Name: Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer stapsgewijze protocollen om DNA-integriteit in stamcellen te beoordelen voor cardiale celtherapie. Deze methode waarborgt celkwaliteit en verbetert de uitkomst van regeneratieve behandelingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Heart, Lung en bloed Instituut subsidies RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 en UO1-HL-134764 (met J. Zhang) en door de American Heart Association wetenschappelijke ontwikkeling Grant 17SDG33670677 (met R. Kannappan).

1. de komeet Assay
<ol><li>
Bereiding van het reagens
	<ol>
<li>Voor lage-smeltpunt agarose, plaats van 500 mg van lage-smelten agarose in 100 mL DNA- / RNA-gratis water. Verwarm de fles in de magnetron totdat het agarose oplost. Plaats de fles in een waterbad 37 ° C totdat het nodig is. Opmerking: Zie voor verder lezen, Azqueta et al., die de effecten van agarose concentratie op de DNA-ontspannen tijd en verschillende elektroforese factoren23 bestudeerde.</li>
		<li>Verdun DNA SYBR groene kleurstof in Tris-EDTA (TE) Buffer bij een verhouding van 1:10,000 een 1 x voorraad kleurstof werkoplossing te verkrijgen. Deze kleurstof lichtgevoelig is, dus sla deze op een donkere plaats.</li>
		<li>Voor de cellysis-buffermengsel, ontbinden 100 mL lysisbuffermengsel (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) in gedeïoniseerd water (DI H2O). Voeg vervolgens 10 M NaOH om Breng de pH op 10.0. Koel de buffer tot 4 ° C.</li>
		<li>Voor de alkalische DNA-afwikkelen/elektroforese lopende buffer, los 1 L van alkalische oplossing (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) in DI H2O. Cool de buffer tot 4 ° C. Ervoor te zorgen dat de pH > 13.</li>
		<li>Voor voorgelakt komeet dia's, plaats een paar druppels van 0,5% agarose op een glasplaatje. Onmiddellijk, met behulp van het platte oppervlak van een andere dia, verspreid de agarose vormen een dunne laag van agarose coating. Opmerking: De dia's droog alvorens te gebruiken.</li>
		<li>Voor de cultuur van de cel van de iPS, kort cultuur cultuur iPS cellen in kelder-membraan-matrix-coated (Zie Tabel van materialen) platen in mTESR1 kweekmedium totdat confluentie is bereikt. Opmerking: IPS mens-cardiale-fibroblast-afgeleide cellen werden gebruikt in dit protocol. De herprogrammering van de iPS-cel afleiding en kweekomstandigheden wordt beschreven in de recente artikelen van ons onderzoek groep12,13,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de monsters
	<ol>
<li>Negeren van het kweekmedium en wassen van de cellen. Distantiëren van de cellen met behulp van de oplossing van het detachement (Zie Tabel van materialen). Wassen van de cel pellet met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeer de cellen in PBS op 1 x 105 cellen/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monster prepareren van objectglaasjes Opmerking: Voer de volgende stappen uit onder low-light voorwaarden om te voorkomen dat UV-licht-geïnduceerde celbeschadiging.<ol>
<li>Mix 10 μl celsuspensie en 90 μL van agarose oplossing (1:10 verhouding) in een buis. Plaats de buis in een waterbad 37 ° C om te voorkomen dat de agarose stollen.</li>
		<li>Meng de oplossingen zonder luchtbellen en Pipetteer 70 μL/plek op de dia die voorgelakt komeet. Met behulp van een pipet tip, verspreid de cel agarose mengsel aan het vormen van een dunne laag. Plaats de dia in 4 ° C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>In een container, volledig dompelen de dia in koude lysis-buffermengsel. Plaats de container in het donker bij 4 ° C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Vervang de lysis-buffermengsel met koude alkalische. Zorg ervoor dat de dia's zijn volledig ondergedompeld. Plaats de container in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elektroforese
	<ol>
<li>Plaats de dia in de tank van een horizontale elektroforese. Vul de tank met koude Elektroforese van alkalische buffer totdat de dia's zijn volledig ondergedompeld. Het toepassen van spanning aan 1 V/cm voor 15 tot 30 min. Opmerking: Total spanning = afstand tussen de elektroden x 1 V</li>
		<li>In een container, volledig dompelen de dia in koude DI H2O. Na 2 min, verwijder de DI H2O en voeg verse DI H2O. Herhaal deze stap toe.</li>
		<li>De DI H2O vervangen door koude 70% ethanol. Wacht 5 min. zachtjes verwijderen van de dia, niet kantelen, en laat het drogen.</li>
