Vergadering en karakterisering van biomoleculaire Memristors bestaande uit ionkanaal-doped lipide membranen

Ons protocol beschrijft hoe te monteren en elektrisch karakteriseren een peptide-doped biomembrane die nauw nabootst de samenstelling, structuur, en transport eigenschappen van biologische synapsen en die tunable geheugenweerstand vertoont. Deze techniek stelt gebruikers in staat om activiteitsafhankelijke, geheugenbestendigheid en kortdurende plasticiteit in gemanipuleerde systemen te beoordelen op tijdschalen en excitatieniveaus die relevant zijn voor biologische synapsen en ionenkanalen. Deze techniek biedt een kader voor het karakteriseren van biomimetische membranen die voltage-geactiveerde ionkanalen bevatten, waardoor het van toepassing is op karakterisering van een verscheidenheid aan cellulaire transportprocessen, waaronder die in neuronen.

Onze suggestie aan nieuwe onderzoekers is om eerst bedreven te worden in het voorbereiden van liposoom oplossingen en het monteren van een druppelinterface bilayer op draad-type elektroden. Het zien van het proces voor droplet dispensing en positionering op elektroden vereenvoudigt deze techniek voor bilayer vorming, waardoor het onmiddellijk toegankelijk is voor iedereen. Het aantonen van deze procedure zal Dr.Joseph Najem zijn, een postdoc uit mijn laboratorium.

Om te beginnen, bereid de alamethicine voorraad oplossing in de microcentrifuge buis door het oplossen van de alamethicine peptiden poeder in ethanol tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 milligram per milliliter. Vortex de buis kort goed te mengen, en bewaar de voorraad oplossing in een min 20 graden Celsius vriezer. Voeg in een 1,5 milliliter Safe-Lock-buis een microliter alamethicinevoorraadoplossing toe aan 99 microliters van oplossing A om een uiteindelijke alamethicineconcentratie van 13 micromolar in de liposoomsususpensie te bereiken.

Vortex om goed te mengen. De resulterende peptide liposoom oplossing is oplossing B.Mix 117 microliters van oplossing A met 10 microliters van oplossing B om een definitieve alamethicine concentratie van een micromoer te bereiken, en vervolgens vortex goed te mengen. Raadpleeg de resulterende oplossing als C.Store de oplossingen B en C op vier graden Celsius.

Plaats een één millimeter dikke 25 keer 75 millimeter glaskant op het stadium van een omgekeerde microscoop. Doe een paar druppels hexadecane olie op het midden van de glazen glijbaan en plaats het oliereservoir direct op de olie op de glazen glijbaan. Vul het oliereservoir volledig met hexadecane olie.

Zorg ervoor dat het reservoir boven de objectieflens is geplaatst. Sluit vervolgens de elektrodehouder aan op het hoofdstadium van een huidige versterker die op een micromanipulator is gemonteerd. De micromanipulator minimaliseert de lengte van de elektrode en elektrisch geluid.

Monteer vervolgens de glazen micropipethouder met de tweede zilverzilverchloridedraad op een andere micromanipulator. Met behulp van de micromanipulatoren, plaats de elektroden zodanig dat de agarose-gecoate uiteinden van de zilver-zilver-chloride draden volledig ondergedompeld in het oliereservoir op een soortgelijk verticaal vlak. Lijn de twee elektroden uit en scheid ze met een paar millimeter.

Om de lipide bilayer te vormen, beweegt u de elektroden verticaal in de oliefase. Gebruik de micropipet om 200 nanoliter lipideoplossing A op elk van de draden te deponeren. Wacht drie tot vijf minuten om spontane lipide monolayer montage te laten optreden op de waterolie-interface.

Druppels kunnen verzakken als de omringende olie voldoende dicht is. Daarna, lager de elektroden opnieuw onder te dompelen totdat de uiteinden van beide elektroden nauwelijks raken de bodem van het oliereservoir. Om vervolgens de bilayer te vormen, beweegt u de elektroden horizontaal om de druppels in contact te brengen.

Om de beknelde, hysteretische, stroom-voltage relatie te verkrijgen, gebruik een functie generator om driehoekige of sinusoïdale spanning golfvorm toe te passen op een alamethicine-vrije lipide membraan geassembleerd met druppels van oplossing A.Record de geïnduceerde stroomrespons over meerdere frequenties. Om de grootte van de interfaciale lipide bilayer vast te leggen, meet u de diameter van het lipidemembraan op de computer of registreert u de piek-tot-piekstroomamplitude als gevolg van de driehoekige golf van 10 hertz, 10 millivolt om het gebied van het membraan te berekenen. Haal de draden uit de oliefase om de druppels die geen alamethicine bevatten te verwijderen.

Voeg nieuwe waterige druppels toe met oplossing C en vorm een lipide bilayer. Op basis van de vierkante golf stroom amplitude, gebruik maken van de micromanipulatoren om het contact tussen druppels aan te passen, zodanig dat de bilayer heeft een vergelijkbaar gebied als de eerder gevormde. Breng vervolgens een spanningsgolfvorm van 10 hertz en 10 millivolt aan en neem de geïnduceerde huidige respons op zoals eerder.

Om pulsexperimenten uit te voeren met behulp van een aangepaste programmeersoftware en analoge spanningsbron, genereert u spanningspulsen met specifieke hoge en lage amplitudes op tijd en uit. Nota van de stroom in reactie op toegepaste pulsen. De plot van de stroom versus spanning toont de niet-nul stroom reactie bij toepassing van een spanning bias op een alamethicine-vrije lipide bilayer.

Voeg 0,017 hertz toe, een frequentie waarbij de impedantie wordt gedomineerd door membraanweerstand. Een lage ohmische stroomrespons wordt getoond voor het sterk isolerende membraan. De plot van een lipide bilayer gevormd tussen twee druppels met alamethicine peptiden toont exponentieel stijgende stromingen bij spanningen hoger dan de invoegdrempel van 100 millivolt.

Bij hoge spanning, alamethicine peptiden woonachtig aan het oppervlak van de lipide bilayer invoegen in het membraan en aggregaat te vormen geleidende poriën. De symmetrische stroomreacties bij beide polariteiten is te wijten aan het inbrengen en aggregatie van afzonderlijke populaties peptiden van tegenovergestelde zijden van het membraan. De capacitieve stroom moet worden afgetrokken van de totale stroom om alleen de memristive, geknepen hysterese stroomspanningsrespons te verkrijgen.

De biomoleculaire memristor respons op de daaropvolgende spanning pulsen met een toename van de geleiding tijdens de op tijd, ondanks met tussenpozen het herstel van een isolerende toestand tijdens elke vrije tijd. Zowel de huidige stimulus als eerdere stimuli dragen bij aan de huidige toename. Samenhangende monolagen op beide druppels moeten zich vormen voordat ze samen komen om de bilayer te vormen.

Als de druppels te vroeg bij elkaar worden gebracht, smelten ze samen en wordt er geen bilayer gevormd. We zijn nu het ontwerpen en fabriceren van, microfluïde basis neurale netwerken bestaande uit solid state neuronen verbonden door membraan-gebaseerde synapsen ondersteund door netwerk assimilatie optimalisatie van high-performance supercomputers bij ORNL. Deze memristors zijn de eersten met de samenstelling, structuur, schakelmechanisme en ionentransport van biologische synapsen.

Ze bieden dus een biomoleculaire basis ingericht toe te voegen hersenen-achtige computing en geheugen.