Name: Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer cel-gebaseerde assay-detectie van anti-AQP4 IgG in menselijk serum voor diagnose van neuromyelitis optica spectrumstoornissen. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en specificiteit dan andere detectiemethoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar voor de steun van subsidies uit de National Science Foundation of China (nr. 31600820), de gezondheid en gezinsplanning Commissie van provincie Jilin (nr. 2016Q036), en de wetenschap en technologie Planning Project van provincie Jilin (nr. 20180520110JH).

Deze procedure werd goedgekeurd door de ethische commissie van de eerste ziekenhuis van Jilin Universiteit en werd uitgevoerd op ongeveer 1.500 onderwerpen.
1. de patiënt inschrijving en bloed monster collectie
<ol><li>De laboratorium-detectie van serum die anti-AQP4 IgG aan patiënten van de kliniek met de belangrijkste klachten en symptomen onderstaande van toepassing. Verricht lichamelijke onderzoeken ook. Optische neuritis: patiënten lijden met visuele tekorten, zoals verlies van visual velden en vermindering van de gezichtsscherpte. Acute myelitis: patiënten kunnen presenteren met verlamming, zintuiglijke tekorten en autonome dysfunctie. Gebied postrema syndroom: patiënten symptomen van onverklaarbare hik, misselijkheid of braken kunnen hebben. Acute hersenstam syndroom: hersenstam letsels kunnen leiden tot verschillende symptomen en lichamelijke tekens afhankelijk van de locatie van de laesies. Symptomatische narcolepsie of acuut diencephalic klinisch syndroom met NMOSD-typische diencephalic MRI laesies. Symptomatische cerebrale syndroom met NMOSD-typische laesies van de hersenen. Opmerking: Volgens de internationale consensus diagnostische criteria voor NMOSD5, een diagnose van NMOSD kan worden gemaakt indien de patiënt serum anti-AQP4 IgG-positief en heeft ten minste één van de core klinische kenmerken hierboven vermeld. We raden echter niet testen van anti-AQP4 IgG bij patiënten met optische neuritis alleen.</li>
	<li>
Bloed monster collectie Opmerking: patiënten hoeven niet te worden vasten.<ol>
<li>2-3 mL veneuze bloed trekken in een tube 4 mL vacuüm bloed collectie.</li>
		<li>Het toestaan van het serum stollen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Opmerking: Langdurige stolling kan verhogen serum als gevolg van het laten weglekken van bloedplaatjes.</li>
		<li>Centrifugeer bij 2100 x g gedurende 5 min. zorgvuldig overbrengen in het serum een nieuwe buis.</li>
		<li>Analyseren van de serum onmiddellijk of aliquot en bewaren bij -20 of -80 ° C. Opmerking: Opslag bij-20 ° C is voor opslag van maanden, terwijl-80 ° C voor de opslag van het jaar is.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anti-AQP4 antistofdetectie
Let op: Patiënt monsters en gebruikte kit reagentia moeten besmettelijke materialen te worden beschouwd. Natrium azide-bevattende reagentia in de kit zijn giftig. Een stroomschema van het protocol wordt gegeven in Figuur 1.
<ol><li>
Voorbereiding
	<ol>
<li>Breng de kit aan RT vóór gebruik. Opmerking: Winkel de kit bij 2-8 ° C.</li>
		<li>Bereiden van ten minste 200 mL PBS was buffer met 0,2% tween-20. Giet 100 mL was buffer in een bekerglas van 500 mL.</li>
		<li>Verdund serum monsters 10 x met was buffer. De positieve en negatieve controles volgens de instructies van de distributeur voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Monster incubatie
	<ol>
<li>Voeg 30 µL van het vooraf verdunde monsters, positieve controle of negatieve controle op de velden van de reactie van de reagens lade (Figuur 2). Opmerking: Vermijd luchtbellen.</li>
		<li>Verwijder de beschermende cover op de biochip dia's. Opmerking: Raak niet de biochips om te voorkomen dat de onthechting en besmetting van vaste cellen. Houd de dia side-by-side voordat het verwijderen van de afdekking.</li>
		<li>De biochip dia toepassen in het reagens lade (Figuur 2). Start een incubatieperiode van 30 min bij RT. Opmerking: Elk monster moet een individuele druppel verbonden met de bijbehorende biochip zonder mengen met andere druppels.</li>
		<li>Spoel zachtjes de biochip dia eens met was buffer. Dompel de biochip dia in de 500 mL-bekerglas gevuld met 100 mL was buffer voor ten minste 5 min. plaats het bekerglas op een shaker indien mogelijk.</li>
		<li>Haal de biochip dia uit de buffer wassen. Zorgvuldig veeg weg de residuele was buffer buiten de reactie velden met een papieren handdoek. Bloot de biochip dia in open lucht voor 1-2 min te verdampen de residuele was buffer op het reactie-veld. Opmerking: Niet de reactie velden uitdrogen. Raak niet de biochips met papieren handdoek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubatie van secundair antilichaam
	<ol>
<li>Bereid de secundair antilichaam oplossing volgens de instructies van de distributeur.</li>
		<li>25 µL van fluorescerende secundair antilichaam aan de reactie velden voor een schone reagens tray toevoegen.</li>
		<li>Toepassing de biochip dia aan het Dienblad van de reagens geladen met secundair antilichaam. Incubeer gedurende 30 min op RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>De gebruikte was buffer uitstorten en voeg 100 mL vers was buffer af in het bekerglas. Herhaal het wassen zoals beschreven in stappen 2.2.4 en 2.2.5 gelden.</li>
		<li>Voeg voorzichtig insluiten medium naar de velden van de reactie op een biochip dia (1 druppel per reactie veld). Verzegel de biochip dia met één stuk cover glas. Vermijd luchtbellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fluorescentie detectie
	<ol>
<li>De TL-lamp van Microscoop en pre warmte voor 15 min. Kies een 488 nm-filter inschakelen.</li>
		<li>Open foto software. Neem foto's van zowel transfected en untransfected gebieden van alle reactie velden met verschillende vergrotingen. Eerst neem een foto met 4 x vergroting voor een overzicht, waarna meer foto's nemen met 10 x en 20 x vergrotingen. Opmerking: Het gedetailleerd protocol wordt weergegeven in tabel 1. Interpretatie van de resultaten wordt besproken in de sectie representatieve resultaten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. diagnose van patiënten
<ol><li>Indien de patiënt serum anti-AQP4 IgG-positief en toont ten minste één kern klinische kenmerk van NMOSD (zie sectie discussie), de patiënt met NMSOD5te diagnosticeren. Echter, indien de patiënt anti-AQP4 IgG-negatief, een diagnose van NMOSD niet mogen worden uitgesloten.</li>
</ol>

