Name: Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer de Iodide-YFP-GJIC-assay voor high-throughput screening van gap junction-modulatoren met LN215-cellen. Deze methode identificeert verbindingen zoals homosalate voor farmacologisch en toxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de fundamentele wetenschap Research Program via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, en 2018R1A6A1A03023718).

1. generatie van lentivirussen YFPQL en SLC26A4
<ol><li>Groeien HEK293T menselijke embryonale nier cellen tot 80% confluency op 100 mm cultuur platen. Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine is het medium van de cultuur in het gehele protocol gebruikt om HEK293T en andere cellen die hieronder vermeld.</li>
	<li>Jas 6-well cultuur platen door toevoeging van 2 mL van 0.005% van steriele poly-L-lysine (PLL) oplossing aan elk putje voor 10 min. de PLL-oplossing gecombineerd en spoel het oppervlak tweemaal met 2 mL steriel water.</li>
	<li>Wash de HEK293T cellen met 10 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en behandelen van de cel monolayers in elke schotel 100 mm met 0,25% trypsine-EDTA-oplossing 2 mL bij 37 ° C gedurende 3 min. Voeg 5 mL gestolde voedingsbodem en resuspendeer de cellen.</li>
	<li>De cellen in een hemocytometer tellen en aanpassen van de dichtheid van de celsuspensie tot 250.000 cellen/mL in een cultuurmedium en 500.000 cellen in 2 mL gestolde voedingsbodem toevoegen aan elk lysine-gecoate goed voor 6-Wells-platen. Incubeer de cellen in een bevochtigde 5% CO2/95% lucht atmosfeer bij 37 ° C gedurende 24 uur en vervolgens vervangen door het kweekmedium DMEM zonder penicilline en streptomycine.</li>
	<li>In een buis 1,5 mL, Verdun 20 µL van transfectiereagens met 500 µL van DMEM zonder serum of antibiotica. Meng zachtjes door pipetteren en laat het staan bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Ondertussen, Pipetteer 250 µL van DMEM in elk van twee 1,5 mL tubes en voegt u 1500 ng van pLVX-EIP-YFPQL of pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng van psPAX2 en 375 ng van pMD2.G aan elk. De twee lentivirale plasmiden geweest eerder beschreven21. 250 µL van verdunde transfectiereagens toevoegen aan elke buis plasmide, meng zachtjes en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Na 20 min, voeg 500 µL van transfectie reagens en plasmide complexen in de 1,5 mL tubes ontkleuring aan elke cultuur plaat goed in stap 1.4 en meng door de plaat heen en weer schommelen. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator voor 12u.</li>
	<li>Vervang het medium met 2,5 mL verse voedingsbodem en incubeer gedurende een extra 48 uur. Plaats vervolgens de cultuur-plaat op ijs gedurende 5 minuten om te houden van het geconditioneerde medium met lentivirus gekoeld te handhaven infectiviteit.</li>
	<li>Het medium met lentivirussen oogsten en transfer naar 15 mL conische buizen. Centrifugeer bij 3000 x g bij 4 ° C gedurende 3 minuten en zwevende HEK293T cellen van het supernatant door filtratie op 0.4 µm.</li>
	<li>Bewaar het medium met lentivirussen bij 4 ° C voor gebruik binnen de 2 dagen. Opslaan voor later gebruik, 200 µL aliquots bij −80 ° C.</li>
</ol>2. productie van LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen door lentivirale transductie
<ol><li>Groeien LN215 cellen in 100 mm cultuur platen tot 80% confluency in DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) 100 U/mL penicilline, en 100 µg/mL streptomycine zoals hierboven beschreven. Opmerking: Als de ik-YFP-GJIC-test wordt uitgevoerd met behulp van een andere cellijn, gebruik het juiste kweekmedium. LN215-YFPQLen LN215-ik- cellen kunnen worden verstrekt door de Stichting van de Universiteit en bedrijfsleven, Yonsei Universiteit. Neem contact op met de betreffende auteur.</li>
	<li>Één dag voor signaaltransductie, wassen de cellen tweemaal met 10 mL PBS, behandelen met 2 mL van 0,25% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 3 min. resuspendeer de cellen in 5 mL gestolde voedingsbodem met een serologische pipet 10 mL en aanpassen van de dichtheid tot 50.000 cellen/mL. 20.000 cellen in 400 µL van media toevoegen aan elk putje van de plaat van een 24-well cultuur voor behandeling als geen virus zeggenschap, YFPQLen SLC26A4 cellen.</li>