		<li>Eenmaal gedroogd, voeg 100 μl van verdunde DNA kleurstof naar elke plek. Wacht 15 minuten bij kamertemperatuur. Het gebruiken van een FITC-filter in een epifluorescence Microscoop, neem beelden van 50 tot 100 kometen in totaal per monster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beeldanalyse en berekening van de resultaten
	<ol>
<li>Voor het scoren van de kometen, gebruiken de National Institutes of Health van (NIH) ImageJ met komeet assay plugin (ImageJ hier downloaden: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; download de plugin hier: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). Opmerking: De plug wordt geleverd met een PDF-instructie waarin alle details voor het uitvoeren van de analyse. Screenshots van de komeet analyse worden bovendien getoond in Figuur 2A-C. Representatieve komeet beelden van controle en Doxorubicine (Doxo)-behandelde iPS cellen en de kwantificering van de kometen zijn weergegeven in Figuur 3A-C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA schade reactie
<ol><li>Voorbereiding van het monster en reagens
	<ol>
<li>Voor een cultuur van de cel van de iPS-CM, cultuur iPS-CM cellen in kelder-membraan-matrix-coated (Zie Tabel van materialen) cultuur platen in RPMI medium aangevuld met B-27 (CMM) totdat confluentie is bereikt. Opmerking: Mens-iPS-cell-derived cardiomyocytes werden gebruikt in dit protocol. Het protocol voor iPS celdifferentiatie in cardiomyocytes kan worden gevonden in de recente artikelen van ons onderzoek groep12,13,21.</li>
		<li>Zaad iPS-CMs in kamer dia's.<ol>
<li>Gooi het kweekmedium de iPS-CM-putjes. Wassen van de cellen drie keer met PBS.</li>
			<li>Voeg 1 mL trypsine van 0,25% per putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten Check de plaat onder een Microscoop voor mobiele-detachement. Voeg 1 mL CMM om te stoppen met de trypsine.</li>
			<li>Breng celsuspensie in een tube van 15 mL en Centrifugeer gedurende 5 min bij 4 ° C en 200 x g. Negeren van het medium, voeg 1 mL CMM en resuspendeer de cellen. Cellen tellen en de telling van de cel om te verkrijgen van 20 x 105 cellen in 1.6 mL CMM aan te passen.</li>
			<li>Zaad 200 µL celsuspensie per putje van de kamer 8-well schuif (Zie Tabel van materialen). Tik op de dia voorzichtig om te verspreiden van de cellen naast de waterput en Incubeer bij 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor de behandeling van de iPS-CM Doxorubicine, gooi het kweekmedium de iPS-CM-putjes. Wassen van de cellen met PBS. De cellen met 1 μM Doxorubicine behandelen en CMM voor 4 h. gecombineerd van het medium en wassen van de cellen met PBS.</li>
		<li>Voor de buffer met blokkerend, bereiden 10 mL bovien serumalbumine (BSA) oplossing met 3% BSA en 0,05% Triton X-100. Ter voorbereiding van 10 mL blokkeerbuffer, voeg 1 mL normale ezel serum tot 9 mL bereide oplossing van de BSA.</li>
		<li>Voor de oplossing van het primaire antilichaam, toevoegen 1 μL van anti-konijn phospho-Histon H2A. X (Ser139) antilichaam aan 200 μL van de buffer met blokkerend.</li>
		<li>Voor het secundair antilichaam mix, 1 μL van fluorescerende-geconjugeerde anti-konijn secundair antilichaam, DAPI en fluorescerende-geconjugeerde phalloidin aan 200 μL van de buffer met blokkerend te toevoegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunolabeling
	<ol>
<li>Wassen van de cellen driemaal met PBS en 200 μL van vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen aan elk putje. De cellen gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur vast te stellen. Wassen van de cellen met PBS.</li>
		<li>Verwijder de PBS en voeg 200 l blokkeerbuffer per goed en blok gedurende 30 minuten in een bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeerbuffer en voeg 200 l primair antilichaam oplossing. Incubeer gedurende 45 min. in een donkere, bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur. Vervolgens was de putjes drie keer met PBS.</li>
		<li>Verwijder de PBS en 200 μL van secundair antilichaam mix toevoegen. Incubeer gedurende 45 min. in een donkere, bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur. Vervolgens was de putjes drie keer met PBS. Wassen met DI H2O vóór hen met antifade te monteren. Plaats een dekglaasje en de dia's opslaan in het donker bij 4 ° C.</li>
		<li>Met behulp van een Microscoop epifluorescence, nemen drie tot vijf beelden van willekeurige velden per monster, zoals weergegeven in figuur 4A, en overgaan tot beeldanalyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Tellen van de DDR foci