<ol><li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22in+vitro.Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).</li>
<li>Sato, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+between+MOG+antibody-positive+and+AQP4+antibody-positive+NMO+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders.</a> Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).</li>
<li>Wingerchuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+consensus+diagnostic+criteria+for+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).</li>
<li>Ruiz-Gaviria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+aquaporin+4+antibody+detection+tests+in+patients+with+neuromyelitis+optica%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).</li>
<li>Waters, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicentre+comparison+of+a+diagnostic+assay%3A+aquaporin-4+antibodies+in+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).</li>
<li>Fryer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP4+autoantibody+assay+performance+in+clinical+laboratory+service%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+in+neuromyelitis+optica%3A+re-testing+study+in+a+large+population+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China.</a> The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).</li>
<li>Pisani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoantibodies+in+Neuromyelitis+Optica%3A+AQP4+isoform-dependent+sensitivity+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity.</a> PloS One. 8 (11), 79185(2013).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+testing%3A+direct+comparison+of+M1-AQP4-DNA-transfected+cells+with+leaky+scanning+versus+M23-AQP4-DNA-transfected+cells+as+antigenic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate.</a> Journal of Neuroinflammation. 11, 129(2014).</li>
<li>Juryńczyk, M., Craner, M., Palace, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+CNS+inflammatory+diseases%3A+differentiating+features+of+NMO+and+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Features+of+Patients+with+Multiple+Sclerosis+and+Neuromyelitis+Optica+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical Features of Patients with Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders.</a> Chinese Medical Journal. 129 (17), 2079-2084 (2016).</li>
<li>Majed, M., Fryer, J. P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+testing+AQP4-IgG+in+CSF%3A+Guidance+for+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 3 (3), 231(2016).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+antibodies+to+aquaporin-4+in+neuromyelitis+optica+and+related+disorders%3A+frequency%2C+origin%2C+and+diagnostic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance.</a> Journal of Neuroinflammation. 7, 52(2010).</li>
<li>Asgari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+leptomeningeal+blood+barrier+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (4), 343(2017).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+an+international+update%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+encephalomyelitis%3A+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134(2018).</li>
<li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody+disease%3A+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li>
<li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody-positive%2C+benign%2C+unilateral%2C+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322(2017).</li>
<li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab%3A+A+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317(2016).</li>
<li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+A+multicenter+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li>
<li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li>
<li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij hebben een breed toegankelijke methode voor het detecteren van anti-AQP4 IgG in menselijk serum beschreven. Anti-AQP4 IgG is nauw verwant aan NMOSD, en tot vaststelling van een betrouwbare anti-AQP4 IgG detectiemethode is cruciaal voor de klinische diagnose van NMOSD. Ten eerste, anti-AQP4 IgG is specifiek voor de NMOSD. Multiple sclerose is ook een immuun-gemedieerde ziekte van het centrale zenuwstelsel en deelt veel overeenkomsten met NMOSD12. Anti-AQP4 IgG is echter alleen positieve in NMOS...