	<li>Na 24 uur incubatie bij 37 ° C, transduce twee putten door vervanging van het kweekmedium met 400 µL van een 1:1 mengsel van pLVX-EIP-YFPQL of pLenti6P-SLC26A4 lentivirus en verse kweekmedium aangevuld met polybrene op een eindconcentratie van 4 µg/mL. Voor geen besturingselementen virus vervangen door kweekmedium.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 15 h, gecombineerd het medium met lentivirussen toevoegen van verse cultuurmedium en Incubeer de cellen gedurende een extra 72 uur. Let op: Om te voorkomen dat besmetting van lentivirus tussen putten, gebruik nieuwe tips of pipets voor elk putje wanneer u gecombineerd kweekmedium dat lentivirus of afzien van verse groeimedium.</li>
	<li>Wash die de cellen in elk goed tweemaal met 0,5 mL PBS, met 300 µL trypsine-EDTA behandelen voor 3 min. resuspendeer de cellen in 2 mL gestolde voedingsbodem en plaat in zes-well cultuur platen met 2 µg/mL puromycin.</li>
	<li>Cultuur van de cellen in medium met 2 µg/mL puromycin totdat alle cellen in het besturingselement ook dood zijn (rond-gevormde of drijvende wanneer waargenomen in Microscoop), die duurt meestal een week. Het vernieuwen van de voedingsbodems met puromycin om de andere dag in de periode van de selectie. Als LN215-YFPQL of LN215-ik- culturen worden heuvels voordat selectie heeft voltooid, transfer de cellen tot 100 mm plaat en selectie zoals in stap 2.5 blijven.</li>
</ol>3. bereiding van de oplossingen die nodig zijn voor de bepaling
<ol><li>500 mL C-oplossing (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, glucose van 10 mM, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2en 1 mM CaCl2) en 500 mL van oplossing (10 mM HEPES, 140 mM INR, 10 mM glucose, 5 mM KCl, en 1 mM CaCl2) voor te bereiden.</li>
	<li>Breng de pH van beide oplossingen aan 7.4 met 1 N NaOH, steriliseren van de oplossingen in filteringen op 0.4 µm voor opslag. Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 1 maand. Controleer de pH alvorens te gebruiken.</li>
</ol>4. plating de LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen
<ol><li>LN215-YFPQL en LN215 cultuur-ik− cellen in 100 mm platen afzonderlijk in een kweekvloeistof te bereiken de bevolking vereist voor assay. LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen in 40% en 80% confluentie in 100 mm platen, respectievelijk, zijn voldoende voor een 96-wells-plaat assay.</li>
	<li>Één dag vóór het uitvoeren van de bepaling YFP GJIC, wassen elke 100 mm cultuur plaat met 10 mL PBS. Behandelen van elke plaat met 2 mL trypsine-EDTA-oplossing van 0,25% en Incubeer bij 37 ° C voor 5 min. resuspendeer de cellen in elk bord in 4 mL gestolde voedingsbodem en transfer naar 15 mL conische buizen.</li>
	<li>Pellet de cellen door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 3 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet van elke cel met 5 mL gestolde voedingsbodem. De bosjes van elke cel in afzonderlijke cellen breken door pipetteren omhoog en omlaag ongeveer 20 keer met een serologische pipet 10 mL.</li>
	<li>De cellen in een hemocytometer tellen, en verdunnen van de cellen in het kweekmedium te maken cel schorsingen van LN215-YFPQL bij 80.000 cellen/mL en LN215-ik− bij 160.000 cellen/mL.</li>
	<li>Meng 7 mL LN215-YFPQL en 7 mL LN215-ik− cel schorsingen in een reservoir. Voeg 100 µL van het mengsel toe aan elk putje van een 96-Wells cel cultuur plaat met behulp van een meerkanaalspipet. Opmerking: Om toe te voegen 100 µL van het mengsel in elk putje van 96-Wells cel plaat, ongeveer 10 mL celsuspensie gemengde nodig is. Het is aanbevolen om meer celsuspensie dan nodig.</li>
	<li>Incubeer de cellen in bevochtigde 5% CO2/95% lucht bij 37 ° C gedurende 24 uur. De LN215-YFPQL en LN215-ik−celkweek moet 100% heuvels als de bepaling wordt verricht.</li>
</ol>5. het uitvoeren van de bepaling van de GJIC -YFP
Opmerking: Gebruik een fluorescentie Microscoop met 20 x vergroting, en een GFP-filter om te controleren de 96-wells-platen om er zeker van te zijn dat er geen klontjes van LN215-YFPQL of LN215-SLC26A4 cellen zijn en dat de celculturen volledig confluente en goed verdeelde vóór het uitvoeren van de test.
<ol><li>Ten minste 30 minuten voordat u de test, een microplate inschakelen en instellen tot 37 ° C.</li>
