><tr><td>Transferpijpjes</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL kunststof pipet</td></tr><tr><td>Glazen pasteurpijpje</td><td>Normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Klaar plastic tape</td><td></td><td></td><td>uit de supermarkt </td></tr><tr><td>Cytokeratine (pan; zuur en basisch, type I en II cytokeratines), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standaard FBS</td></tr><tr><td>Pancreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>Bereid een 25 mg/mL oplossing volgens de instructies van de fabrikant; centrifugeer en filter voor het verdelen in porties en bewaar bij -20&ordm;C. Porties kunnen jarenlang bevroren worden bewaard.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement </td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Om de achterkant van de petrischaal voor te bereiden</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30 </td><td>Dunne pincetten</td></tr><tr><td>Extra fijne Bonn schaar, gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Gebogen schaar</td></tr><tr><td>Insectenpinnen </td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td>0,3 mm roestvrijstalen pin</td></tr><tr><td>Micro spatel </td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Transplantatielepel</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>0,2 mm roestvrijstalen microscalpel</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0,1 mm roestvrijstalen microscalpel</td></tr><tr><td>Moria nikkel geplateerde pin houder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Nikkel geplateerde pin houder</td></tr><tr><td>Moria Geperforeerde lepel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Schep</td></tr><tr><td>Wecker Oog schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer S360 Digitale  plaatjes scanner </td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de thymus

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

De capaciteit om te isoleren van embryonale weefsels was een essentiële stap voor de vaststelling van de kwartel-kip chimera-systeem, dat op zijn beurt heeft verstrekt onbetwiste bijdragen aan de onthulling belangrijke processen in Ontwikkelingsbiologie.
Hierin is een geoptimaliseerde manier om zich te isoleren van embryonale weefsels van kwartels en kippen door microchirurgie en enzymatische spijsvertering met behoud van de biologische eigenschappen beschreven. Na isolatie, weefsels van beide soorten zijn met elkaar verbonden in een organotypic in vitro assay voor 48 h. kwartel en kip weefsels kunnen worden gediscrimineerd door verschillende nucleaire functies en moleculaire merkers waardoor de studie voor de cellulaire cross-talk tussen heterospecific vereniging van weefsels. Deze aanpak is dus een nuttig instrument voor de studie van interacties van de complexe weefsel in ontwikkelings processen met hoogdynamische ruimtelijke wijzigingen, zoals die welke voorkomen tijdens faryngaal genuitdrukking en de vorming van de voordarm Endoderm afkomstige organen. Deze experimentele aanpak was aanvankelijk ontwikkeld om te bestuderen van de epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van de formatie van de thymus. In de prospectieve serie grondbeginselen endoderm afkomstige en mesoderm afkomstige mesenchym, werden geïsoleerd van kwartel en kip embryo's, respectievelijk.
De capaciteit van de omliggende weefsels tot organen kan verder te worden getest door ze te enten op het chorion membraan (CAM) van een embryo van de kip. De CAM biedt voedingsstoffen en gas uitwisseling aan het transplanteren weefsels. Na 10 dagen in ovo ontwikkeling, kunnen de chimeer organen in de geoogste explantaten door conventionele morfologische methodes worden geanalyseerd. Deze procedure staat ook weefsel-specifieke bijdragen tijdens orgel vorming, uit haar eerste ontwikkelen (in vitro) studeren de laatste fasen van de organogenese (in ovo ontwikkeling).
Tot slot, de verbeterde isolatie-methode biedt ook ruimtelijk (3D) bewaard embryonale weefsels, die kunnen ook worden gebruikt voor hoge resolutie topografische analyse van genexpressie-weefsel-specifieke patronen.

Het protocol gegevens een methode om te isoleren van aviaire embryonale weefsels in verschillende cellulaire en ontwikkelingsbiologie biologie technische benaderingen moeten worden gebruikt. Deze methode was eerder werkzaam te bestuderen van epitheliale-mesenchymale interacties tijdens de vroege stadia van zwezerik vorming5. Hierin worden nieuwe resultaten getoond in Figuur 1 en Figuur 2, met behulp van so...

Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Het algemene doel van deze procedure is om een geoptimaliseerde experimentele aanpak te presenteren om embryonale weefsels te isoleren van de kwartel- en kippenembryo's. Met deze techniek verkrijgen we zuivere embryonale weefsels die kunnen worden gebruikt in genexpressiestudies en functionele testen. Weefsels van kwartel en kippenembryo's worden geïsoleerd door microchirurgie en onderworpen aan in vitro enzymatische spijsvertering met behoud van de biologische eigenschappen.Na isolatie kunnen de driedimensionale geconserveerde weefsels worden gebruikt voor analyse van topografische genexpressiepatronen met hoge resolutie. Deze aanpak is vooral nuttig voor het detailleren van in situ genexpressie in embryonale gebieden die anders ontoegankelijk zijn door conventionele methoden. Bovendien kunnen transcriptome-analysebenaderingen ook worden toegepast in geïsoleerde weefsels zonder dat genetische markers nodig zijn, terwijl een weefselspecifieke hoge doorvoeromputanalyse wordt geboden.Als alternatief kunnen de geïsoleerde weefsels van beide soorten gedurende 48 uur worden geassocieerd in een in vitro organotypic test. Deze aanpak maakt het mogelijk om weefsels interacties te bestuderen, omdat kwartel en kippencellen kunnen worden gediscrimineerd door verschillende nucleaire kenmerken en moleculaire markers. De capaciteit van de kweekweefsels om organen te vormen kan verder worden getest door in ovo-test.Deze methode is daarom een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van complexe weefselinteracties in ontwikkelingsprocessen met zeer dynamische ruimtelijke modificaties en kan ook helpen om het potentieel van specifieke embryonale gebieden aan de vorming van organen te onthullen. Als voorbeeld wordt hierin de vorming van kwartelkip chimerische thymus uit geïsoleerde embryonale weefsels beschreven. Ten eerste, de endoderm van de derde en vierde faryngeale zakjes, de toekomstige thymische rudiment is geïsoleerd van de faryngeale regio van kwartel embryo's met drie dagen van ontwikkeling.Vervolgens wordt dit weefsel geassocieerd met een mesenchyme dat in staat is de ontwikkeling ervan te ondersteunen, het somatopleura mesoderm. Ten slotte is de heterospecifieke associatie van weefsels gekweekt in vitro en in ovo om een chimerische thymus te vormen. Voer alle eimanipulatieprocedures uit in steriele omstandigheden met behulp van een horizontale laminaire stroomkap en gesteriliseerde instrumenten en materialen.Bevruchte kwarteleieren werden geïncubeerd met de luchtkamer naar boven gericht. Om te beginnen, verwijder de kwarteleieren uit de couveuse. Bereid een grote borosilicaat glazen kom gevuld met koude PBS.Met een gebogen schaar, tik en snijd een cirkelvormig gat in de schelp van een kwartelei met drie dagen van incubatie. Maak het gat in de andere kant van het ei stomp, en breng de dooier naar de kom met koude PBS. Verwijder het embryo uit de dooier door het vitelline membraan extern te snijden naar extraembryonische vaten.Breng het embryo met behulp van dunne tangen over op een kommetje gevuld met koude PBS en verplaats het embryo vervolgens naar een petrischaaltje met zwarte basis met een skimmer. Verwijder de faryngeale regio met de derde en vierde faryngeale zakjes zoals beschreven in de vorige Jove SPA ligatie. Breng vervolgens het derde en vierde faryngeale booggebied over op een glas dat een uur lang is gevuld met koude pancrea en incubeer, op ijs, voor enzymatische spijsvertering.Merk op dat de incubatietijd van enzymatische spijsvertering afhankelijk is van het ontwikkelingsstadium. Plaats de glazen schaal onder de stereomicroscoop en isoleer het endoderm van het derde en vierde faryngeale booggebied, met behulp van twee micro-scalpel in een houder. Plaats eerst het faryngeale gebied met de rugzijde omhoog, die intern het endoderm en ectoderm in de externe oppervlakte toont.Observeer het ectoderm, endoderm, mesenchyme, hartbuis en ventrale gedeelte van de neurale buis. Verwijder de neurale buis en het mesoderm aan het dorsale oppervlak van het faryngeale endoderm. Observeer de endoderm van de keelholte, de vierde en derde faryngeale zakjes en de hartbuis.Met de rugzijde omhoog, voorzichtig los en verwijder de mesenchyme tussen de faryngeale bogen en bloot de faryngeale zakjes. Voer deze procedure uit aan de andere kant van het faryngeale gebied. Verwijder de mesenchyme bevestigd aan het meest achterste deel van het endoderm en observeer het vierde faryngeale zakje.Met achterste kant omhoog, observeren zowel links als rechts vierde faryngeale zakjes. Ga verder door het verwijderen van de mesenchyme bevestigd aan het meest achterste deel van het endoderm en aan de tweede zak. Verwijder de hartbuis en de mesenchyme rond de binnenzakjes.Met de ventrale kant omhoog, observeer de keelholte endoderm, en de rechterkant van de tweede faryngeale boog. In dit stadium moet het endoderm van de schildklier rudiment zichtbaar zijn. Maak de ectoderm van de tweede en derde faryngeale bogen los en verwijder voorzichtig het mesenchyme van de bogen.Observeer de verwijdering van het mesenchyme van de tweede faryngeale boog aan de rechterkant. Let op de locatie van de vierde en derde zakjes en schildklier rudiment. Verwijder de resten aan mesenchymale cellen die aan de keelholtezakjes worden vastgehefd.Let op de derde en vierde zak van de rechterkant en het vierde zakje aan de linkerkant. Herhaal de mesenchyme detachement van de linkerkant. Let nu op het derde zakje van de linkerkant.Observeer mesenchyme detachement van de tweede boog aan de linkerkant. Houd er rekening mee dat alle oppervlakken en oplossingen tijdens deze procedure koud moeten worden gehouden. Verander in een nieuwe koude pancreatine