Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën
25 januari 2019
Dictyostelium-discoideum is een populair model-organisme te bestuderen van complexe cellulaire processen zoals cel migratie, endocytose en ontwikkeling. Het nut van het organisme is afhankelijk van de haalbaarheid van genetische manipulatie. Hier presenteren we methoden om te transfect Dictyostelium discoideum cellen die bestaande van kweken cellen in vloeibare media beperkingen.
De waarde van dit protocol is dat het bijna elke stam van dictyostelium discoideum toestaat om door moleculaire genetica worden gemanipuleerd, ongeacht of die spanning axenically in vloeibaar middel of niet zal groeien. Het andere voordeel van deze techniek is dat het snel en eenvoudig is. Transponeren naar transfect cellen met een exochromosomale plasmid voordat u begint te dictyosteliums mengen.
De resultaten kunnen al twee dagen na de transfectie worden gevalideerd met behulp van microscopie. Het is ongebruikelijk om te werken met dictyosteliumcellen en bacteriën suspensie. Visualisatie zal helpen om onderzoekers een idee te geven hoe de verschillende stappen van de protocollen worden uitgevoerd.
Het aantonen van de procedure met mij zal Soudabeh Imanikia, een postdoc uit mijn lab. Om te beginnen, bereid 1000 milliliter sorensen buffer werkoplossing met magnesiumchloride en calciumchloride volgens het tekstprotocol. Gebruik hierna een enkele kolonie K-aerogenes om een liter LB-medium in te enten.
Laat de bacteriën 's nachts groeien op 37 graden Celsius met schudden. Draai de cellen naar beneden in twee 500 milliliter centrifugebuizen om de cellen te oogsten. Dan, was de bacteriën een keer met 500 milliliter buffer.
Resuspend de pellet in 20 milliliter buffer. Gebruik een fotometer om de optische dichtheid van het monster te controleren en verdun het monster met buffer totdat de optische dichtheid ongeveer 100 is. Bereid hierna de H40-elektroporatiebuffer volgens het tekstprotocol voor.
Grow K aerogenes om een SM-medium 's nachts samen te brengen bij kamertemperatuur. Voeg 400 microliter bacteriële suspensie toe aan een SM agar plaat en verdeel het gelijkmatig. Neem vervolgens een steriele lus en inenting met dictyosteliumcellen en verspreid de cellen aan de ene rand van de plaat.
Broed de plaat twee dagen lang op 22 graden Celsius, om ervoor te zorgen dat de groeizones groot genoeg zijn voor transfectie. Voeg 10 milliliter K aerogene suspensie toe aan een met weefselkweek behandeld petrischaaltje van 10 centimeter. Gebruik vervolgens een 10 microliter wegwerpinentingslus om cellen uit de groeizones van de kweekplaat te schrapen.
Breng de cellen over naar een buis van 1,5 milliliter, met ijskoude H40-buffer. Draai de cellen twee seconden bij 10000 keer zwaartekracht. Gooi vervolgens de supernatant weg en zet de cellen opnieuw op in de H40-buffer.
Voeg vervolgens 100 microliter van de cellen toe aan een buis met één tot twee microgram DNA. Pipet op en neer om het cel-DNA-mengsel te mengen en over te brengen naar een voorgekoelde elektroporatie cuvette. Voeg niet meer dan twee microgram DNA toe.
Een hogere DNA-concentratie is giftig voor de cellen en vermindert de efficiëntie. Breng na elektroporatie de cellen onmiddellijk over op een voorbereide petrischaal van 10 centimeter en laat de cellen vijf uur herstellen. Om een transfectant te selecteren voor een knock-out, knock-in, of een handeling vijf knock-in, los de cellen van de Petri schotel door pipettervloeistof over het oppervlak.
Stel vervolgens drie verdunningen van het selectieve agens in volgens het tekstprotocol. Verdeel ten slotte 150 microliter van de bereide verdunningen in elke put van 96-well flat-bottom weefselkweekplaten. In dit protocol werd een dubbel verslaggever extrachromosomale plasmide systeem aangetoond.
32 uur na de transfectie, de meerderheid van de cellen uitgedrukt zowel fluorescerende gelabelde fusie-eiwitten. Een act vijf M cherry knock-in en een NC4 werd ook geprobeerd. Twee banden werden verkregen na het uitvoeren van de samenvatting op een agarose gel.
De 4127 base pair band bevat de gewenste constructie. Het gezuiverde DNA werd gebruikt voor de transfectie van NC4 cellen. Twee klonen van de NC4 transfectie werden geanalyseerd via PCR en beide toonden de voorspelde bandpatronen.
Zuidelijke vlek werd vervolgens gebruikt om de resultaten van de PCR te valideren. De NC4 groeide sneller op bacteriële gazons dan Ax2 cellen. Na vier uur konden meer NC4-cellen onder de agarose kruipen dan Ax2-cellen.
De NC4 cellen waren sneller en vertoonden een sterkere chemotactische respons op foliumzuur dan de Ax2 cellen. Gebruik altijd cellen van vers ingestelde SM-platen. Gebruik nooit cellen ouder dan vier dagen, anders zal de efficiëntie dalen.