	<ol>
<li>Download en installeer CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
Opmerking: Beeldverwerking in deze studie werd uitgevoerd met behulp van CellProfiler versie 2.1.1. Tutorials voor CellProfiler die werden gebruikt kunnen elders worden gevonden (lijst & https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk = PL7CC87670239B4D10). Als een nieuwere versie van CellProfiler wordt gebruikt, nodig de pijpleiding kleine aanpassingen.</li>
		<li>Download de pijpleiding punctae_gH2AX.cpipe. Selecteer bestand > importeren > pijpleiding uit het bestand en kies punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>Drag-and-drop de map met de verworven beelden van γH2A.X foci naar het venster van de bestandslijst in de sectie van de Input modules/Images voor analyse (figuur 5A). Volg de aanwijzingen zoals aangegeven in Figuur 5A-L.</li>
		<li>Stel de volgende parameters voor de beelden:<ol>
<li>Sleep de gewenste afbeelding voor analyse naar de bestandenlijst. Selecteer onder Input modules, beelden (Zie figuur 5A voor module-instellingen). Selecteer in Input modules, metagegevens (Zie figuur 5B voor module-instellingen). Selecteer in Input modules, NamesAndTypes (Zie figuur 5C voor module-instellingen).</li>
			<li>Voor groepen, selecteert u geen. Selecteer in modules van de analyse, ColorToGray (Zie figuur 5D voor module-instellingen).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selecteer in modules van de analyse, glad (Zie figuur 5E voor module-instellingen). Opmerking: Deze waarde moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de resolutie van de afbeelding.</li>
		<li>Selecteer in modules van de analyse, IdentifyPrimaryObjects (Zie figuur 5F voor module-instellingen). Opmerking: Het optimaliseren van deze waarden om ervoor te zorgen dat de hele kern is geselecteerd. Na deze stap, kan de computer lag.</li>
		<li>Selecteer in modules van de analyse, glad (Zie Figuur 5 g voor module-instellingen). Opmerking: Deze waarde moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de resolutie van de afbeelding.</li>
		<li>Selecteer in modules van de analyse, EnhanceOrSuppressFeatures (Zie Figuur 5 H voor module-instellingen).</li>
		<li>Selecteer in modules van de analyse, IdentifyPrimaryObjects (Zie figuur 5I voor module-instellingen). Opmerking: Het optimaliseren van deze waarden om ervoor te zorgen dat de punctae worden geselecteerd. Na deze stap, kan de computer weer vertraging.<ol>
<li>Selecteer in modules van de analyse, RelateObjects (Zie figuur 5J voor module-instellingen). Selecteer in modules van de analyse, ClassifyObjects (Zie Figuur 5 K voor de module instellingen). Selecteer in modules van de analyse, ExportToSpreadsheet (Zie Figuur 5 L voor module-instellingen).</li>
			<li>Klik op Analyseren beelden op de linker onderkant aan te sluiten beeld analyses uit te voeren. Op de succesvolle voltooiing van de analyse, meerdere afbeeldingen worden gegenereerd (Figuur 6A-F). Opmerking: Gebruikers moeten deze beelden voor toekomstig gebruik opslaan.</li>
			<li>Opmerking het CSV-bestand met de kwantitatieve gegevens voor verdere analyse die is gegenereerd en opgeslagen in de juiste locatie op de computer. In het werkblad genaamd MyExpt_Image, zal de kolommen B en D hebben het aantal kernen die beschikken over maximaal vijf en meer punctae, respectievelijk. Voeg de kolommen B en D te krijgen van het totale aantal kernen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Herhaal stap 2.3.3 - 2.3.8 voor alle afbeeldingen (Wijzig de bestandsnaam van de MyExpt_ vóór elke analyse). Percelen kunnen worden gemaakt voor de beoordeling van de integriteit van het DNA, zoals weergegeven in figuur 4C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
<li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li>
<li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals%2C+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li>
<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li>
<li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li>
<li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li>
<li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+reliable+comet+assay%3A+optimising+agarose+concentration%2C+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