	<li>Was de buis van een geautomatiseerde injector met 3 mL 70% ethanol, 3 mL gedestilleerd water, en vervolgens 3 mL oplossing met een debiet van 300 µL/s.</li>
	<li>Warm de C - en ik-oplossingen tot 37 ° C in het waterbad. Opmerking: Als 100 µL van elke oplossing nodig is voor elk putje van de 96-wells-plaat, is ongeveer 10 mL van elke oplossing nodig voor elke assay. Een extra 10 mL van de ik-oplossing is nodig voor priming elke plaat (totaal van 20 mL) en een extra 25 mL van de C-oplossing nodig is voor het wassen van elke plaat (in totaal 35 mL).</li>
	<li>Het groeimedium gecombineerd of omkeren van de plaat om het leeg te maken; Tik uit residuele medium. Opmerking: Residuele foetale runderserum in de groei-media achtergrond fluorescentie en een daling in assay kwaliteit veroorzaakt.</li>
	<li>Voeg 200 µL van C-oplossing aan elk putje uit een reservoir met een meerkanaalspipet. De C-oplossing gecombineerd of omkeren van de plaat toe op lege en tik uit residuele oplossing.</li>
	<li>Voeg 50 µL µL C-oplossing, 1 µL van 2.5 mM chemische materieel (Zie tabel 1) of dimethylsulfoxide (DMSO) als een voertuig, en vervolgens 50 µL µL C-oplossing aan elk putje met een meerkanaalspipet. Opmerking: De meeste reagentia in een chemische bibliotheek worden opgelost in DMSO en tot 1% (v/v) is toegestaan in de meeste cel-gebaseerde testen24. Zoals DMSO een hogere dichtheid dan water heeft, de reagentia opgelost in DMSO neiging naar beneden naar de onderkant wanneer toegevoegd aan de putjes van de plaat cultuur die de concentraties van de assay-oplossingen verstoort. Dit kan worden omzeild door het toevoegen van 50 µL van C-oplossing, reagentia in DMSO en 50 µL C - oplossing in volgorde. De laatste 50 µL van C-oplossing is voor het mengen.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C in de lucht, niet in de 5% CO2. De incubatietijd kan worden gewijzigd, maar 10 min is meestal voldoende voor ionkanaal modulatoren om op te treden.</li>
	<li>Tijdens de incubatie, stel het programma reader microplate te injecteren 100 µL van ik-oplossing aan elk putje op 1 s en voor het meten van de fluorescentie voor 10 s 0,4 s tussenpozen. Stel de lezer om te lezen van de fluorescentie van de bodem. De aanbevolen injectie snelheid is 135 µL/s. Set de excitatie golflengte 485 nm en lees de emissie bij de 520 nm. Opmerking: Gedetailleerde instellingen voor de microplate lezer's zijn als volgt.<ol>
<li>Klik op de knop beheren protocollen .</li>
		<li>Klik op de knop Nieuw . Selecteer de Intensiteit van de fluorescentie in het gedeelte ' methodiek ' meting, en Goed modus in de lezing sectie modus. Klik vervolgens op de knop OK . Nieuw tabblad verschijnt.</li>
		<li>In de Fundamentele Parameters (menu), stelt u de excitatie golflengte op 485 nm en de emissie bij de 520 nm. Selecteer de Onderste Optic te lezen van de fluorescentie van de bodem. Set meting begintijd worden "0 s", aantal intervallen als "25", aantal flitsen per putje, en interval als "20" en intervaltijd als "0,4 s".</li>
		<li>Tekenen in het menu lay-out regio van de plaat te lezen.</li>
		<li>Stel de microplate-lezer te injecteren 100 µL van ik-oplossing aan elk putje met 135 µL/s injectie snelheid in het menu van de Concentraties/Volumes/Shacking . Opmerking: Vermijd sneller injectie snelheden omdat ze detachement van cellen kunnen opleveren.</li>
		<li>In het menu van de injectie tijd , stel de begintijd van de injectie 1 s. Klik vervolgens op de knop Start meting .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na incubatie, plaatst u de 96-wells-platen in de microplate-lezer en start de meting door te klikken Start meting weer.</li>
</ol>6. berekening van de GJIC activiteit
<ol><li>De percentages van YFPQL blussen en GJIC activiteit als23 berekenen YFPQL blussen (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq1.jpg"> GJIC activiteiten (%) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58966/58966eq2.jpg"> Opmerking: In principe GJIC activiteit moet worden berekend door het verschil tussen de percentages van YFP fluorescentie in putjes met acceptor cellen en cellen van donor en de bijbehorende acceptor-cel alleen wells. Als LN215-YFPQL cellen blijkt echter te verwaarlozen YFP blussen door jodide na 10 s, wij nemen niet de achtergrond YFP blussen rekening bij het uitvoeren van HTS met behulp van LN215-YFPQL en LN215-ik- cellen.</li>
</ol>