Serum AQP4 IgG is een kern van diagnostische biomerker voor neuromyelitis optica spectrum stoornissen (NMOSD)1. De cel-gebaseerde bepaling (CBA) is een veel gebruikte anti-AQP4 IgG detectiemethode met hoge gevoeligheid en specificiteit. Hier, wordt een gedetailleerd protocol voor CBA ingevoerd.
AQP4, een water kanaal eiwit, heeft zes membraan-spanning eenheden en twee spiraalvormige domeinen rondom een waterige poriën2. Anti-AQP4 IgG is betrokken bij de pathogenese van NMOSD door middel van binding aan haar doelstelling van AQP4, die vooral op de endfeet van astrocyten3 ligt. Het is aangetoond dat anti-AQP4 IgG positief in ongeveer tweederde van de NMOSD patiënten4is. In de meest recente internationale diagnostische criteria voor NMOSD, anti-AQP4 IgG wordt beschouwd als een kern diagnostische biomerker5. Het is in dit verband van cruciaal belang om een betrouwbaar protocol voor het detecteren van menselijk serum anti-AQP4 IgG en vergemakkelijken klinische diagnose van NMOSD.
Momenteel zijn de verschillende anti-AQP4 IgG detectiemethoden beschikbaar, zoals CBA, weefsel gebaseerde assay, enzym-verbonden immunosorbent analyse en stroom cytometry6,7. CBA maakt gebruik van EU90 cellen, die zijn transfected met menselijke AQP4, om vast te leggen van de anti-AQP4 IgG. De vastgelegde anti-AQP4-IgG is ontdekt door fluorescente secundaire antilichamen en vervolgens gevisualiseerd door microscopie. Het vergaren van bewijsmateriaal blijkt dat CBA gevoeliger en specifieke dan andere anti-AQP4 IgG detectie methoden6,7. Volgens een meta-analyse, de gevoeligheid en specificiteit van CBA bleken te zijn 76% en 99%, die hoger dan het weefsel gebaseerde waren en enzyme-linked immunosorbent testen6. Bovendien was een multicenter vergelijking van diagnostische tests van anti-AQP4 IgG transiënte7. Een totaal van 193 studie onderwerpen uit 15 Europese diagnostische centra werden ingeschreven7. Vier verschillende methoden werden gebruikt om het detecteren van serum anti-AQP4 IgG7. Het bleek dat CBA gevoeliger en specifieke dan de andere methoden7 was. Als AQP4 wordt uitgedrukt in twee grote isoforms (AQP4-M1 en AQP4-M23), is anti-AQP4 IgG vangen cel met AQP4-M1 of AQP4-M23 transfected. Welk type van capture cel is echter beter blijft controversieel. Een onderzoek heeft steun verleend aan AQP4-M1 gebaseerde CBA8, terwijl anderen hebben aangegeven dat AQP4-M23 gebaseerd CBA is beter7,9,10. AQP4 M23-gebaseerde CBA kan echter vals-positieve resultaten als gevolg van aspecifieke IgG bindende8opleveren. Jarius et al.. 11 gemeld dat er geen significant verschil in anti-AQP4 IgG opsporingstarieven tussen AQP4-M1 en AQP4 M23-gebaseerde CBAs was.
In samenvatting, serum anti-AQP4 IgG is een kern biomerker voor NMOSD. CBA heeft een hogere gevoeligheid dan andere anti-AQP4 IgG detectiemethoden en specificiteit. Het blijft controversieel of AQP4-M1 - of AQP4-M23-gebaseerde CBA beter is. In dit artikel wordt wordt een gedetailleerd protocol voor AQP4-M1 gebaseerde CBA beschreven, die u op de klinische diagnose en onderzoek van NMOSD toepassen kunt.

