Name: Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Leer plaats-geleide mutagenese voor moleculaire biologie met PCR-gebaseerde 2-staps en 3-staps protocollen. Deze methode onderzoekt RNA-RNA en RNA-eiwit interacties in Escherichia coli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Universiteit van Zuid-Denemarken open access beleid subsidies.

1. vector selectie
<ol><li>Kies een vector naar stroomafwaartse expermenteren uitvoeren. Elke vector is van toepassing voor deze 2 - en 3-staps PCR methode.</li>
	<li>Op basis van de keuze van vector, kies passende enzymen van de beperking voor het klonen.</li>
</ol>2. primer ontwerp voor site gericht mutagenese
<ol><li>Kiezen tussen ofwel de 2-step of 3-step PCR-strategie (2-step is alleen voor mutaties < 200 bp uiteinden van DNA van belang). Voor de 2-staps-PCR, gaat u naar stap 2.2 en ga naar stap 2.3 voor de 3-stap-PCR.</li>
	<li>Inleidingen voor PCR 2-step ontwerpen.<ol>
<li>Ontwerp primer 1 en 3 te vergroten van DNA van belang en met een 5' overhang die bevat 4 nucleotiden (bijvoorbeeld ATAT of AGCT) gevolgd door de relevante erkenning beperkingsplaats nodig te klonen in de gekozen vector.</li>
		<li>Ontwerp primer 2 in te voeren van mutation(s) op de gewenste site (s) en de flank van de mutatie met 10-15 complementaire nucleotiden aan beide zijden. Maak de primer omgekeerde als de mutatie wordt ingevoerd aan de 5'-eind vooruit of achteruit als de mutatie wordt ingevoerd aan de 3'-eind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inleidingen voor PCR 3-staps ontwerpen.<ol>
<li>Ontwerp primer 1 en 4 te vergroten van DNA van belang en met een 5' overhang die bevat 4 nucleotiden (bijvoorbeeld ATAT of AGCT) gevolgd door de relevante erkenning beperkingsplaats nodig te klonen in de gekozen vector.</li>
		<li>Ontwerp primer 2 en 3 in te voeren van de mutation(s) op de gewenste site (s) en de mutatie flank door 10-15 complementaire nucleotiden aan beide zijden. Primer 2 en 3 zijn complementaire omkeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de PCR versterking van wild type DNA voor het klonen
Opmerking: Zie voor details over PCR,6.
<ol><li>Het uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 2 (2-step PCR) of 1 + 4 (3-staps PCR) en wild type DNA gebruiken als sjabloon voor gebruik van PCR product I. de PCR-programma in tabel 1.</li>
	<li>PCR valideren door agarose gelelektroforese.<ol>
<li>Maak een agarose gel oplossing (2%) door toevoeging van 2 g agarose per 100 mL 1 x Tris-acetaat-ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) (TAE) buffer. Los de agar door te koken in een magnetron. Toevoegen van de DNA-kleuring kleurstof ethidiumbromide (om een eindconcentratie van ~ 0,5 µg/mL) aan de agarose gel oplossing voor visualisatie.</li>
		<li>Gegoten agarose gel, plaats het in een eenheid van elektroforese en PCR monsters (gemengd met DNA laden kleurstof) en een DNA-ladder van bekende grootte laden. Voorbeelden uitvoeren op 75 W voor 45 min of totdat bands adequaat worden gescheiden, en visualiseren van bands aan een ultraviolet (UV) tafel of met een gel imaging systeem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuiveren van het PCR-product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en de concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).</li>
	<li>Het gezuiverde DNA bij-20 ° C (in Tris-EDTA (TE) buffer-lange termijn opslag) of 4 ° C (in dH2O-korte termijn opslag) bewaren tot gebruikte in stap 5.</li>
</ol>4. de PCR om plaats-geleide mutaties in het DNA
<ol><li>PCR voor 2-step PCR (zie stap 4.2 voor 3-staps PCR)<ol>
<li>Uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 2 of mutaties zijn uiteindelijk 5' 2 + 3 als de mutaties in de 3' beëindigen en wild type DNA PCR product II te verkrijgen als sjabloon te gebruiken (Zie tabel 1 voor PCR programma).</li>
		<li>PCR valideren door agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2.</li>
		<li>Zuiveren van het PCR-product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en de concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).</li>
		<li>Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) tot gebruikte in stap 5.</li>
		<li>Uitvoeren van PCR6 gebruik van PCR product II als de primer samen met primer 3 als mutaties in de 5' end of primer 1 als de mutaties in de 3'-eind en gebruik van wild type DNA als sjabloon PCR product III te verkrijgen (Zie tabel 1 voor PCR programma).</li>
		<li>PCR valideren door agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2.</li>
		<li>Zuiveren van PCR product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).</li>
		<li>Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) tot en met stap 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR voor 3-staps PCR<ol>