<ol><li>Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins%2C+connexons%2C+and+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity%3A+Structure-Function+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).</li>
<li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li>
<li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li>
<li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).</li>
<li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li>
<li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li>
<li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li>
<li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia%2Freperfusion+injury%2C+cardioprotection+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li>
<li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li>
<li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li>
<li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging%3A+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+2+%2C+6+%2C+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li>
<li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li>
<li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-Loading+and+Dye+Transfer%3A+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li>
<li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advancement+of+Science%22%5BJournal%5D)">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li>
<li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909(2005).</li>
<li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li>
<li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li>
<li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li>
<li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li>
<li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li>
<li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li>
<li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+%2F+c+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li>
<li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+Connexin+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Connexins%22%5BJournal%5D)">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li>
<li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap%5BTitle%5D)+AND+%22Junctional+Intercellular+Communication%22%5BJournal%5D)">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

De ik-YFP-GJIC-bepaling kan worden gebruikt voor HTS omdat het robuuste, snelle en goedkope. Een HTS-assay robuuste wordt beschouwd als de Z'-factor 0,525bedraagt. Zie Zhang et al. erkend voor een beschrijving van de statistische analyse gebruikt voor de beoordeling van de geschiktheid van HTS assays25. Toen LN215 cellen werden gebruikt, de Z'-factor was > 0,5 zonder enige assay-optimalisatie. Als andere celtypes worden gebruikt in de bepaling en de Z'-factor is < 0,5, de r...