Vers geïsoleerde, nonextenic, witte HAP stammen worden vaak gebruikt om vragen over een ruching of sociaal gedrag van dictyosteliums te beantwoorden. Onze maakt het mogelijk om moleculaire genetica toe te passen via die isolaten.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het transfecteren van Dictyostelium discoideum-cellen, waardoor genetische manipulatie mogelijk is ongeacht de groeicondities van de stam. De methode is efficiënt en eenvoudig, wat een snelle validatie van de resultaten mogelijk maakt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Genetische manipulatie
- Modelorganismen
Achtergrond
- Dictyostelium discoideum is een veelgebruikt modelorganisme voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Genetische manipulatie is essentieel voor het onderzoeken van diverse biologische vraagstukken.
- Bestaande methoden hebben beperkingen die afhankelijk zijn van de groeicondities van verschillende stammen.
- Dit protocol is erop gericht deze beperkingen te overwinnen.
Doel van de studie
- Het bieden van een betrouwbare methode voor het transfecteren van verschillende stammen van Dictyostelium discoideum.
- Het faciliteren van moleculair-genetische toepassingen in stammen die niet axenisch groeien.
- Het demonstreren van de efficiëntie van het transfectieproces.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van bacteriële en bufferoplossingen voor transfectie.
- Elektroporatie van Dictyostelium discoideum-cellen met plasmide-DNA.
- Validatie van transfectieresultaten met behulp van microscopie en PCR.
- Beoordeling van celgedrag en groei als reactie op de transfectie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie van meerdere stammen van Dictyostelium discoideum.
- Expressie van fluorescerende eiwitten waargenomen 32 uur na transfectie.
- NC4-cellen vertoonden een snellere groei en chemotactische respons vergeleken met Ax2-cellen.
- Validatie van genetische modificaties via PCR- en Southern blot-analyse.
Conclusies
- Het protocol maakt effectieve genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum-stammen mogelijk.
- Het biedt een kader voor toekomstige studies naar cellulair gedrag en genetica.
- Vers geïsoleerde stammen geven de beste resultaten wat betreft transfectie-efficiëntie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol maakt genetische manipulatie mogelijk van wild-type Dictyostelium-stammen die op bacteriën groeien, waardoor de beperkingen van axenisch-geadapteerde stammen met verstoorde Ras-signalering worden overwonnen. Het biedt een schaalbare, snelle methode voor targetvalidatie in een ziekterellevant modelsysteem, wat mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase ondersteunt. Deze aanpak breidt de moleculaire genetica uit naar milieuisoleerde stammen, waardoor de translationele continuïteit en het voorspellende vertrouwen in fenotypische screeningsworkflows worden verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in onbeschadigde signalerings- en motiliteitspaden door gebruik te maken van niet-axene stammen met intacte Ras-signaleringspaden.
- Operationele waarde: Vermindert experimentele storende factoren die voortvloeien uit defecten in macropinocytose en migratiebeperkingen die worden waargenomen bij axene stammen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie en biologische risicoreductie door mutagenese mogelijk te maken onder fysiologisch relevante groeiomstandigheden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert recombinante cellen die dubbele fluorescente reporters tot expressie brengen binnen 32 uur, wat snelle assay-uitlezingen mogelijk maakt voor compound-screening.
- Operationele waarde: Standaardiseert de transfectie-workflow met behulp van bacteriële lawns en elektroporatie, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria wordt verbeterd.
- Schaalbaarheid: Versnelt de tijdlijn van transfectie naar gevalideerde klonen in dagen in plaats van weken, wat high-throughput strain engineering ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de studie naar chemotaxis en sociaal gedrag in vers geïsoleerde wildtype-stammen, waardoor de relevantie van ziektemodellen wordt verbeterd.
- Operationele waarde: Maakt directe toepassing van moleculaire genetica op milieu-isolaten mogelijk zonder voorafgaande axenische adaptatie.
- Translationele continuïteit: Verbindt targetvalidatie in de ontdekkingsfase met preklinische fenotypes via meetbare resultaten zoals folaat-geïnduceerde chemotaxis en agarose-penetratieassays.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fasen van vroege ontdekking tot identificatie van leads door genetisch hanteerbare modellen te bieden voor pathway-interrogatie en fenotypische screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypotheseonderzoek naar chemotaxis, macropinocytose en ontwikkelingssignalering met behulp van intacte wild-type stammen.
- Screening: Levert kwantitatieve fluorescentie- en groeimetingen op bacteriële lawns voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt PCR, Southern blot en microscopie-gebaseerde validatie van genetische modificaties mogelijk binnen 32–48 uur na transfectie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische manipulatie met functionele assays, zoals chemotaxis en groei onder agarose, wat bijdraagt aan risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het engineeren van elke Dictyostelium-stam, ongeacht de isolatiebron of groeiconditie.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door artefacten van axene adaptatie te elimineren en inheemse signaleringspaden te herstellen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde bufferbereidingen, electroporatieparameters en selectieprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door tijdlijnen voor strain-engineering te verkorten en snelle go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door mechanistisch gede-riskte modellen met gevalideerde genetische modificaties te genereren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microbiologie voor de bereiding van bacteriële culturen en het hanteren van Dictyostelium op bacteriële lawns.
- Afhankelijk van toegang tot electroporatieapparatuur en steriele weefselkweekinfrastructuur voor de transfectie- en herstelstappen.
- Vereist standaardisatie van de bacteriële inoculumdichtheid (OD ~100) en de bereiding van H40-buffer tussen gebruikers.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van het protocol op verschillende wild-type isolaten of milieu-stammen.
- Beperkt tot stammen die in staat zijn tot groei op bacteriële lawns; de efficiëntie neemt af bij cellen die ouder zijn dan vier dagen na isolatie.