<li>Het uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 2- en 3 + 4 in aparte reacties en wild type DNA gebruiken als sjabloon voor PCR product II en III (Zie tabel 1 voor PCR programma).</li>
		<li>Agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2 PCRs valideren.</li>
		<li>Zuiveren van PCR producten met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en de concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).</li>
		<li>Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O).</li>
		<li>Het uitvoeren van PCR6 gebruikend inleidingen 1 + 4 en 2-5 ng van beide PCR producten II en III te gebruiken als de sjablonen (in dezelfde reactie) te verkrijgen van PCR product IV (Zie tabel 1 voor PCR programma).</li>
		<li>PCR valideren door agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2. Opmerking: Het is niet ongebruikelijk om verschillende onjuiste bands (kan soms worden verminderd door met minder sjabloon). De onjuiste PCR producten kunnen echter worden genegeerd als de correct formaat band is weggesneden en gel-geëxtraheerde.</li>
		<li>Als dit correct zuiveren van PCR product met een gel extractie kit (Tabel van materialen) en concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen).</li>
		<li>Winkel gezuiverd DNA bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) tot en met stap 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. recombinatie van wild type en mutant versie (s) van DNA in de gekozen vector
Opmerking: Voor meer informatie over het als volgt, Zie7.
<ol><li>Digest gezuiverd PCR producten I en III (uit 2-step PCR) en/of IV (vanaf 3-staps PCR) met behulp van de desbetreffende enzymen van de beperking.<ol>
<li>In 20 µL 1 x spijsvertering buffer met 1 µL van elke restrictie-enzym, digest 200 ng van PCR product bij 37 ° C gedurende 30-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuiveren van verteerd PCR-product door gel-extractie met behulp van een gel extractie kit (Tabel of Materials), meten van de concentratie van de DNA van gezuiverde DNA met een spectrofotometer (Tabel van materialen) en opslaan bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2 O) totdat gebruikt voor stap 5.6.</li>
	<li>Gezuiverde vector met relevante restrictie-enzymen verteren en behandelen met alkalische fosfatase afnemen van vector opnieuw afbinding gebeurtenissen. PCR producten met alkalische fosfatase niet behandelen.<ol>
<li>In 30 µL 1 x spijsvertering buffer met 1 µL van elke restrictie-enzym en 1 µL van alkalische fosfatase, digest 1000 ng van de vector bij 37 ° C gedurende 30-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aparte verteerd vector uit afval DNA (bijvoorbeeld Onbesneden vector en cut-out met DNA) met behulp van agarose de Elektroforese van het gel zoals in stap 3.2.1 en 3.2.2.</li>
	<li>Zuiveren van verteerd vector door gel-extractie met behulp van een gel extractie kit (Tabel of Materials), DNA concentratie van gezuiverde DNA meten met een spectrofotometer (Tabel van materialen) en opslaan bij-20 ° C (in TE de buffer) of 4 ° C (in dH2O) totdat gebruikt voor stap 5.6.</li>
	<li>Afbinden verteerd PCR producten in verteerd vector met de reacties die in tabel 2aangegeven.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur voor 2 h of 's nachts bij 16 ° C.</li>
	<li>Tover het ontvangende stam (bijvoorbeeld E. coli K12) met afbinding reacties.<ol>
<li>Stam groeien tot OD600= 0.3-0.5 en overdracht een 1 mL cultuur zoveel 1,5 mL buizen als ligase reacties.</li>
		<li>Draai bij 3500 x g gedurende 5 min en weggeworpen.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 200 μL van transformatie buffer (10 mL lysogenie Bouillon (LB) met 0,1 g/mL polyethyleenglycol 3350, 5% dimethyl-sulfaat en 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Afbinding reactie toevoegen, en plaats de buizen op ijs gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Warmte-schok voor 2 min op 42 ° C.</li>
		<li>Voeg 1 mL LB de 1,5 mL buizen, en toestaan van fenotypische expressie van antibiotische weerstand gedurende ten minste 45 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>Draai de cellen bij 3500 x g gedurende 5 min, werp 1 mL van het supernatans en resuspendeer de cellen in het resterende supernatant.</li>
		<li>Plaat van de cellen op platen met de juiste antibiotica en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het identificeren van transformants vectoren met succesvolle integratie van DNA invoegen (bijvoorbeeld door PCR met behulp van vector - en insert-specifieke primers) herbergen.</li>
	<li>Valideren van de opeenvolging van DNA door sanger sequencing. Let op: Gebruik niet de dezelfde inleidingen voor het rangschikken zoals gebruikt voor stap 5,9.</li>
</ol>6. gebruik gebouwde vectoren voor in vitro of in vivo experimenten
<ol><li>In vivo experiment Opmerking: Dit is een voorbeeld van het gebruik van een vector uitspreken wild type/gemuteerd RNA te karakteriseren post-transcriptional verordening. Zie voor meer informatie over het westelijke bevlekken,8.<ol>