Kloof kruispunten (GJs) fungeren als intercellulaire kanalen om de verspreiding van kleine moleculen van < 1 kDa zoals voedingsstoffen en metabolieten signalering moleculen tussen aangrenzende cellen. De regulates elementen bevatten een hemichannel of connexon in elke cel en elke connexon vormt zes connexins (Cxs)1. GJs en Cxs zijn gebruikt in de toxicologie testen van kankerverwekkende stoffen zoals polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), die GJ remmers,2,,3,4 zijn. Verstoorde GJIC is geassocieerd met nongenotoxic carcinogenese5,6. Als een potentiële therapeutisch doel, heeft in bijzonder subtypen van vangsten7,8, bescherming tegen hart- en hersenen ischemie/reperfusie letsel9, migraine met aura10GJ betrokkenheid gemeld drug-geïnduceerde lever schade6,11, en wond genezing van12. High-throughput screening (HTS) testen zijn vereist om GJ-modulerende chemicaliën of antilichamen voor drugontdekking, voor Toxicologie testen, te identificeren en te identificeren roman cellulaire regulatoren van GJ activiteit. HTS testen kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van structuur-activiteit verhoudingen van GJ modulatoren2,13,14,15.
Sommige GJIC tests omvatten dye overdracht of dual patch-clamp technieken. Lucifer gele CH (LY) en calceïne acetoxymethyl ester (calceïne-AM) zijn gebruikt in dye-overdracht testen. Cellen zijn niet luchtdoorlatend LY, die is ingevoerd door microinjection, schraap laden of electroporation. Eenmaal in de cel, LY verspreidt in naburige cellen via GJs en GJ activiteit wordt bepaald door de omvang van de LY migratie16. Calceïne-AM testen is meestal sprake van herstel van de kloof-fluorescentie na photobleaching17,18. Calceïne-AM is een cel-permeant kleurstof die door een intrinsieke nte esterase intracellulair wordt omgezet in ondoordringbare calceïne. De bepaling vereist een confocal microscoop te observeren van de overdracht van calceïne-AM in een cel van die eromheen na laser photobleaching. Als functionele GJs aanwezig zijn, calceïne-AM in aangrenzende cellen binnenkomt de photobleached cellen en de fluorescentie wordt teruggewonnen. GJ activiteit wordt bepaald door de mate van herstel van de fluorescentie van de photobleached cellen. Dye-overdracht testen zijn moeizaam en tijdrovend of lage gevoeligheden. Dual patch klemmen is een elektrofysiologische methode die regulates geleidbaarheid maatregelen. Het is relatief gevoelig, met een directe afhankelijkheid van geleidbaarheid van het aantal open GJs19; echter, het is technisch veeleisende, tijdrovend en duur20. De ik-YFP-GJIC-assay werd ontwikkeld voor gebruik in de HTS.
Figuur 1 illustreert de onderdelen en de stappen van de ik-YFP-GJIC-test, die gebruik maakt van de acceptor cellen uiten een jodide-gevoelige YFP variant, rekening houdend met H148Q en I152L (YFPQL) en donor cellen uiten van een transporter jodide (SLC26A4)21 . De twee mutaties gedragen door YFPQL toestaan blussen van fluorescentie jodide22. Jodiden worden toegevoegd aan mede gekweekte acceptor en donor cellen; ze doen niet de acceptor cellen invoeren, maar worden overgenomen door de SLC26A4 vervoerders aanwezig op de donor cellen. Jodiden in de donor cellen verspreiden via functionerende GJs in aangrenzende acceptor cellen waar ze de YFPQL -fluorescentie quench. Als GJs gesloten of geblokkeerd door remmers, kunt geen jodide de acceptor cellen doven de fluorescentie invoeren. De YFPQL blussen tarief weerspiegelt GJ activiteit. De ik-YFP-procedure voor de bepaling van de GJIC is niet ingewikkeld of tijdrovend. Het is compatibel met HTS en kan worden gebruikt voor het testen van de effecten van een groot aantal verbindingen op GJ activiteit in een relatief korte periode. Het vereist alleen acceptor en donor cellen, en de twee evenwichtige zoutoplossingen. Het hieronder beschreven protocol is gebaseerd op de LN215 cellen waarvan grote Cx Cx4321 is. De LN215-YFPQL -receptor en de LN215-ik− donor cellen werden gegenereerd door transductie met lentivirussen YFPQL of SLC26A421,23te uiten.