DNA integriteit portretteert cel integriteit. Cellen met beschadigde DNA zijn vaak in spanning en uiteindelijk verliezen hun integriteit. De integriteit van de stam en de stam-cel-afgeleide cellen die worden doorgegeven ten behoeve van de transplantatie is het belangrijkste voor de cellen om hun gewenste functie te vervullen. Verplanten van cellen met beschadigde DNA zou resulteren in een slechte engraftment snelheid en prestaties van de cel8,20. Daarom is onderz...

Experimentele en klinische bewijs toont aan dat cel transplantatie kan matig prestaties linkerventrikel contractiele van falende hart1,2,3,4,5 ,6,,7,,8,9. Recente vooruitgang hebt geopend verder aantrekkelijke mogelijkheden voor cardiovasculaire regeneratie; Deze omvatten de gedwongen uitdrukking van herprogrammering factoren in somatische cellen veroorzaken pluripotent te differentiëren deze geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) in verschillende cardiale lineages, belangrijker cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. het erfelijk materiaal in elke cel, inclusief de kunstmatig geproduceerde iPSCs en de iPSC-afgeleide CM (iPS-CM), is DNA. De genetische instructies worden opgeslagen in DNA dicteert de groei, ontwikkeling en functie van cellen, weefsels, organen en organismen. DNA is niet inert; cel metabolieten, zoals reactieve zuurstof, carbonyl en stikstof soorten, en alkylerende agentia kan oorzaak DNA beschadigen in vitro en in vivo14,15,16,17. Belangrijker, optreedt DNA schade intuïtief in elke cel, met een grote frequentie. Als deze schade worden niet gecorrigeerd, zal dit leiden tot DNA mutatie, cellulaire senescentie, het verlies van DNA en cel integriteit, en eventueel ook ziekten, met inbegrip van levensbedreigende kankers. Behoud van de integriteit van het DNA is daarom essentieel om een willekeurige cel, vooral iPSCs, die heeft een enorm potentieel in de kliniek.
Voor de beoordeling van de hoeveelheid en de integriteit van geïsoleerde genomic DNA, is dure apparatuur beschikbaar op de markt. Er zijn echter geen eenvoudige en kosteneffectieve methoden voor de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen zonder de cellen te isoleren. Gebruiker-geïnduceerde DNA afbraak tijdens DNA-isolatie is bovendien één van de grote nadelen bij het gebruik van deze methoden. De eencellige gel elektroforese (bekend als de komeet assay)18,19 en γH2A.X immunolabeling8 technieken zijn fundamentele benaderingen in onderzoek labs voor de beoordeling van de DNA-beschadiging. Deze twee methoden vereisen geen dure apparatuur of geïsoleerde genomic DNA te analyseren DNA integriteit8,20,21. Aangezien zijn deze technieken uitgevoerd met hele cellen; gebruiker-geïnduceerde DNA/RNA/eiwit-afbraak tijdens de bereiding van de monsters zal niet van invloed op deze protocollen. Hier, om te beoordelen van de schade van DNA en DNA schade reactie in de stam en de stam-cel-afgeleide cellen, bieden wij stapsgewijze protocollen voor het uitvoeren van zowel de komeet-assay en γH2A.X de immunolabeling. Bovendien, het combineren van deze twee benaderingen, stellen wij voor een naïeve beoordeling die kan worden gebruikt voor het evalueren van de cel geschiktheid voor transplantatie.
De komeet assay, of eencellige gel elektroforese, meet de einden van het DNA in cellen. Cellen die zijn ingesloten in lage-smelten agarose zijn lysed naar formulier nucleoids met supercoiled DNA. Bij elektroforese migreren kleine stukjes van gefragmenteerde DNA en gebroken DNA-strengen door de agarose poriën, overwegende dat het intact DNA, vanwege hun enorme omvang en hun vervoeging met de matrix eiwitten, zal een beperkte migratie hebben. Het patroon van gebeitst DNA onder een fluorescentie Microscoop bootst een komeet. Het hoofd van de komeet bevat intact DNA en de staart is samengesteld uit fragmenten en gebroken DNA-strengen. De Fractie van de schade van DNA kan worden gemeten door de intensiteit van de fluorescentie van de beschadigde DNA (de staart van de komeet) ten opzichte van de intact DNA (komeet hoofd) intensiteit. De parameter staart moment kan worden berekend zoals aangegeven in Figuur 1.
DNA-beschadigingen induceert de fosforylatie van Histon H2A. X (γH2A.X) op Ser139 door ATM, ATR en DNA-PK kinases. De fosforylatie en rekrutering van H2A. X op DNA strand einden heet DNA schade reactie (DDR) en gebeurt snel nadat DNA is beschadigd. Na dit proces, celcyclus checkpoint-gemedieerde arrestatie en DNA reparatie processen in gang zijn gezet. Na de succesvolle voltooiing van DNA-herstel, is γH2A.X gedefosforyleerd en geïnactiveerd door fosfatasen genaamd. Verlengd en meerdere DNA strand einden leiden tot de opeenstapeling van γH2A.X foci in DNA. Hiermee wordt aangegeven van de cel onvermogen om te herstellen van de DNA-beschadiging en het verlies van DNA integriteit. Deze γH2A.X foci in DNA kunnen worden geïdentificeerd door en het aantal DDR foci kan worden geteld met behulp van het protocol in sectie 2.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsine</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8-well kamerschuifblok</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>Celafscheidingsoplossing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Ezel Anti-Konijn IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Ezel Anti-Konijn IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel met verminderde groeifactor</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>FylocodineA488</td><td>Life Technology</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-Histone H2A.X (Ser139) Antilichaam</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp;Green I nucleïnezuurgelkleuring</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Laag smeltpunt agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