<li>E. coli stammen van de K12 met geconstrueerde vectoren in geschikte voedingsbodem groeien en veroorzaken expressie indien nodig. De monsters van de oogst door centrifugeren.</li>
		<li>Natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) monsters voorbereiden door ontbinding van cel pellets in 1 x SDS monster buffer (62,5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% SDS, 0.002% bromophenol blauw, β-mercaptoethanol 5%, 10% glycerol) en kook bij 95 ° C gedurende 5 min. Opmerking: Het is mogelijk te werpen van een gel of een commercieel beschikbare geprefabriceerd gel te gebruiken. De laatste werd gebruikt in de resultaten gepresenteerd in Figuur 3 (Tabel van materialen).</li>
		<li>Laden van 107 cellen van elk monster in aparte wells (inclusief de ladder van een eiwit), en stel gel bij 200 V tot eiwitten zijn gescheiden (ongeveer 45 min).</li>
		<li>Vlek van de eiwitten op een cellulose-membraan door semi-droge overdracht bij 80 mA gedurende 1 uur.</li>
		<li>Het blokkeren van het membraan met een mengsel van eiwitten (bijvoorbeeld 5% melk-poeder opgelost in 1 x Tween 20-Tris-gebufferde zoutoplossing (TTBS) buffer).</li>
		<li>Voeg primair antilichaam (opgelost in 1 x TTBS buffer) die zijn bestemd voor de proteïne van belang (bijvoorbeeld GFP-, vlag- of HIS-gelabeld eiwit) en incubeer gedurende 1 h met zachte agitatie.</li>
		<li>Wassen membraan in 1 x TTBS voor 10 min voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen. Herhaal tweemaal meer.</li>
		<li>Toevoegen van secundair antilichaam (opgelost in 1 x TTBS buffer) die zich richt op de primaire antilichamen en voldoende zijn voor detectie (bijvoorbeeld horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundaire antilichamen. Incubeer gedurende 1 h met zachte agitatie.</li>
		<li>Wassen het membraan in 1 x TTBS voor 10 min voor het verwijderen van niet-afhankelijke antistoffen. Herhaal tweemaal meer.</li>
		<li>Visualiseer het membraan met een techniek die compatibel is met de secundaire antilichamen (bijvoorbeeld door imaging na incubatie met een luminol afkomstige Chemoluminescentie, als een secundair antilichaam met HRP-geconjugeerde werd gebruikt).</li>
	</ol>
</li>
	<li>In vitro experiment Opmerking: Dit is een voorbeeld van het gebruik van de vector als een sjabloon voor in vitro transcriptie van RNA te karakteriseren van RNA-eiwit interacties. Zie voor verdere details over de EMSA,9.<ol>
<li>In vitro afschriften met behulp van een T7 in vitro transcriptie kit (Tabel van materialen) en vectoren uit stap 5 als sjablonen maken</li>
		<li>Scheiden van RNA transcripties door pagina op een 4,5% 7 M ureum denaturering van gel, en RNA rechtstreeks extraheren uit de gel door electro elutie met dialyse buizen (Tabel van materialen).</li>
		<li>Label RNA (bijv, radiolabeling met γ -32P-ATP met behulp van T4-polynucleotide kinase (Tabel van materialen) en weer te zuiveren met kolommen (Tabel van materialen). Let op: Voordat u gaat werken met radioactief materiaal, overleggen met de veiligheidsbeambte van de lokale straling.</li>
		<li>Meng geëtiketteerd-RNA met toenemende concentraties van eiwitten in aparte reacties in een 1 x bindende buffer (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT)). Opmerking: In de gepresenteerde resultaten (Figuur 4), 2 nM radiolabeled csgD mRNA werd gemengd met een helling van 0 tot en met 2 µM Hfq eiwit (monomeer concentratie).</li>
		<li>Het toestaan van eiwitten en RNA vóór het laden van hybridisatie mix op een niet-denaturering polyacrylamidegel te vermengen en uitvoeren van de gel voor 1,5 h bij 200 V.</li>
		<li>Visualiseer de gel met een techniek die compatibel zijn met het labelen van stap 6.1.3. (bijvoorbeeld door phosphoimaging als radiolabeling werd toegepast).</li>
		<li>Kwantificeren van de relatieve intensiteit van de verschoven bands met een beeldvorming verwerking programma en passen een kromme (sigmoïdale) de gegevens met behulp van een grafiek en de software van de analyse van de gegevens (Tabel van materialen). Op basis van de ingerichte curve, kunnen dissociatie constante (Kd) waarden worden automatisch bepaald met de software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Plaats-geleide mutagenese heeft een breed scala van verschillende toepassingen, en hier, representatieve resultaten van een in vivo en in vitro experiment werden opgenomen als voorbeelden van hoe te maken van biologische conclusies met behulp van de techniek. Plaats-geleide mutagenese geweest voor lang de gouden standaard voor RNA interactie studies. De sterkte van de techniek ligt in de combinatie van de invoering van de relevante mutaties met stroomafwaartse tests en experimenten (bijv. westelijke vlek of EMSA) conclus...