<table><tbody><tr><td>96-well plate</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>I-solution</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C-solution, I-solution</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>RES6003H-B7</td><td>C-solution, I-solution</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>C-solution</td></tr><tr><td>Microplate reader&nbsp;</td><td>BMG LabTech&nbsp;</td><td>POLARstar Omega 415-1618</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution</td><td>sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>C-solution, I-solution</td></tr><tr><td>psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>C-solution, I-solution</td></tr><tr><td>Sodium hyroxide (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Iodide (NaI)</td><td>Sigma</td><td>383112</td><td>I-solution</td></tr></tbody></table>

een jodide-geel fluorescerende eiwit-gap junction-intercellulaire communicatie assay

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Kloof kruispunten (GJs) zijn celmembraan kanalen waarmee verspreiding van moleculen kleiner dan 1 kDa tussen aangrenzende cellen. Als er fysiologische en pathologische rollen, moet er van high-throughput screening (HTS) tests om te identificeren GJ modulatoren in drug discovery en toxicologie testen. Een roman jodide-geel fluorescerende eiwit-gap junction-intercellulaire communicatie (I-YFP-GJIC) assay vervult deze behoefte. Het is een cel-gebaseerde test met inbegrip van de donor en acceptor cellen die zijn ontworpen om te stabiel express een gele fluorescerende eiwit (YFP)-variant, waarvan fluorescentie gevoelig door jodide, of SLC26A4, een transporter jodide, respectievelijk uitgeblust is. Wanneer jodide wordt toegevoegd aan een gemengde cultuur van de twee celtypes, zij voert de donor cellen via de SLC26A4 transporter en diffuus aan de cellen van de aangrenzende acceptor via GJs waar ze de YFP fluorescentie doven. YFP fluorescentie is goed door goed gemeten in een kinetische modus. De YFP blussen tarief weerspiegelt GJ activiteit. De test is betrouwbaar en snel genoeg om te worden gebruikt voor de HTS. Het protocol voor de ik-YFP-GJIC-assay met behulp van de LN215 cellen, menselijke glioma cellen, wordt beschreven.

Negenentwintig cultuur van de 96-wells-platen werden gebruikt om het scherm 2.320 chemische stoffen ter identificatie van roman GJIC modulatoren door ik-YFP-GJIC bepaling met behulp van de LN215-YFPQL en LN215-ik− cellen. De resultaten van een representatieve plaat zijn afgebeeld in Figuur 2. Het percentage YFP fluorescentie in elk putje wordt weergegeven als een lijndiagram in afbeelding 2 ...

Hier presenteren we een protocol voor een roman gap junction intercellulaire communicatie assay ontworpen voor de high-throughput screening van gap junction-modulerende chemicaliën voor drugontdekking en toxicologische beoordeling.

Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Gap knooppunten zijn voorgesteld als drugs doelwitten. Iodide-YFP-GJIC-test is compatibel met high-throughput screening om gap junction modulators te ontdekken. Het is gebruikt om de effecten van een groot aantal verbindingen op gap junction activiteiten te testen in een relatief korte periode.Iodide-YFP-GJIC test is eenvoudig, robuust, herhaalbaar en goedkoop. Deze test vereist alleen acceptor- en donorcellen en twee evenwichtige zoutoplossingen. Er zijn geen extra reagentia nodig, zoals Lucifer geel en Calcein AM.Ook meet het totale gap junction activiteiten van de cellen in een enkele put die resulteert in een lage tussen-goed variabiliteit. Om te beginnen met deze procedure groeien LN215 cellen tot 80%samenvloeiing in de aangevulde DMEM zoals beschreven in het tekstprotocol. Een dag voor transductie was de cellen twee keer met 10 milliliter PBS.Voeg twee milliliter van 0,25% trypsine EDTA toe aan de cellen en broed gedurende drie minuten uit bij 37 graden Celsius. Met behulp van een 10-milliliter serologische pipet resuspend de cellen in vijf milliliter van cultuurmedium en pas de celdichtheid aan 50.000 cellen per milliliter. Voeg 400 microliter media die 20.000 cellen bevat toe aan elke put van een 24-put kweekplaat.Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De volgende dag transduceren twee putten door het vervangen van de cultuur medium met 400 microliter van een een-op-een mengsel van een lentivirus en verse cultuur medium aangevuld met polybrene bij een uiteindelijke concentratie van vier microgram per milliliter. Voor de geen viruscontroles vervang het cultuurmiddel met vers cultuurmiddel dat met polybrene bij een definitieve concentratie van vier microgram per milliliter wordt aangevuld.Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 15 uur. Dan aspirate het medium met lentivirussen, en verse cultuur medium. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius voor een extra 72 uur.Daarna was je de cellen in elke put twee keer met 0,5 milliliter PBS. Voeg 300 microliter van 0,25% trypsine EDTA toe aan de cellen en broed gedurende drie minuten uit bij 37 graden Celsius. Resuspend de cellen in twee milliliter van cultuurmedium, en dan plaat ze in zes-goed cultuur platen met twee microgram per milliliter puromycine.Kweek de cellen tot alle cellen in de controleputten dood zijn, wat meestal ongeveer een week duurt. Ten eerste, afzonderlijk cultuur LN215-YFP en LN215-jodide cellen in 100-millimeter platen in cultuur medium om de populaties die nodig zijn voor de test te bereiken. Een dag voor de test, was elke plaat met 10 milliliter PBS.Behandel elke plaat met twee milliliter van 0,25% trypsine EDTA-oplossing en broed gedurende vijf minuten uit op 37 graden Celsius. Resuspend de cellen in vier milliliter van cultuurmedium en breng ze over naar een 15-milliliter conische buizen. Centrifuge op 1.000 g gedurende drie minuten om de cellen te pelleteren.Gooi de supernatant en resuspend elke cel pellet in vijf milliliter van cultuur medium. Pipette op en neer ongeveer 20 keer te breken een cel klonten. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.En verdun dan de cellen in kweekmedium om celsuspensie te maken bij de dichtheden die hier worden getoond. Meng vervolgens zeven milliliter van elke celsuspensie samen in een reservoir. Gebruik een multichannel pipet om 100 microliters van dit mengsel toe te voegen aan elke put van een 96-well cultuurplaat.Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide gedurende 24 uur. Gebruik eerst een fluorescentiemicroscoop met 20x vergroting en een GFP-filter om de 96-put platen te controleren om er zeker van te zijn dat er geen klonten cellen zijn, en dat de culturen volledig samenvoezig en goed verdeeld zijn. Ten minste 30 minuten voordat de test zet een microplate lezer en zet het op 37 graden Celsius.Was de slang van een geautomatiseerde injector met drie milliliter van 70%ethanol, drie milliliter gedestilleerd water en drie milliliter I-oplossing. Verwarm vervolgens de C- en I-oplossingen tot 37 graden Celsius in een waterbad. Ofwel aspirate het groeimedium of omkeren van de plaat om het te legen.Tik op elk restmedium. Voeg vervolgens de C-oplossing toe aan een reservoir met behulp van een multichannel pipet om 200 microliters C-oplossing toe te voegen aan elke put van de plaat. Ofwel aspirate de oplossing of omkeren van de plaat om te legen, waardoor elke resterende oplossing tappen.Voeg 50 microliter C-oplossing toe aan elke put. Voeg vervolgens een microliter van een 2,5-millimolar chemische voorraad of DMSO als een voertuig, en voeg nog eens 50 microliter van C-oplossing aan elke put. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in de lucht gedurende ongeveer 10 minuten.Begin tijdens de incubatie de parameters in het microplate-lezersprogramma in te stellen door op de knop Protocollen beheren te klikken. Klik op de knop Nieuw. Selecteer de fluorescentieintensiteit in de sectie Metingsmethode en Put-modus in de sectie Leesmodus.Klik vervolgens op de knop OK. Er verschijnt een nieuw tabblad. Stel in het menu Basisparameters de excitatiegolflengte in op 485 nanometer en de emissie op 520 nanometer.Selecteer de onderste optische om fluorescentie van onderen te lezen. Stel vervolgens de begintijd van de meting in op nul seconden, het aantal intervallen op 25, het aantal flitsen per put en interval op 20 en de intervaltijd op 0,4 seconden. Teken in het menu Indeling een gebied van de te lezen plaat.In het menu Concentraties/Volumes/Shacking stelt u de microplatelezer in om 100 microliter I-oplossing te injecteren voor elke put met een injectiesnelheid van 135 microliters per seconde. In het menu Injectietijd stelt u de begintijd van de injectie in op één seconde. Klik vervolgens op de knop Meting starten.Wanneer de incubatie is voltooid, breng je de 96-put platen over naar de microplate-lezer en start de meting door opnieuw op de metingknop Start te klikken. In deze studie wordt de jodiumgel fluorescerende eiwit-gap junction-intercellulaire communicatietest gebruikt met LN215-YFP en LN215-jodiumcellen om 2, 320 chemische stoffen te screenen om nieuwe gap junction intracellulaire communicatiemodulatoren te identificeren. Homosalaat wordt gezien als 50% van gap junction intracellulaire communicatie remmen.Terwijl terbinafine het volledig remt. Dit bevestigt terbinafine als een gap junction remmer. Deze test meet GJIC tussen naburige donor en acceptor cellen, zodat de donor en acceptor cellen volledig moeten worden gescheiden voordat plating.En de samenvloeiing van de gemengde cultuur moet 100% zijn om de vorming van kloofknooppunten tussen cellen te maximaliseren. Tijd cursus gegevens, dosis respons relaties, en de beoordeling van de omkeerbaarheid van gap junction modulators kunnen worden verkregen met Iodide-YFP-GJIC test. Ook Iodide-YFP specifieke connexin GJIC testen kunnen worden vastgesteld door het induceren van de expressie van een connexin van belang in de cellen verstoken van functionele kloof knooppunten.Dit maakt het mogelijk om de IC50-waarde van een chemische stof van een specifiek type connexin te bepalen. Iodide-YFP-GJIC-test kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer, omdat het robuust, herhaalbaar en goedkoop is. Deze tests helpt bij het vinden van gap junction modulerende chemische stoffen voor drugs ontdekking en toxicologische beoordeling.

