Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

Voor neonatale ziekten zoals cardiomyopathie, regeneratieve therapie met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cellen heeft een enorm potentieel. Echter, in vitro versnelde celgroei leidt tot DNA-schade door geaccumuleerde metabolieten zoals reactieve zuurstofsoorten. Het transplanteren van deze DNA-beschadigde cellen zou leiden tot een slechte engraftment en regeneratie van het orgaan.

Vóór transplantatie moet de kwaliteit van de cellen worden beoordeeld. Hier bieden we twee stapsgewijze protocollen om de DNA-schade in stamcellen te beoordelen. Het aantonen van de procedures zal Jessica Miller, een onderzoeker, Nikhil Mardhekar, een onderzoeker, en Vasanthi Rajasekaran, een lab technicus.

Om te beginnen, plaats 500 milligram laag smeltende agarose in 100 milliliter DNA-RNA vrij water. Verwarm de fles in een magnetron tot de agarose oplost. Plaats de fles vervolgens in een waterbad van 37 graden Celsius totdat dat nodig is.

Om voorgecoate komeetglijbanen voor te bereiden, plaatst u een paar druppels van 0,5% op een glazen glijbaan. Spreid onmiddellijk de agarose om een dunne laag van agarose coating te vormen met behulp van een coverslip. Werken onder omstandigheden met weinig licht om ultraviolet licht-geïnduceerde celschade te voorkomen, meng 10 microliters van celsuspensie en 90 microliter van agarose oplossing in een buis.

Plaats de buis in een waterbad van 37 graden Celsius om te voorkomen dat de agarose stolt. Meng de oplossing zonder de invoering van luchtbellen, en pipet 70 microliters per plek op de voorgecoate komeet glijbaan. Met behulp van een pipet tip, verspreid de cel agarose mengsel om een dunne laag te vormen.

Plaats de glijbaan op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. In een container, volledig onderdompelen de dia in koude lysis buffer. Plaats de container in het donker op vier graden Celsius gedurende een uur.

Vervang de lysisbuffer door koude alkalische oplossing. Zorg ervoor dat de dia's volledig onder water staan. Na het verlaten van de container in het donker op vier graden Celsius voor nog eens 30 minuten, plaats de dia in een horizontale elektroforese tank.

Vul de tank met koude alkalische elektroforese buffer totdat de glijbanen volledig onder water staan. Breng spanning aan bij één volt per centimeter gedurende 15 tot 30 minuten. In een container, volledig onderdompelen de glijbaan in koud gedeïmiseerd water.

Na twee minuten, verwijder het gedeïeïniseerde water en voeg vers gedeïniseerd water, en herhaal deze stap een tweede keer. Vervang vervolgens het gedeïeïniseerde water door koude 70%-ethanol. Verwijder de glijbaan na vijf minuten voorzichtig zonder deze te kantelen en laat deze drogen.

Eenmaal gedroogd, voeg 100 microliters van verdunde DNA-kleurstof aan elke plek, en wacht 15 minuten op kamertemperatuur. Maak met behulp van een FITC-filter in een epifluorescentiemicroscoop beelden van in totaal 50 tot 100 kometen per monster. Cultuur iPS-afgeleide cardiomyocyten zoals beschreven in het tekstprotocol.

Om de iPS-afgeleide cardiomyocyten in kamerdia's te zien, gooi je eerst het kweekmedium uit de putten weg en was je de cellen drie keer met PBS. Voeg een milliliter van 0,25% Trypsin per put, en incubeer op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Controleer de plaat onder een microscoop op celloslating.

Voeg vervolgens een milliliter CMM toe om de Trypsin te stoppen. Plaats de celsuspensie in een buis van 15 milliliter en centrifuge gedurende vijf minuten op vier graden Celsius en 200 keer g. Gooi het medium weg, voeg een milliliter CMM toe en verhoog de cellen opnieuw.

Tel de cellen en pas de celtellingen aan om twee miljoen cellen in 1,6 milliliter CMM te verkrijgen. Nu zaad 200 microliters van cel suspensie per put van de acht-goed kamer dia. Tik voorzichtig op de glijbaan om de cellen over de put te verspreiden.

Broed de cellen uit op 37 graden Celsius. Voor de iPS-afgeleide cardiomyocyte doxorubicine behandeling, gooi het cultuurmedium uit de iPS-afgeleide cardiomyocyte putten, en was de cellen met PBS. Behandel de cellen met een-micromolar doxorubicine gedurende vier uur op 37 graden Celsius.

