Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca2 + signalering In Situ
January 7th, 2019
Genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren (GECIs) hebben radicaal veranderd hoe in situ Ca2 + imaging wordt uitgevoerd. Maximaliseren van de terugwinning van de gegevens uit deze opnamen, is juiste analyse van Ca2 + signalen vereist. De protocollen in deze paper vergemakkelijken de kwantificering van Ca2 + signalen opgenomen in situ met behulp van Spatio mapping en deeltje gebaseerde analyse.
De capaciteit om grote hoeveelheden gegevens te verkrijgen uit experimenten met calciumbeeldvorming is drastisch verbeterd, vooral met weefselbeeldvormingsexperimenten. Onze protocollen beschrijven de juiste analysetechnieken om deze gegevenssets te kwantificeren en te beschrijven. Onze protocollen genereren een reeks ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden die inherent zijn aan calciumsignalering in hele weefsels en dit kan verloren gaan in meer rudimentaire analyse.
Een uur voor de beeldvorming overdracht van een dunne darm geoogst van een muis met interstitiële cellen van Cajal of ICC die specifiek uitdrukken een genetisch gecodeerde calcium indicator naar het stadium van een draaiende schijf confocale microscoop. En continu doorsnijd het weefsel met 37 graden Celsius Krebs-Ringer bicarbonaat of KRB oplossing. Met behulp van een 60 tot 100 X vergroting lokaliseren van de stellate-vormige myenteric plexus ICC of ICC-MY tussen de cirkelvormige en longitudinale gladde spierlagen van de dunne darm.
Zoek vervolgens de spindelvormige diepe gespierde plexus ICC of ICC-DMP in één vlak tussen de cirkelvormige gladde spierlaag en de submucosale plexus en sla de films op als een stapel TIFF-beelden. Als u spatiotemporale kaarten of SMS van de calciumactiviteit ICC-DMP wilt maken, opent u de afbeeldingsstack in ImageJ en klikt u op Afbeelding, Type en 32-bits om de beeldkwaliteit te wijzigen. Als u een regelscan wilt maken, klikt u met de rechtermuisknop op het gereedschap Regelselectie en selecteert u gesegmenteerde lijn.
Met één klikken links een lijn tekenen langs de middelste toegang van een individuele ICC-DMP, dubbelklikken wanneer de hele cel is geschetst. Selecteer Afbeelding, Stapels en Reslice. Er verschijnt een pop-upvenster.
Selecteer 90 graden draaien om de lijnscan van links naar rechts te oriënteren, zodat deze kan worden gekalibreerd en afgelezen tegen de tijd op de x-as met ruimte op de y-as en op OK. De spatiotemporale kaart zal verschijnen. Om de amplitude van de calciumsignalen van de kaart nauwkeurig te meten, selecteert u rechthoekige selectie en tekent u een gebied van belang rond het gebied binnen de STM dat het meest uniforme en minst intense gebied van fluorescentie weergeeft. Klik op Analyseren en Histogram om een gemiddelde waarde van de intensiteit binnen het geselecteerde interessegebied te verkrijgen en klik op Bewerken, Selecteren, Alles selecteren om de hele STM te selecteren.
Klik vervolgens op Proces, Wiskunde en Verdeel en voer de gemiddelde waarde van de intensiteit in met het geselecteerde STM-gebied dat van belang is in het pop-upvak. De STM wordt zwart. Corrigeer dit door in het pop-upvenster op Afbeelding, Aanpassen, Helderheid/Contrast en Automatisch te klikken.
De lijnscan wordt nu gekalibreerd voor de amplitude met de intensiteit van de fluorescentie uitgedrukt als de fluorescentie gedeeld door de nulfluorescentie. De STM geeft het aantal frames in de TIFF-stapel op de x-as weer en het aantal pixels dat de lengte van de cel op de y-as weergeeft. Als u de temporele en ruimtelijke gegevens van de calciumsignalen wilt kwantificeren, klikt u op Afbeelding en Eigenschappen en voert u de juiste waarden in om de STM volledig te kalibreren voor ruimte en tijd in het pop-upvenster.
Als u de afzonderlijke calciumgebeurtenissen wilt analyseren, klikt u op Rechte lijn en klikt u op de STM om een rechte horizontale lijn door het midden van een calciumgebeurtenis parallel aan de x-as te tekenen. Klik vervolgens op Profiel analyseren en plotten. Er verschijnt een vak met het plotprofiel van de calciumgebeurtenis.
Open het filmbestand in Volumetry en klik met de rechtermuisknop om STK-filter Differentiate te selecteren voor deeltjesanalyse van de ICC-MY calciumsignaleringsgegevens. Klik nogmaals met de rechtermuisknop om een waarde in te voeren om te differentiëren. Druk op Enter en klik links om de differentiatie te starten.