an-iodide-yellow-fluorescent-protein-gap-junction-intercellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een real-time screening procedure voor het identificeren van geneesmiddelen die een interactie met G-eiwit-gated naar binnen gelijkrichter...

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

We beschrijven hier hoe je een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen, en een aantal nuttige tips. We verwachten dat dit artikel iedereen zal helpen om de mate van cellulaire koppeling te evalueren door functionele gap junctions. Alles hier beschreven kan zijn, in principe, aangepast aan andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder 1000 Dalton.

Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Deze presentatie demonstreert een methode waarbij elektroporatie van adherante, gekweekte cellen wordt gebruikt voor het bestuderen van intercellulaire, junctionele communicatie, terwijl de cellen groeien op een plaatje dat bedekt is met geleidend en transparant indium-tinoxide.

Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide

Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Dit protocol beschrijft een methode voor de studie van elektrogene membraaneiwitten door het meten van veranderingen in membraanpotentiaal. Deze test biedt een platform voor de functionele uitlezing van meerdere ionkanalen endogeen uitgedrukt in epitheelcellijnen.

Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer de Iodide-YFP-GJIC-assay voor high-throughput screening van gap junction-modulatoren met LN215-cellen. Deze methode identificeert verbindingen zoals homosalate voor farmacologisch en toxicologisch onderzoek.

Een jodide-geel fluorescerende eiwit-Gap Junction-intercellulaire communicatie Assay

Meer video's verkennen