oplossing en schotel in het geval van het nemen van een lange tijd om de weefsels te ontleden.Tot slot, maak een transversale snede tussen de tweede en derde faryngeale zakjes om de tweede zakjes en de schildklier rudiment te verwijderen. Op dit punt bestaat het geïsoleerde endoderm uit de derde en vierde faryngeale zakjes en het achterste puntje van de keelholte. Verwijder de resten los mesenchyme met behulp van twee micro-scalpels.Breng het geïsoleerde endoderme over in een glazen schaal gevuld met koud foetaal runderserum en houd het tijdens de bereiding van de in vitro-test op ijs. Eieren werden geplaatst in horizontale positie en de bovenzijde gemarkeerd voor het gebruik van een houtskool. Om te beginnen, verwijder de eieren uit de couveuse.Met een gebogen schaar, open een klein gaatje in de schelp, steek een naald, en aspirate twee milliliter albumine met een 10 milliliter spuit. Open een cirkelvormig gat in het gemarkeerde gebied van de schelp en snijd het vitelline membraan extern naar de extra embryonale vaten terwijl u het embryo met dunne tangen vasthoudt. Plaats het embryo onder een stereomicroscoop in een petrischaaltje met zwarte basis met koude PBS.Gebruik vier insectenspelden om het embryo op de bodem van de plaat te houden. Plaats de pinnen in het extraembryonische gebied dat een vierkante vorm vormt. Voer twee sneden uit tussen de somites 19 en 24 transversaal naar de embryo-as en het oversteken van het embryo.Laat deze sectie los door de marginale embryonale randen te snijden. Observeer de laterale plaat, neurale buis en somites. Aspirate en breng de weefsels naar een glazen schaal gevuld met koude pancreain.Incubeer gedurende 30 minuten op ijs voor enzymatische spijsvertering. Onder de stereomicroscoop isoleert u het mesoderme van de omliggende weefsels met behulp van twee microscals in houders. Observeer de somatopleura mesoderm, de splanchnopleura, neurale buis, en ectoderm.Verwijder eerst het ectoderm aan het oppervlak. Observeer de somatopleura mesoderm gescheiden van het ectoderm. Maak vervolgens voorzichtig de ventrally splanchnopleura los van de somatopleura.Observeer de juiste laterale mesoderm van de somatopleura. Laat het los door het in een parallelle beweging naar de neurale buis te snijden. Houd er rekening mee dat alle oppervlakken en oplossingen tijdens deze procedure koud moeten worden gehouden.Verander in een nieuwe koude pancreatine oplossing en schotel in het geval van het nemen van een lange tijd om de weefsels te ontleden. Observeer de linker laterale mesoderm van de somatopleura, somites, neurale buis, en ectoderm. Herhaal de mesoderm release van deze kant.Maak langzame bewegingen met de micro-scalpel. De blootgestelde extracellulaire matrix eiwitten zitten door weefsels en instrumenten, het voorkomen van vloeiende bewegingen. Snijd de somatopleura voorzichtig in een parallelle beweging naar de neurale buis.Breng het geïsoleerde mesoderme over in een glazen schaal gevuld met koud foetaal runderserum en houd het op ijs tijdens de bereiding van in vitro test. Plaats een fijn gemeshed metalen rooster in een petrischaaltje en vul met cultuurmedium. Verwijder de overtollige vloeistoffen om het medium oppervlak te nivelleren met de bovenkant van het rooster.Met behulp van dunne tangen dompelt u een membraanfilter in het kweekmedium en plaatst u het voorzichtig op de bovenkant van het rooster om een oppervlak met haar in contact te hebben. Breng onder de stereomicroscoop het geïsoleerde endoderm van de glazen schaal naar het membraanfilter door voorzichtig te glijden met behulp van spatel en dunne tangen. Herhaal deze procedure voor het geïsoleerde mesoderm.Met behulp van een micro-scalpel, meng de weefsels om het associatie te maximaliseren. Plaats de bijbehorende weefsels voorzichtig in een bevochtigde couveuse op 37 graden met 5% CO2 gedurende 48 uur. Na de incubatietijd, graf de kweekweefsels op het coriolan type membraan en laat het zich ontwikkelen in ovaal voor verdere 10 dagen om orgaanvorming te voltooien zoals eerder beschreven.Hier is de reticulaire methode die het mogelijk maakt de isolatie van aviaire embryonale weefsels worden gebruikt in verschillende experimentele benaderingen. Als voorbeeld, de expressie van genen waarvan bekend is dat betrokken zijn bij de vorming van de faryngeale zakjes werden ook geëvalueerd een geïsoleerd endoderm met de tweede, derde en vierde faryngeale zakjes van kippen embryo's op embryonale dag drie en een half door hele mount in situ hybridisatie. De uitdrukking van Sonic Hedgehog werd gedetecteerd in het endoderm van de centrale keelholte en uitgesloten van de zakjes, terwijl BMP7 werd uitgedrukt in de endoderm van de tweede en derde faryngeale zakjes en uitgesloten van de centrale farynx en vierde faryngeale zak.Geïsoleerde weefsels kunnen ook worden vitro specifiek geassocieerd in vitro voor 48 uur, graft op de coriolan type membraan, en mag ontwikkelen voor verdere 10 dagen. Explants kunnen worden geanalyseerd door conventionele histologie en immunohistochemie. Enkele representatieve resultaten van de associatie van kwartel endoderm uit de derde en vierde faryngeale zakjes met kip somatopleura mesoderm zijn de volgende-Grafts toonde een volledig gevormde chimerische thymus met kwartel afgeleid thymische epitheliale cellen positief voor QCPN en kip lymfecellen.Bovendien vertoonde cytokeratine positief thymisch epitheel normale morfologische kenmerken, met een typische reticulaire architectuur. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip hebben hoe kwartel en kip embryonale weefsels die kunnen worden gebruikt in genexpressie studies te isoleren en door de vorming van chimeric organen kan ook helpen ontcijferen van de complexiteit van orgaan genetica.

