Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

Deze methode maakt het mogelijk de generatie van grote aantallen menselijke lever bud voorlopers en hepatocyte-achtige cellen met een hoge zuiverheid. Het vermogen om deze levercellen te genereren kan belangrijk zijn voor regeneratieve geneeskunde en andere gebieden. Door het regelen van de ontwikkelingssignaleringstrajecten om leverdifferentiatie te bevorderen en de vorming van ongewenste celtypen te onderdrukken, maakt deze methode het mogelijk om de menselijke leverknopvererlopers en hepatocyte-achtige cellen met respectievelijk zes en 18 dagen differentiatie efficiënt te genereren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge zuiverheid van de menselijke levercellen gegenereerd. Om deze procedure, voeg 50 milliliter IMDM aan een conische kolf met een roerstaaf. Verwarm het medium tot 50 graden Celsius en voeg 0,5 gram PVA toe terwijl je continu roert om een PVA-voorraad voor te bereiden met een concentratie van 10 milligram per milliliter.

Verwijder hierna de PVA-oplossing uit het verwarmingskussen en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra de oplossing is gekoeld, filter het door een steriel, 0,2 micrometer filter. Bereid de CDM2 en CDM3 voor door de gefilterde PVA te combineren met andere reagentia zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol.

Gebruik een steriel filter van 0,2 micrometer om alle media te filteren. Bereid vervolgens de resterende basismedia, CDM4 en CDM5, zoals beschreven in tabel een van het tekstprotocol. Om het differentiatiemedium voor te bereiden, ontdooit u eerst de bevroren kleine moleculen en/of groeifactoren bij kamertemperatuur.

Aliquot uit de vereiste hoeveelheid basismedium en voeg de gespecificeerde kleine moleculen en groeifactoren aan het basismedium bij de aangewezen concentraties toe. De dag voor gebruik ontdooit u de matrix bij vier graden Celsius. De volgende dag, verdun de matrix bij een verhouding van een tot 100 door het toevoegen van 500 microliter matrix in 50 milliliter koude DMEM.

Pipette de verdunde matrix in het vereiste aantal putten met behulp van net genoeg volume van de oplossing om het oppervlak van de put te dekken. Breng de matrijsgecoate plaat gedurende ten minste 60 minuten over naar een couveuse bij 37 graden Celsius. Onmiddellijk voor het zaaien, aspirate de resterende matrix oplossing uit de gecoate putten.

Dan, aspirate het medium van een grotendeels confluent hPSC cultuurplaat en voeg commercieel gekochte dissociatie agent, ervoor te zorgen dat net genoeg te gebruiken om het oppervlak waarop de cellen groeien te dekken. Broed de hPSC's in het dissociatiemiddel bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten of totdat sommige kolonies beginnen los te maken. Voeg vervolgens DMEM en F-12 toe om het dissociatiemiddel te verdunnen.

Gebruik een vijf milliliter serologische pipet om voorzichtig pipette op en neer meerdere keren af te wassen alle cellen van het oppervlak van de put. Verzamel de opnieuw opgespente enkele cellen in een 50 milliliter conische buis en verdun indien nodig met DMEM en F-12. Centrifuge deze buis van verzamelde hPSCs op 350 keer g en bij vier graden Celsius gedurende drie minuten om de cellen pellet.

In afwachting van de centrifugatie, aspirate de matrix van de plaat waarin de HPSCs zal worden gezaaid. Voeg een voldoende hoeveelheid mTeSR-media toe aan de ontvangstputten om ze te dekken. Wanneer de centrifugatie is voltooid, zorgvuldig aspirate de supernatant, waardoor de pelleted hPSCs aan de onderkant van de conische buis.

Resuspend de celpellet in mTeSR aangevuld met een micromolar van commercieel verkregen Thiazovivin. Met behulp van een P1000 pipet, voorzichtig trituraat twee tot drie keer om gelijkmatig resuspend de cel pellet in een enkele cel suspensie. Onmiddellijk pipette 10 microliters van de cel suspensie in een hemocytometer en tellen het aantal cellen.

Pas het volume van de geresuspended hPSCs aan met thiazovivin-aangevulde mTeSR om de gewenste celconcentratie voor beplating te bereiken. Schud vervolgens de plaat meerdere keren in een kruispatroon om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld. Nadat de HPSC's ten minste 24 uur zijn verguld, gebruikt u een fasecontrastmicroscoop om de morfologie van de cellen te controleren met specifieke nadruk op de diameter van vergulde hPSC-kolonies.

Bereid vervolgens dag één APS-differentiatiemedium voor, zoals beschreven in tabel twee van het tekstprotocol. Een dag na het zaaien, aspirate de Thiazovivin-aangevuld mTeSR van de vergulde hPSCs en kort wassen met IMDM media. Voeg hierna dag één medium toe aan de hPSC's.

Nota van de tijd en plaats de cellen terug in de couveuse op 37 graden Celsius. Ga verder met de volgende differentiatiestappen door het benodigde differentiatiemedium voor te bereiden en toe te voegen aan de cellen op de respectieve dagen van differentiatie rond dezelfde tijd van de dag. In deze studie worden verrijkte populaties van leverknoppen en vervolgens hepatocyte-achtige cellen gegenereerd uit hPSC's.

Tegen dag twee van differentiatie, primitieve streep cellen hebben onderscheiden in dag twee definitieve endoderm cellen. De overgrote meerderheid van deze cellen drukt SOX17 en FOXA2 uit. Op dag drie van differentiatie, hebben de endoderm cellen gedifferentieerd in voorlopers die veelhoekige vorm lijken.

Later, op dag zes, hebben de voorouders zich onderscheiden tot leverknopverervers. Deze leverknoppen maken AFP, TPX3 en HNF4alpha weer. Over drie hPSC-lijnen genereert deze methode dag zes AFP-positieve leververervers met een efficiëntie van ongeveer 89%Tot slot, na 18 dagen leverdifferentiatie van hPSC's, verschijnen albumine-positieve hepatocyte-achtige cellen.

Morfologisch lijken deze cellen epitheliaal en vormen heldere randen die doen denken aan gal canaliculi. In dit stadium lijkt het cytoplasma van dag 18 hPSC-afgeleide hepatocyten donkerder dan de kern. Bij het zaaien van menselijke pluripotente stamcellen voor differentiatie, is het noodzakelijk om ze te zaaien op de juiste dichtheid en ook om ze te verdelen over de put door het schudden van de plaat.

De mogelijkheid om menselijke hepatocyten in vitro te produceren is een technologie die wetenschappers in staat stelt om mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van de lever te onderzoeken. Deze methode produceert grote aantallen menselijke hepatocyten in vitro die kunnen worden gebruikt om de leverfunctie en ziekte te onderzoeken en om uiteindelijk nieuwe therapieën voor leverfalen mogelijk te maken.