DNA wordt vaak genoemd de blauwdruk van een levende cel omdat alle structuren van de cel zijn gecodeerd in de opeenvolging van haar DNA. Nauwkeurige replicatie en DNA herstelmechanismes voorkomen dat slechts zeer lage tarieven van mutaties, die is van essentieel belang voor de instandhouding van de juiste functies van gecodeerde genen. Wijzigingen van de opeenvolging van DNA kunnen opeenvolgende functies op verschillende niveaus, beginnend met DNA (erkenning door de transcriptiefactoren en restrictie-enzymen), vervolgens RNA (base-paar complementariteit en secundaire structuur verbouwingen) en/of eiwit (amino zure vervangingen, weglatingen, toevoegingen of frame-verschuivingen). Terwijl vele mutaties genfunctie niet aanzienlijk beïnvloeden, kunnen sommige mutaties in het DNA grote gevolgen hebben. Plaats-geleide mutagenese is dus een waardevol instrument voor het bestuderen van het belang van specifieke DNA sites op alle niveaus.
Dit protocol beschrijft een gerichte mutagenese aanpak gebruikt om specifieke mutaties. Het protocol is gebaseerd op twee verschillende strategieën van de PCR: een 2-step of een 3-stap-PCR. De 2-staps-PCR is van toepassing als de gewenste mutatie dicht bij de 5' eindigt of het einde 3' van het DNA van belang ligt (< 200 basenparen (bp) vanaf het einde) en de 3-staps PCR geldt in alle gevallen.
In de benadering van de PCR 2-step 3 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 3, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een enkele primer is ontworpen om op te nemen van de mutatie. De invoering van de primer (primer 2) mutatie moet een omgekeerde oriëntatie als de mutatie dicht bij het 5'-eind en een voorwaartse richting ligt als de mutatie dicht bij de 3'-eind ligt. In de eerste stap van de PCR versterkt primer 1 + 2 of 2 + 3 een klein fragment dicht bij de 5' end of 3' end, respectievelijk. Het resulterende PCR product wordt dan gebruikt als een primer in stap twee met primer 1 of 3, dus wat resulteert in een PCR-product met een mutatie in het DNA van belang (figuur 1A).
In de 3-staps PCR, 4 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 4, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een reeks inleidingen is ontworpen voor het opnemen van specifieke mutaties met overlappende complementariteit (inleidingen 2 en 3, reverse en doorstuurt, respectievelijk). In stap één en twee, inleidingen 1 + 2- en 3 + 4 versterken het einde 5' en 3'. In stap drie, de resulterende PCR producten uit stap 1 en 2 worden gebruikt als sjablonen en versterkt met inleidingen 1 + 4. Het resulterende PCR product is dus het DNA van belang met de gewenste Mutatie (figuur 1B).
Terwijl de gemuteerde DNA kan worden gebruikt voor elke stroomafwaartse toepassing, wordt dit protocol beschreven hoe opnieuw het combineren van het DNA in een klonen vector. Het gebruik van klonen van vectoren heeft verschillende voordelen zoals gebruiksgemak klonen en specifieke experimentele toepassingen afhankelijk van de eigenschappen van de vector. Deze functie wordt vaak gebruikt voor RNA interactie studies. Een andere techniek voor RNA interactie studies is structurele sonderen van het RNA in complex met een andere RNA1,2 of eiwit3,4. Echter, structurele indringende wordt alleen uitgevoerd in vitro overwegende dat plaats-geleide mutagenese en latere klonen toestaan voor interactie studies in vivo.
Plaats-geleide mutagenese is uitgebreid gebruikt voor RNA interactie studies zoals hier gepresenteerd. Echter de belangrijkste met betrekking tot 2 - of 3-staps PCR-methode is van toepassing op elk stuk van DNA, en dus niet alleen beperkt tot RNA-interactie studies.
Om te illustreren de techniek en het mogelijke gebruik ervan, wordt karakterisering van regio's belangrijk voor verordening van de post-transcriptional van het mRNA, csgD, van Escherichia coli (E. coli) gebruikt. In E. coli, csgD wordt gericht door de kleine niet-coderende RNA, McaS, in samenwerking met een eiwit, Hfq, te onderdrukken van eiwit-expressie van CsgD2,4,5. De techniek wordt gebruikt voor het invoeren van mutaties voor de regio van base-paring tussen csgD en McaS, en op de site van de bindende Hfq van csgD. Het verkregen DNA wordt vervolgens gekloond in een vector geschikt voor latere experimenten. Downstream toepassingen van de techniek omvatten zowel in vivo en in vitro experimenten. Ter illustratie, voorbeeld 1 is gekenmerkt in vivo met behulp van een westelijke vlek assay en voorbeeld 2 in vitro met behulp van een kwantitatieve analyse van elektroforetische mobiliteit, shift (EMSA) wordt gekenmerkt. In beide gevallen is geïllustreerd hoe plaats-geleide mutagenese kan worden gebruikt in combinatie met andere technieken voor het maken van biologische conclusies over een gen van belang.