beoordeling integriteit van de dna van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stam en de stam-cel-afgeleide cellen hebben enorme potentieel als een regeneratieve therapie voor verschillende degeneratieve ziekten. DNA is de opslagplaats van genetische gegevens in alle cellen, met inbegrip van stamcellen, en zijn integriteit is fundamenteel voor het regeneratieve vermogen. Stamcellen ondergaan snelle voortplanting in laboratoria te bereiken van de vereiste aantallen voor transplantatie. Versnelde celgroei leidt tot het verlies van DNA integriteit door geaccumuleerde metabolieten, zoals reactieve zuurstof carbonyl en alkylerende agentia. Verplanten van deze cellen zou resulteren in slecht engraftment en regeneratie van het verslechterende orgaan. Bovendien, overplanten DNA-beschadigde cellen leidt tot instabiliteit van het DNA, mutaties, cellulaire senescentie, en eventueel, levensbedreigende ziekten zoals kanker. Daarom is er dringend behoefte aan een methode voor de controle van de kwaliteit te evalueren van de cel geschiktheid voor transplantatie. Hier, bieden wij stapsgewijze protocollen voor de beoordeling van de betrouwbaarheid van de DNA van stamcellen voorafgaand aan de transplantatie van de cel.

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn gekweekt en de DNA-beschadiging en het moment van de staart, die werden gebruikt als een maatregel van DNA integriteit, werden geanalyseerd door bepaling van de komeet. iPS cellen werden ingesloten in lage-smeltpunt agarose en geplaatst op een glasplaatje. De cellen werden, vervolgens behandeld met lysis-buffermengsel, gevolgd door een alkaline oplossing, te verkrijgen supercoiled DNA. Nucleoids waren electrophoresed en kometen waren ge...

Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een experimentele opstelling voor een analyse van de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen van de stam voorafgaand aan de transplantatie van de cel.

Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Voor neonatale ziekten zoals cardiomyopathie, regeneratieve therapie met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cellen heeft een enorm potentieel. Echter, in vitro versnelde celgroei leidt tot DNA-schade door geaccumuleerde metabolieten zoals reactieve zuurstofsoorten. Het transplanteren van deze DNA-beschadigde cellen zou leiden tot een slechte engraftment en regeneratie van het orgaan.Vóór transplantatie moet de kwaliteit van de cellen worden beoordeeld. Hier bieden we twee stapsgewijze protocollen om de DNA-schade in stamcellen te beoordelen. Het aantonen van de procedures zal Jessica Miller, een onderzoeker, Nikhil Mardhekar, een onderzoeker, en Vasanthi Rajasekaran, een lab technicus.Om te beginnen, plaats 500 milligram laag smeltende agarose in 100 milliliter DNA-RNA vrij water. Verwarm de fles in een magnetron tot de agarose oplost. Plaats de fles vervolgens in een waterbad van 37 graden Celsius totdat dat nodig is.Om voorgecoate komeetglijbanen voor te bereiden, plaatst u een paar druppels van 0,5% op een glazen glijbaan. Spreid onmiddellijk de agarose om een dunne laag van agarose coating te vormen met behulp van een coverslip. Werken onder omstandigheden met weinig licht om ultraviolet licht-geïnduceerde celschade te voorkomen, meng 10 microliters van celsuspensie en 90 microliter van agarose oplossing in een buis.Plaats de buis in een waterbad van 37 graden Celsius om te voorkomen dat de agarose stolt. Meng de oplossing zonder de invoering van luchtbellen, en pipet 70 microliters per plek op de voorgecoate komeet glijbaan. Met behulp van een pipet tip, verspreid de cel agarose mengsel om een dunne laag te vormen.Plaats de glijbaan op vier graden Celsius gedurende 15 minuten. In een container, volledig onderdompelen de dia in koude lysis buffer. Plaats de container in het donker op vier graden Celsius gedurende een uur.Vervang de lysisbuffer door koude alkalische oplossing. Zorg ervoor dat de dia's volledig onder water staan. Na het verlaten van de container in het donker op vier graden Celsius voor nog eens 30 minuten, plaats de dia in een horizontale elektroforese tank.Vul de tank met koude alkalische elektroforese buffer totdat de glijbanen volledig onder water staan. Breng spanning aan bij één volt per centimeter gedurende 15 tot 30 minuten. In een container, volledig onderdompelen de glijbaan in koud gedeïmiseerd water.Na twee minuten, verwijder het gedeïeïniseerde water en voeg vers gedeïniseerd water, en herhaal deze stap een tweede keer. Vervang vervolgens het gedeïeïniseerde water door koude 70%-ethanol. Verwijder de glijbaan na vijf minuten voorzichtig zonder deze te kantelen en laat deze drogen.Eenmaal gedroogd, voeg 100 microliters van verdunde DNA-kleurstof aan elke plek, en wacht 15 minuten op kamertemperatuur. Maak met behulp van een FITC-filter in een epifluorescentiemicroscoop beelden van in totaal 50 tot 100 kometen per monster. Cultuur iPS-afgeleide cardiomyocyten zoals beschreven in het tekstprotocol.Om de iPS-afgeleide cardiomyocyten in kamerdia's te zien, gooi je eerst het kweekmedium uit de putten weg en was je de cellen drie keer met PBS. Voeg een milliliter van 0,25% Trypsin per put, en incubeer op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Controleer de plaat onder een microscoop op celloslating.Voeg vervolgens een milliliter CMM toe om de Trypsin te stoppen. Plaats de celsuspensie in een buis van 15 milliliter en centrifuge gedurende vijf minuten op vier graden Celsius en 200 keer g. Gooi het medium weg, voeg een milliliter CMM toe en verhoog de cellen opnieuw.Tel de cellen en pas de celtellingen aan om twee miljoen cellen in 1,6 milliliter CMM te verkrijgen. Nu zaad 200 microliters van cel suspensie per put van de acht-goed kamer dia. Tik voorzichtig op de glijbaan om de cellen over de put te verspreiden.Broed de cellen uit op 37 graden Celsius. Voor de iPS-afgeleide cardiomyocyte doxorubicine behandeling, gooi het cultuurmedium uit de iPS-afgeleide cardiomyocyte putten, en was de cellen met PBS. Behandel de cellen met een-micromolar doxorubicine gedurende vier uur op 37 graden Celsius.Aspirate het medium, en was de cellen met PBS. Om immunolabeling uit te voeren, was de cellen drie keer met PBS en voeg 200 microliters vers bereide 4%paraformaldehyde toe aan elke put. Bevestig de cellen gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.Na