Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay

Gap knooppunten zijn voorgesteld als drugs doelwitten. Iodide-YFP-GJIC-test is compatibel met high-throughput screening om gap junction modulators te ontdekken. Het is gebruikt om de effecten van een groot aantal verbindingen op gap junction activiteiten te testen in een relatief korte periode.

Iodide-YFP-GJIC test is eenvoudig, robuust, herhaalbaar en goedkoop. Deze test vereist alleen acceptor- en donorcellen en twee evenwichtige zoutoplossingen. Er zijn geen extra reagentia nodig, zoals Lucifer geel en Calcein AM.

Ook meet het totale gap junction activiteiten van de cellen in een enkele put die resulteert in een lage tussen-goed variabiliteit. Om te beginnen met deze procedure groeien LN215 cellen tot 80%samenvloeiing in de aangevulde DMEM zoals beschreven in het tekstprotocol. Een dag voor transductie was de cellen twee keer met 10 milliliter PBS.

Voeg twee milliliter van 0,25% trypsine EDTA toe aan de cellen en broed gedurende drie minuten uit bij 37 graden Celsius. Met behulp van een 10-milliliter serologische pipet resuspend de cellen in vijf milliliter van cultuurmedium en pas de celdichtheid aan 50.000 cellen per milliliter. Voeg 400 microliter media die 20.000 cellen bevat toe aan elke put van een 24-put kweekplaat.

Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag transduceren twee putten door het vervangen van de cultuur medium met 400 microliter van een een-op-een mengsel van een lentivirus en verse cultuur medium aangevuld met polybrene bij een uiteindelijke concentratie van vier microgram per milliliter. Voor de geen viruscontroles vervang het cultuurmiddel met vers cultuurmiddel dat met polybrene bij een definitieve concentratie van vier microgram per milliliter wordt aangevuld.

Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 15 uur. Dan aspirate het medium met lentivirussen, en verse cultuur medium. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius voor een extra 72 uur.

Daarna was je de cellen in elke put twee keer met 0,5 milliliter PBS. Voeg 300 microliter van 0,25% trypsine EDTA toe aan de cellen en broed gedurende drie minuten uit bij 37 graden Celsius. Resuspend de cellen in twee milliliter van cultuurmedium, en dan plaat ze in zes-goed cultuur platen met twee microgram per milliliter puromycine.

Kweek de cellen tot alle cellen in de controleputten dood zijn, wat meestal ongeveer een week duurt. Ten eerste, afzonderlijk cultuur LN215-YFP en LN215-jodide cellen in 100-millimeter platen in cultuur medium om de populaties die nodig zijn voor de test te bereiken. Een dag voor de test, was elke plaat met 10 milliliter PBS.

Behandel elke plaat met twee milliliter van 0,25% trypsine EDTA-oplossing en broed gedurende vijf minuten uit op 37 graden Celsius. Resuspend de cellen in vier milliliter van cultuurmedium en breng ze over naar een 15-milliliter conische buizen. Centrifuge op 1.000 g gedurende drie minuten om de cellen te pelleteren.

Gooi de supernatant en resuspend elke cel pellet in vijf milliliter van cultuur medium. Pipette op en neer ongeveer 20 keer te breken een cel klonten. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.

En verdun dan de cellen in kweekmedium om celsuspensie te maken bij de dichtheden die hier worden getoond. Meng vervolgens zeven milliliter van elke celsuspensie samen in een reservoir. Gebruik een multichannel pipet om 100 microliters van dit mengsel toe te voegen aan elke put van een 96-well cultuurplaat.

Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende 24 uur. Gebruik eerst een fluorescentiemicroscoop met 20x vergroting en een GFP-filter om de 96-put platen te controleren om er zeker van te zijn dat er geen klonten cellen zijn, en dat de culturen volledig samenvoezig en goed verdeeld zijn. Ten minste 30 minuten voordat de test zet een microplate lezer en zet het op 37 graden Celsius.

Was de slang van een geautomatiseerde injector met drie milliliter van 70%ethanol, drie milliliter gedestilleerd water en drie milliliter I-oplossing. Verwarm vervolgens de C- en I-oplossingen tot 37 graden Celsius in een waterbad. Ofwel aspirate het groeimedium of omkeren van de plaat om het te legen.

Tik op elk restmedium. Voeg vervolgens de C-oplossing toe aan een reservoir met behulp van een multichannel pipet om 200 microliters C-oplossing toe te voegen aan elke put van de plaat. Ofwel aspirate de oplossing of omkeren van de plaat om te legen, waardoor elke resterende oplossing tappen.

Voeg 50 microliter C-oplossing toe aan elke put. Voeg vervolgens een microliter van een 2,5-millimolar chemische voorraad of DMSO als een voertuig, en voeg nog eens 50 microliter van C-oplossing aan elke put. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in de lucht gedurende ongeveer 10 minuten.

Begin tijdens de incubatie de parameters in het microplate-lezersprogramma in te stellen door op de knop Protocollen beheren te klikken. Klik op de knop Nieuw. Selecteer de fluorescentieintensiteit in de sectie Metingsmethode en Put-modus in de sectie Leesmodus.

Klik vervolgens op de knop OK. Er verschijnt een nieuw tabblad. Stel in het menu Basisparameters de excitatiegolflengte in op 485 nanometer en de emissie op 520 nanometer.

Selecteer de onderste optische om fluorescentie van onderen te lezen. Stel vervolgens de begintijd van de meting in op nul seconden, het aantal intervallen op 25, het aantal flitsen per put en interval op 20 en de intervaltijd op 0,4 seconden. Teken in het menu Indeling een gebied van de te lezen plaat.

In het menu Concentraties/Volumes/Shacking stelt u de microplatelezer in om 100 microliter I-oplossing te injecteren voor elke put met een injectiesnelheid van 135 microliters per seconde. In het menu Injectietijd stelt u de begintijd van de injectie in op één seconde. Klik vervolgens op de knop Meting starten.

Wanneer de incubatie is voltooid, breng je de 96-put platen over naar de microplate-lezer en start de meting door opnieuw op de metingknop Start te klikken. In deze studie wordt de jodiumgel fluorescerende eiwit-gap junction-intercellulaire communicatietest gebruikt met LN215-YFP en LN215-jodiumcellen om 2, 320 chemische stoffen te screenen om nieuwe gap junction intracellulaire communicatiemodulatoren te identificeren. Homosalaat wordt gezien als 50% van gap junction intracellulaire communicatie remmen.

Terwijl terbinafine het volledig remt. Dit bevestigt terbinafine als een gap junction remmer. Deze test meet GJIC tussen naburige donor en acceptor cellen, zodat de donor en acceptor cellen volledig moeten worden gescheiden voordat plating.

En de samenvloeiing van de gemengde cultuur moet 100% zijn om de vorming van kloofknooppunten tussen cellen te maximaliseren. Tijd cursus gegevens, dosis respons relaties, en de beoordeling van de omkeerbaarheid van gap junction modulators kunnen worden verkregen met Iodide-YFP-GJIC test. Ook Iodide-YFP specifieke connexin GJIC testen kunnen worden vastgesteld door het induceren van de expressie van een connexin van belang in de cellen verstoken van functionele kloof knooppunten.

Dit maakt het mogelijk om de IC50-waarde van een chemische stof van een specifiek type connexin te bepalen. Iodide-YFP-GJIC-test kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer, omdat het robuust, herhaalbaar en goedkoop is. Deze tests helpt bij het vinden van gap junction modulerende chemische stoffen voor drugs ontdekking en toxicologische beoordeling.