<table><tbody><tr><td>Anti-GroEL antibody produced in rabbit</td><td>Merck</td><td>G6532</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Gelbeeldvorming werkstation</td></tr><tr><td>Custom DNA oligo</td><td>Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix</td><td>NA</td><td>Spectrofotometer voor nucleïnezuurmetingen</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide oplossing 1 %</td><td>Carl Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Gel Extractie Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-buis Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>Dialysebuizen voor elektro-elutie</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcriptie Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Horizontaal elektroforese systeem</td></tr><tr><td>Monoclonal ANTI-FLAG M2 antilichaam geproduceerd in muis</td><td>Merck</td><td>F3165</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Muis Immunoglobulinen</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0447</td><td>HRP geconjugeerde secundair antilichaam</td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>RNA-zuivering</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Eiwit Gels</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Bis-Tris gels voor eiwitscheiding</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>DNA polymerase</td></tr><tr><td>PowerPac HC Hoogstroomvoeding</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Konijn Immunoglobulinen</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP geconjugeerde secundair antilichaam</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>Grafiek- en dataanalyse softwaretool</td></tr><tr><td>T100 Thermische Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>PCR machine</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer (Tris-acetaat-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

plaats-geleide mutagenese voor in vitro en in vivo experimenten wordt geïllustreerd met rna interacties in escherichia coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in het DNA te onderzoeken van de wisselwerking tussen kleine niet-coderende RNA acid (sRNA) moleculen en doel messenger RNAs (mRNAs). Daarnaast wordt plaats-geleide mutagenese gebruikt voor het toewijzen van specifieke proteïne bandplaatsen aan RNA. Een 2-stap en 3 introductie van de PCR op basis van mutaties wordt beschreven. De aanpak is relevant voor alle eiwit-RNA en RNA-RNA interactie studies. Kortom, de techniek is gebaseerd op het ontwerpen van inleidingen met de gewenste mutation(s), en door middel van 2 of 3 stappen van PCR synthese van een PCR-product met de mutatie. Het PCR-product wordt vervolgens gebruikt voor het klonen. Hier beschrijven we hoe u kunt plaats-geleide mutagenese met zowel de 2 - en 3-stap-benadering om mutaties op de sRNA, McaS en de mRNA, csgD, RNA-RNA en de RNA-eiwit interacties te onderzoeken uitvoeren. We passen deze techniek om te onderzoeken van RNA interacties; de techniek is echter die van toepassing zijn op alle mutagenese studies (bijv. DNA-eiwit interactie, aminozuur vervanging/verwijderen/toevoeging). Het is mogelijk om elke vorm van mutatie met uitzondering van niet-natuurlijke grondslagen, maar de techniek is alleen van toepassing als een PCR-product kan worden gebruikt voor downstream toepassing (bijvoorbeeld klonen en sjabloon voor verdere PCR).