het wassen van de cellen met PBS, voeg 200 microliter van het blokkeren buffer per put, en blok gedurende 30 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg 200 microliter primaire antilichaamoplossing toe. Na 45 minuten in een donkere bevochtigde kamer op kamertemperatuur te hebben uitgebroed, was je de putten drie keer met PBS.Verwijder de PBS en voeg 200 microliter secundaire antilichaammix toe. 45 minuten incubeer maken in een donkere bevochtigde kamer bij kamertemperatuur. Was vervolgens de putten drie keer met PBS.Was met gedeïioniseerd water voordat u de glijbanen met antifade monteert. Plaats een afdekglas, en bewaar de dia's in het donker op vier graden Celsius. Neem met behulp van een confocale microscoop drie tot vijf beelden van willekeurige velden per monster en ga verder met beeldanalyse.Om de DNA schade respons foci te tellen, downloaden en installeren CellProfiler. Selecteer bestand, importeren, pijplijn uit het bestand en kies het pijplijnbestand met de naam puncti gamma-H2AX. Sleep en drop de map met de verkregen afbeeldingen van gamma-H2AX foci naar het venster van de bestandslijst in de sectie afbeeldingen van invoermodules voor analyse.Volg vervolgens de instructies zoals weergegeven in het tekstprotocol. Als u de parameters voor de afbeeldingen wilt instellen, sleept u de gewenste afbeelding voor analyse naar de bestandslijst. Selecteer onder invoermodules afbeeldingen.Selecteer ook in invoermodules metagegevens en selecteer vervolgens namen en typen. Selecteer voor groepen nee. Als u werkt in analysemodules, selecteert u kleur tot grijs.Selecteer vervolgens vloeiend, selecteer primaire objecten identificeren en selecteer opnieuw vloeiend. Selecteer vervolgens functies verbeteren of onderdrukken en selecteer vervolgens primaire objecten identificeren. Nog steeds werken in analysemodules, selecteer betrekking op objecten, classificeren objecten, en ten slotte selecteren exporteren naar spreadsheet.Klik op afbeeldingen in het linkerbenedenpaneel onderin analyseren om beeldanalyse uit te voeren. Bij de succesvolle afronding van de analyse worden verschillende beelden gegenereerd. Let op het CSV-bestand dat wordt gegenereerd en opgeslagen op de juiste locatie op de computer.Dit dossier bevat de kwantitatieve gegevens voor verdere analyse. In de spreadsheet met de naam mijn experimentafbeelding heeft kolom B het aantal kernen met maximaal vijf puncti en kolom D het aantal kernen met meer dan vijf puncti's. Voeg kolommen B en D toe om het totale aantal kernen te krijgen.Herhaal deze stappen voor alle afbeeldingen en wijzig de bestandsnaam van mijn experiment voor elke analyse. Representatieve micrografen van kometen uit met doxo behandelde en niet-behandelde iPS-cellen worden hier weergegeven. Een basale hoeveelheid DNA-schade werd gevonden in iPS-cellen, uitgedrukt als een fractie van DNA-schade en staart moment.Echter, de doxo behandeling verhoogde de DNA-schade in iPS-cellen zoals verwacht, wat aangeeft dat de komeettest kan worden gebruikt om de DNA-integriteit in pluripotente stamcellen te beoordelen. Representatieve micrografen van gamma-H2AX immunolabeling worden hier getoond, bij lagere vergroting en bij een hogere vergroting. In de controle iPS-afgeleide cardiomyocyten, meer dan 90% van de cellen had minder dan vijf DDR foci per kernen.En een totaal van minder dan 10% van de cellen had meer dan zes DDR foci per kernen. Voor iPS-afgeleide cardiomyocyten gekweekt gedurende zes maanden, minder dan 90% van de cellen had tot vijf DDR foci per kernen, en een totaal van meer dan 13% van de cellen had meer dan zes DDR foci per kernen. Terwijl in de met doxo behandelde iPS-afgeleide cardiomyocyten minder dan 80% van de cellen maximaal vijf DDR foci per kern had.En in totaal had ongeveer 24% van de cellen meer dan zes DDR foci per kern. Deze gegevens geven aan dat langdurige iPS-afgeleide cardiomyocyte celcultuur en doxo-behandeling aanzienlijke DNA-schade veroorzaakten, waardoor ze ongeschikt waren voor celtransplantatie. Het is erg belangrijk om variabelen te vermijden tijdens het mengen van de celsuspensie, omdat dit de elektroforese kan beïnvloeden.Na deze procedure u de komeettesten en de immunolabelingprocedures uitvoeren met cellen van verschillende soorten. Deze technieken zullen het mogelijk maken voor cellen van verschillende soorten te worden beoordeeld op DNA-schade alvorens te worden gebruikt in celtransplantatie studies.