Als u deeltjes wilt maken, gebruikt u de middelste muisknop om door de film te bladeren om een framesectie van 20 tot 40 te selecteren die een rustige periode bevat, gevolgd door het optreden van een calciumtransient cluster en 20 tot 40 frames die direct na het cluster volgen. Wanneer alle frames met de rechtermuisknop zijn geselecteerd, klikt u in het filmvenster om toegang te krijgen tot STK OPS Ramp DS-deeltjesinformatie en klikt u om een deeltjesanalyseroutine uit te voeren die de drempel geleidelijk van het maximum naar de minimale intensiteit verhoogt. Om een succesvolle deeltjesanalyse te garanderen, moet u ervoor zorgen dat u zoveel mogelijk precaliumtransient cluster niet-activiteit opneemt, en zoveel postcalciumtransient cluster non-activiteit als je.
Dit zal helpen om de signaal-ruisverhouding te stimuleren. De analyse wordt grafisch weergegeven in het plotvenster als plot van ruis en in het sporenvenster als drie kleursporen met het groene spoor dat het aantal deeltjes vertegenwoordigt, het rode spoor dat de gemiddelde deeltjesgrootte vertegenwoordigt, en het blauwe spoor dat de absolute intensiteitsdrempel vertegenwoordigt. Om histogram balans van de plot van deeltjeslawaai druk H op het toetsenbord.
Druk vervolgens op de rechter beugeltoets om door kleurenschema's te fietsen totdat de achtergrond wit is met de kleursporen erop. Druk één keer op F op het toetsenbord om een meetinstrument naar boven te brengen. Druk vervolgens op F een tweede keer om een enkele verticale lijn te markeren in de schuifbalk van het sporenvenster op het perceel op het kruispunt waar de gekleurde percelen beginnen te verschuiven naar de rechterkant.
In het venster Traces gebruikt u de middelste muisknop om van het buigpunt van het rode spoor naar de gemarkeerde witte verticale lijn te scrollen. Nadat u het weergegeven Y-gemiddelde hebt opgetensinterding, klikt u opnieuw op de middelste muisknop in het traceervenster om de selectie van het blauwe spoor uit te voeren. Klik in het filmvenster op C om een kleurenwiel naar boven te brengen en D om de drempelwaarde aan te passen.
Geldige deeltjes worden nu in het rood weergegeven en de deeltjes die verzadigen zullen wit zijn. Gebruik de linker muisknop om te scrollen totdat de witte gebieden zijn verwijderd en gebruik de middelste muisknop om de gele numerieke waarde in het kleurenwiel aan te passen aan de gemiddelde waarde Y om alles in het rood toe te wijzen als een actief calciumsaleusdeeltje op het vastgestelde drempelpunt. Als u de gegevens wilt opslaan als een op coördinaat gebaseerd deeltjesbestand, klikt u met de rechtermuisknop om toegang te krijgen tot STK 3D, slaat u deeltje nul en klikt u met de linkerklik om het bestand op te slaan.
Als u warmtekaarten voor deeltjesactiviteit wilt maken, opent u het opgeslagen deeltjesbestand en klikt u met de rechtermuisknop in het filmvenster om toegang te krijgen tot deeltjes-STKops, StatMap Flag en voert u vlagtoewijzingen in om te analyseren. Klik om de analyse en een warmtekaart met de totale lengte van de opname toe te passen met verschillende kleuren die het percentage optreden tijdens de opname vertegenwoordigen. Klik met de rechtermuisknop om de heatmap op te slaan als een TIFF-bestand.
Klik vervolgens met de rechtermuisknop in het filmvenster om toegang te krijgen tot deeltjesmeting, deeltjesstatistieken STK is gelijk aan en voer een vlagtoewijzing in voor de analyse. Een reeks sporen zal worden gegenereerd in het spoor venster. STM-analyse biedt de mogelijkheid om de ruimtelijke kenmerken van calciumsignalering te monitoren en vast te leggen, zoals de ruimtelijke spreidings- en voortplantingssnelheid.
Deze informatie kan worden vergaard om een vrij volledig beeld van calcium signalering gedrag binnen cellen in hun eigen omgeving. Met behulp van deeltjesanalyse kan kwantitatieve informatie over calciumsignalering worden berekend door het deeltjesgebied en het aantal deeltjes te meten, die samen kunnen worden gebruikt om de ruimtelijke bereiken van calciumsignaalactivering binnen een bepaald gezichtsveld te bepalen. Deeltjesanalyse maakt het ook mogelijk de diepgaande kwantificering van subcellulaire calcium signalering door middel van onderzoek van de locatie en het afvuren van calcium vuurplaatsen.
Door de deeltjes in verschillende vlaggen toe te wijzen op basis van hun temporele eigenschappen, kunnen de initiërende deeltjes nauwkeurig in kaart worden gebracht. En een schat aan harde gegevens verkregen over het aantal initiatie sites, de grootte van de site in pixels en micrometers, waarschijnlijkheid van elke initiatie site afvuren een of meerdere keren tijdens elke calcium voorbijgaande cluster, en het percentage van het afvuren sites die brand tijdens elke calcium voorbijgaande cluster cyclus kan worden verkregen. Consistentie is de sleutel tot succes in dit protocol.