Te onderzoeken van RNA interacties met betrekking tot post-transcriptional regulering van csgD, een dubbele vector setup werd gekozen: één aan de csgD express mRNA en andere kleine niet-coderende RNA, McaS uitspreken. csgD in pBAD33, oftewel een arabinose afleidbare-medium-kopie plasmide met chlooramfenicol weerstand werd gekloond en McaS werd gekloond in mini R1 pNDM220, oftewel een plasmide isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) afleidbare laag kopie met...

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in deoxyribonucleic acid (DNA). Dit protocol beschrijft hoe het te doen plaats-geleide mutagenese met een 2-step en 3-staps polymerase-kettingreactie (PCR) gebaseerde benadering, die is van toepassing op elk fragment van DNA van belang.

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Site-gerichte mutagenesis is nuttig om moleculaire interacties te bestuderen, zoals RNA-RNA, en RNA eiwit interacties. Dit protocol beschrijft hoe u op locatie gerichte mutagenesis uitvoert met een twee- of driestaps PCR-benadering. De belangrijkste voordelen van de methode zijn de diversiteit van verschillende mutaties die kunnen worden opgenomen, evenals een relatief gemak en kosten om dit te doen.Om te beginnen, gebruik maken van de wild-type DNA-sjabloon en primer paren twee, een, en twee, drie, specifiek voor 2-staps, of primer paren drie, een, en drie, vier, specifiek voor 3-staps PCR te verkrijgen PCR product een. Om PCR-producten te valideren door agarose gel elektroforese, maak een 2%agarose gel door het oplossen van twee gram agarose in 100 milliliter 1X TAE buffer, met behulp van een magnetron. Voeg ethidiumbromide toe bij een uiteindelijke concentratie van 0,5 microgram per milliliter.Gooi dan de agarose gel. Wanneer gestold, plaats het in een elektroforese eenheid. Laad een DNA-ladder van bekende grootte, en de PCR monsters gemengd met DNA laden kleurstof in putten.Voer monsters uit op 75 volt gedurende 45 minuten. En visualiseer banden op een UV-transilluminator of met een gelbeeldvormingssysteem. Zuiver vervolgens het PCR-product met een gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant en meet de concentratie van het gezuiverde DNA met een spectrofotometer.Bewaar vervolgens het gezuiverde DNA op min 20 graden Celsius in DE buffer. Om te beginnen site-directed mutagenesis met een 2-staps PCR, eerst gebruik maken van de wild-type DNA-sjabloon, dan is de primer paren twee, een en twee, twee, voor vijf primer mutaties, of primer paren twee, twee en twee, drie voor drie priment mutaties te verkrijgen PCR product twee. Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven.Gebruik dan de wild-type DNA-sjabloon en de PCR product twee als de primer, samen met primer, drie voor vijf priment mutatie, of primer twee, een voor drie priment mutatie, om PCR product drie te verkrijgen. Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven. Bewaar vervolgens het gezuiverde DNA bij min 20 graden Celsius in DE buffer.Om te beginnen site-direct mutagenesis met een 3-staps PCR, eerst gebruik maken van de wild-type DNA-sjabloon en primer paren drie, een en drie, twee om PCR product twee te verkrijgen. Gebruik de wild-type DNA-sjabloon en primerparen drie, drie en drie, vier, om PCR-product drie te verkrijgen. Gebruik de wild-type DNA-sjabloon en primer paren drie, drie en drie, vier, om PCR product drie te verkrijgen.Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven. Ten slotte gebruik maken van twee tot vijf nanogram pcr-producten twee en drie als de sjabloon samen met primer paren drie, een en drie, vier, om PCR product vier te verkrijgen. Valideer het PCR-product door gelelektroforese, zuiver het PCR-product en meet de concentratie zoals eerder beschreven.Bewaar het gezuiverde DNA bij min 20 graden Celsius in TE-buffer. In deze studie werden 2-staps en 3-stappen site-gerichte mutagenese gebruikt om RNA-interacties met betrekking tot posttrantieregatie van CsgD te onderzoeken. De wild-type CsgD werd PCR versterkt om PCR-product IA opleveren, en de wild-type mcaS werd PCR versterkt om PCR product IB opbrengst. Met behulp van een 3-staps PCR-strategie werden PCR-producten IIA en IIIA gesynthetiseerd in de eerste twee stappen, en IVA in de derde stap om mutaties in CsgD te introduceren.Ook werden in mcaS gratis site-gerichte mutaties geïntroduceerd om PCR-producten IIB, IIIB, in de eerste twee stappen en IVB in de derde stap op te leveren. Westerse vlekanalyse toonde aan dat, hoewel expressie van wild-type mcaS vertaling van wild-type CsgD voorkomt, mutaties in ofwel mcaS of CsgD de waargenomen repressie verlicht. Mutaties in zowel CsgD als mcaS verhinderen echter vertaling van CsgD.Met behulp van een 2-staps PCR-strategie werden PCR-producten IIC, IID, IIE, IIF en IIG in de eerste stap gesynthetiseerd, en PCR-producten IIIC, IIID, IIIE, IIIF en IIIG, in de tweede stap om mutaties in het gehele CsgD-DNA te introduceren. EMSA-resultaten van de HFQ-binding aan in vitro transcribed CsgD wild-type en mutant RNAs, gesynthetiseerd met behulp van PCR-producten IIIC, IIID, IIIE, IIIF en IIIG, toonden de verhoogde KD-waarden van de mutante allelen. Dit bewees dat HFQ minder efficiënt aan de mutanten kon binden.Verder heeft HFQ verschillende bindingsplaatsen op CsgD, wat blijkt uit de drie verschuivingen die worden waargenomen voor het wild-type RNA. Er worden echter slechts twee bindingsplaatsen waargenomen voor verschillende mutant-RNAs.However, only two binding sites are observed for different mutant RNAs. Zo identificeert de site-gerichte mutatiebenadering primaire en of secundaire structuren van het CsgD mRNA die belangrijk zijn voor volledige binding van HFQ.De methode voor site-directed mutagenesis hier beschreven is gebaseerd op PCR. Goede PCR-praktijken zijn daarom cruciaal voor de methode en kunnen optimalisatie vereisen om succesvol te zijn. Site-gerichte mutagenesis is alleen krachtig met alle drie de methoden zoals EMSA en Western Blotting.Andere methoden, bijvoorbeeld, omvatten verschillende structurele tests en sommige activiteit testen, en post vertaling wijziging studies.

site-directed-mutagenesis-for-vitro-vivo-experiments-exemplified-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Dit werk laat zien hoe een RNA / DNA hybride vorm op de chromosomale niveau en onthullen de overdracht van genetische informatie van RNA naar DNA genoom in gistcellen.

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Eiwitten die specifieke RNA opeenvolgingen binden spelen een kritieke rol in genexpressie. Gedetailleerde karakterisering van deze bandplaatsen is van cruciaal belang voor ons begrip van de genexpressie. Hier, wordt een-voor-stapmodus aanpak voor verzadiging mutagenese van eiwit-bandplaatsen in RNA beschreven. Deze aanpak geldt voor alle websites van de binding aan eiwitten in RNA.

Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteÃ¯ne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten

Het doel van dit manuscript is om een overzicht te presenteren voor de uitgebreide biochemische en functionele studies van de RING-type E3 ubiquitine ligases. Deze pijplijn met meerdere stappen, met gedetailleerde protocollen, valideert een enzymatische activiteit van de geteste eiwitten en laat zien hoe u de activiteit koppelt aan functie.

Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Leer plaats-geleide mutagenese voor moleculaire biologie met PCR-gebaseerde 2-staps en 3-staps protocollen. Deze methode onderzoekt RNA-RNA en RNA-eiwit interacties in Escherichia coli.

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Meer video's verkennen