assessing-stem-cell-dna-integrity-for-cardiac-cell-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Cardiale kernen worden geïsoleerd via dichtheid sedimentatie en immunolabeled met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) te identificeren en cardiomyocyten kernen sorteren op flowcytometrie.

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Het artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie efficiënt onderscheiden humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten door het selectief moduleren van de Wnt route, gevolgd door flow cytometrie analyse van referentiemarkeringen aan homogeniteit en identiteit van de bevolking beoordelen.

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

Het kwantificeren van cardiomyocytenvernieuwing is een uitdaging. Het hier beschreven protocol levert een belangrijke bijdrage aan deze uitdaging door nauwkeurige en gevoelige kwantificering van neo-cardiomyocytkerngeneratie en kern-ploïdie mogelijk te maken.

Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.

Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs protocol voor het genereren en kwantificeren van diverse geherprogrammeerde hartsubtypen met behulp van een retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Hand2, Mef2c en Tbx5.

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Het algemene doel van dit artikel is op de standaardisering van het protocol voor de isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen (CSCs) vanuit het hart van de volwassen muis. Hier beschrijven we een dichtheid kleurovergang centrifugeren methode om te isoleren lymfkliertest CSCs en uitgewerkte methoden voor CSC cultuur, proliferatie en differentiatie in cardiomyocytes.

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

In dit protocol demonstreren en uitwerken we over het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen voor cardiomyocyt differentiatie en zuivering, en verder, over hoe de transplantatie-efficiëntie te verbeteren met de met Rho geassocieerde proteïnekinaseremmer voor behandeling in een muis myocardinfarct model.

Verbetering van de Engraftment van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten via een voorbijgaande remming van de activiteit van Rho kinase

Hier demonstreren we een niet-invasieve contractiliteitsevaluatiemethode voor cardiale medische hulpmiddelen met behulp van 2D-door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM) monolagen, verguld op een flexibel substraat, gekoppeld aan videogebaseerde microscopie. Deze tool zal nuttig zijn voor de in vitro evaluatie van de contractiele eigenschappen van cardiale elektrofysiologische apparaten.

Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Leer stapsgewijze protocollen om DNA-integriteit in stamcellen te beoordelen voor cardiale celtherapie. Deze methode waarborgt celkwaliteit en verbetert de uitkomst van regeneratieve behandelingen.

Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie

Meer video's verkennen