Aspirate het medium, en was de cellen met PBS. Om immunolabeling uit te voeren, was de cellen drie keer met PBS en voeg 200 microliters vers bereide 4%paraformaldehyde toe aan elke put. Bevestig de cellen gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Na het wassen van de cellen met PBS, voeg 200 microliter van het blokkeren buffer per put, en blok gedurende 30 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg 200 microliter primaire antilichaamoplossing toe. Na 45 minuten in een donkere bevochtigde kamer op kamertemperatuur te hebben uitgebroed, was je de putten drie keer met PBS.

Verwijder de PBS en voeg 200 microliter secundaire antilichaammix toe. 45 minuten incubeer maken in een donkere bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was vervolgens de putten drie keer met PBS.

Was met gedeïioniseerd water voordat u de glijbanen met antifade monteert. Plaats een afdekglas, en bewaar de dia's in het donker op vier graden Celsius. Neem met behulp van een confocale microscoop drie tot vijf beelden van willekeurige velden per monster en ga verder met beeldanalyse.

Om de DNA schade respons foci te tellen, downloaden en installeren CellProfiler. Selecteer bestand, importeren, pijplijn uit het bestand en kies het pijplijnbestand met de naam puncti gamma-H2AX. Sleep en drop de map met de verkregen afbeeldingen van gamma-H2AX foci naar het venster van de bestandslijst in de sectie afbeeldingen van invoermodules voor analyse.

Volg vervolgens de instructies zoals weergegeven in het tekstprotocol. Als u de parameters voor de afbeeldingen wilt instellen, sleept u de gewenste afbeelding voor analyse naar de bestandslijst. Selecteer onder invoermodules afbeeldingen.

Selecteer ook in invoermodules metagegevens en selecteer vervolgens namen en typen. Selecteer voor groepen nee. Als u werkt in analysemodules, selecteert u kleur tot grijs.

Selecteer vervolgens vloeiend, selecteer primaire objecten identificeren en selecteer opnieuw vloeiend. Selecteer vervolgens functies verbeteren of onderdrukken en selecteer vervolgens primaire objecten identificeren. Nog steeds werken in analysemodules, selecteer betrekking op objecten, classificeren objecten, en ten slotte selecteren exporteren naar spreadsheet.

Klik op afbeeldingen in het linkerbenedenpaneel onderin analyseren om beeldanalyse uit te voeren. Bij de succesvolle afronding van de analyse worden verschillende beelden gegenereerd. Let op het CSV-bestand dat wordt gegenereerd en opgeslagen op de juiste locatie op de computer.

Dit dossier bevat de kwantitatieve gegevens voor verdere analyse. In de spreadsheet met de naam mijn experimentafbeelding heeft kolom B het aantal kernen met maximaal vijf puncti en kolom D het aantal kernen met meer dan vijf puncti's. Voeg kolommen B en D toe om het totale aantal kernen te krijgen.

Herhaal deze stappen voor alle afbeeldingen en wijzig de bestandsnaam van mijn experiment voor elke analyse. Representatieve micrografen van kometen uit met doxo behandelde en niet-behandelde iPS-cellen worden hier weergegeven. Een basale hoeveelheid DNA-schade werd gevonden in iPS-cellen, uitgedrukt als een fractie van DNA-schade en staart moment.

Echter, de doxo behandeling verhoogde de DNA-schade in iPS-cellen zoals verwacht, wat aangeeft dat de komeettest kan worden gebruikt om de DNA-integriteit in pluripotente stamcellen te beoordelen. Representatieve micrografen van gamma-H2AX immunolabeling worden hier getoond, bij lagere vergroting en bij een hogere vergroting. In de controle iPS-afgeleide cardiomyocyten, meer dan 90% van de cellen had minder dan vijf DDR foci per kernen.

En een totaal van minder dan 10% van de cellen had meer dan zes DDR foci per kernen. Voor iPS-afgeleide cardiomyocyten gekweekt gedurende zes maanden, minder dan 90% van de cellen had tot vijf DDR foci per kernen, en een totaal van meer dan 13% van de cellen had meer dan zes DDR foci per kernen. Terwijl in de met doxo behandelde iPS-afgeleide cardiomyocyten minder dan 80% van de cellen maximaal vijf DDR foci per kern had.

En in totaal had ongeveer 24% van de cellen meer dan zes DDR foci per kern. Deze gegevens geven aan dat langdurige iPS-afgeleide cardiomyocyte celcultuur en doxo-behandeling aanzienlijke DNA-schade veroorzaakten, waardoor ze ongeschikt waren voor celtransplantatie. Het is erg belangrijk om variabelen te vermijden tijdens het mengen van de celsuspensie, omdat dit de elektroforese kan beïnvloeden.

Na deze procedure u de komeettesten en de immunolabelingprocedures uitvoeren met cellen van verschillende soorten. Deze technieken zullen het mogelijk maken voor cellen van verschillende soorten te worden beoordeeld op DNA-schade alvorens te worden gebruikt in celtransplantatie studies.