Alle gegevenssets en alle films moeten precies hetzelfde worden behandeld om betrouwbare, herhaalbare resultaten te garanderen. Dit geldt vooral bij het omgaan met deeltjesbestanden. Onze protocollen maken een diepe karakterisering van calciumsignalering in situ mogelijk, en een reeks statistische methoden, wanneer ze op de juiste manier worden gebruikt, kunnen verschillen tussen een reeks ruimtelijke en temporele parameters beoordelen.
Deze analysetechnieken in ons protocol hebben onderzoekers in staat gesteld om eerder niet-adresseerbare vragen te stellen en te beantwoorden met betrekking tot darmtempomaking, en darmenbinnenvatie, evenals de neuronale controle van de onderste urinewegen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op het verbeteren van de analyse van calcium imaging-gegevens in weefselexperimenten, specifiek met behulp van genetisch gecodeerde Ca2+ indicatoren (GECI's). Het biedt gedetailleerde protocollen die de kwantificering van calciumsignalen mogelijk maken door middel van geavanceerde analytische technieken.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Calcium imaging
- Signaalkwantificering
- Weefselanalyse
Achtergrond
- Verbeterde gegevensverwerving uit calcium imaging-experimenten
- Belangrijkheid van nauwkeurige analysetechnieken voor het vastleggen van calciumsignalering
- Gebruik van genetisch-gecodeerde indicatoren voor in situ-beeldvorming
Gebruikte methoden
- Spatiotemporele kaartlegging
- Deeltje-gebaseerde analyse
- Microscopietechnieken (confocale microscoop)
Belangrijkste resultaten
- Protocollen leveren ruimtelijke, temporele en intensiteitsgegevens die cruciaal zijn voor het begrijpen van calciumsignalering
- Verbeterde nauwkeurigheid bij het meten van calciumgebeurtenissen en hun eigenschappen
- Een raamwerk vastgesteld voor het analyseren van calcium transient clusters in weefselmonsters
Conclusies
- De studie toont geavanceerde methoden voor het kwantificeren van calciumsignalen in weefsels
- Benadrukt het belang van verfijnde analytische benaderingen voor betere biologische inzichten in calciumsignalering
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of intracellular Ca2+ signaling in native tissue environments is critical for de-risking target validation in gastrointestinal and neuromuscular drug discovery. Spatio-temporal mapping and particle-based analysis enable extraction of spatial, temporal, and intensity parameters from high-resolution Ca2+ imaging data, reducing reliance on simplistic ROI measurements that overlook signaling complexity. This approach supports mechanistic insight into pacemaker activity and neuronal control pathways, informing predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying Ca2+ signaling patterns such as frequency, duration, propagation velocity, and amplitude in intact tissues.
- Operational Value: Supports biological de-risking through detailed characterization of interstitial cells of Cajal (ICC) activity, a key regulator of gastrointestinal motility.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking Ca2+ signaling dynamics to intestinal pacemaking and neuronal control of the lower urinary tract.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating quantitative outputs from Ca2+ transient clusters in situ.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through calibrated spatiotemporal maps (STMs) and particle-based analysis with defined thresholding and flag assignment protocols.
- Scalability: Enables screening readiness via coordinate-based particle files and heat maps that allow high-volume data processing and cross-experiment comparison.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase Ca2+ signaling analysis in intestinal ICC to preclinical validation of motility disorders and urinary tract dysfunction.
- Mechanistic De-risking: Allows in-depth quantification of subcellular Ca2+ signaling through examination of initiation site location, firing probability, and cluster dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing hard data on the number of initiation sites, site size in pixels/micrometers, and percentage of firing sites active per transient cluster cycle.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing quantitative Ca2+ signaling data that informs target validation and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing spatial spread and propagation velocity of Ca2+ signals via STM analysis.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible quantification of particle area and count, enabling spatial range determination of Ca2+ signal activation in a defined field of view.
- Analytics: Generates statistical outputs on temporal characteristics of particles, allowing allocation into flags to map initiating particles and assess firing probabilities.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of Ca2+ signaling patterns linked to intestinal pacemaking and neuronal control pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for analyzing Ca2+ signaling across model systems through standardized protocols for STM calibration, particle analysis, and heat map generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in Ca2+ signaling dynamics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via calibrated STMs, particle-based analysis with threshold adjustment, and coordinate-based data output.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of inconsistent or non-reproducible signaling patterns.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions supported by quantitative data on initiation site density, size, and firing reliability.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, ImageJ, and Volumetry for STM generation and particle analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include spinning disk confocal microscope, TIFF image stack handling, and software for line scan reslice, histogram balancing, and threshold adjustment.
- Cross-team standardization requirements involve consistent treatment of all data sets and movies to ensure reliable, repeatable results, particularly for particle file generation and flag-based analysis.
- Adaptation considerations across model systems include adjusting line scan orientation, frame selection for quiescent and active periods, and threshold calibration based on fluorescence intensity profiles.
- Practical limitations include the need for careful selection of 20–40 frame sections encompassing quiescent periods, Ca2+ transient clusters, and post-cluster activity to ensure successful particle analysis and optimal signal-to-noise ratio.