isolation-embryonic-tissues-formation-quail-chicken-chimeric-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze paper presenteren we een methode voor het transplanteren van menselijke stamcellen in verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van de kip embryo. Dit zorgt voor...

Xenotransplantatie van menselijke stamcellen in het kippenembryo

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor chimeer embryo's die zijn ontworpen om de soortspecifieke bijdragen van neurale en / of andere weefsels craniofaciale ontwikkeling testen genereren.

Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

Dit artikel bevat een bijgewerkte aanpak van de klassieke kwartel-kip chimera systeem te bestuderen van de vorming van het orgel, door het combineren van nieuwe in vitro en in ovo experimentele procedures.

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

Hier presenteren we een organotypic kweken protocol om te groeien van embryonale kip organen in vitro. Met deze methode kan de ontwikkeling van embryonale kip weefsel worden bestudeerd, met behoud van een hoge mate van controle over de omgeving van de cultuur.

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek die is ontworpen om de signalerings- en patrooneigenschappen van basale voorhersenen tijdens craniofaciale ontwikkeling te testen.

Het creëren van aviaire voorhersenen chimaera's om de gezichtsontwikkeling te beoordelen

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het isoleren van preadipocyten uit vetweefsel in vleeskuikenembryo's. Deze methode maakt isolatie mogelijk met een hoge opbrengst, primaire cultuur en adipogene differentiatie van preadipocyten. Olie Rode O-kleuring en lipide/ DNA-kleuring maten het adipogene vermogen van geïsoleerde cellen geïnduceerd met differentiatiemedia.

Isolatie van preadipocyten uit vleeskuikenembryo's

Hier beschrijven we protocollen voor drie soorten vogelembryonale huidexplantatieculturen die kunnen worden gebruikt om weefselinteracties te onderzoeken, 4D-beeldvorming timelapse-film (3D plus tijd), globale of lokale verstoring van de moleculaire functie en karakterisering van systeembiologie.

Explantaten van de vogelhuid gebruiken om weefselpatronen en organogenese te bestuderen

Microarray-technologie maakt kwantitatieve meting en profielbepaling van genexpressie van transcripten op genoombreed niveau mogelijk. Daarom biedt dit protocol een geoptimaliseerde technische procedure in een tweekleurige op maat gemaakte boviene array met gebruik van boviene embryo's op dag 7 om de haalbaarheid van het gebruik van een kleine hoeveelheid totaal RNA aan te tonen.

Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Leer embryonale weefsels isoleren van kwartel- en kippenembryo's via microchirurgie en enzymatische digestie. Deze methode behoudt biologische eigenschappen voor genexpressie-analyse en functionele assays.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

Meer video's verkennen