<table><tbody><tr><td>Anti-aquaporine-4 IIFT</td><td>Euroimmun</td><td>FA 1128-2005-50</td><td>Bevat biochip-slides bedekt met AQP4-M1 getransfecteerde en niet-getransfecteerde EU 90 cellen, fluoresceïne-gelabeld anti-human IgG, anti-AQP4 antilichaam als positieve controle, antilichaam negatief monster, zout voor PBS pH 7.2, Tween 20 en inbeddingsmedium.&nbsp;</td></tr><tr><td>CellSens Dimension</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td><td>fotografiesoftware</td></tr><tr><td>Gel &amp; stolselactivatorbuis</td><td>Improve medical</td><td>623040202</td><td>Van een lokale Chinese onderneming</td></tr></tbody></table>

menselijk serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin g detectie van cel-gebaseerde assay

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobuline G (IgG) is de kern van diagnostische biomerker voor neuromyelitis optica spectrum stoornissen (NMOSD). De cel-gebaseerde bepaling (CBA) is een veel gebruikte methode om anti-AQP4 IgG detecteren in menselijk serum met hoge gevoeligheid en specificiteit. Kort, serum anti-AQP4 IgG is gevangen genomen door AQP4-transfected cellen die gefixeerd op de biochip wordt gedetecteerd door een fluoresceïne-gelabeld secundair antilichaam. Fluorescentie microscopie is gebruikt om de fluorescentie te visualiseren, en de intensiteit van de fluorescentie is beoordeeld door ten minste twee ervaren clinici. Een definitieve diagnose van NMOSD kan worden gemaakt op basis van de combinatie van anti-AQP4 IgG detectie resultaten, Klinische manifestaties en neuroradiologische bevindingen. Volgens eerdere studies, CBA is gevoeliger en specifieke dan andere anti-AQP4 IgG detectiemethoden en het kan worden toegepast op zowel de klinische diagnose en de studies van NMOSD. De methode kent beperkingen; bijvoorbeeld, ontbreekt een internationale schaal te evalueren van serum anti-AQP4 IgG titers nog. Hier, wordt een gedetailleerd protocol voor menselijk serum anti-AQP4 IgG detectie met behulp van CBA beschreven.

Gebruik de procedure hier, is specifieke anti-AQP4 IgG in het serum aantoonbaar. Tijdens de procedure werden vooraf verdunde monsters, een positieve controle en een negatieve controle toegevoegd aan de reactie velden, waarin transfected en untransfected gebieden (Figuur 2). Fluorescentie van de negatieve controle op een transfected gebied aangegeven vooral de aspecifieke binding van secundair antilichaam transfected cellen op biochips (Fi...

Cel-gebaseerde bepaling is een veel gebruikte methode om te detecteren serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Deze methode kan worden toegepast op de klinische diagnose en wetenschappelijk onderzoek van neuromyelitis optisch spectrum stoornissen.

Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Volgens de recente internationale diagnostische criteria voor neuromyelitis optica spectrum stoornissen, anti-AQP4 IgG wordt beschouwd als een kern diagnostische biomarker. Anti-AQP4 IgG detectie door celgebaseerde test kan de klinische diagnose vergemakkelijken. De op cellen gebaseerde test is dus gevoeliger en specifieker dan andere detectiemethoden.En het kan worden toegepast op zowel klinische diagnose als de wetenschappelijke studies. Breng eerst de serummonsters van de patiënt, de biochipdia, het PBS-poeder en de TWEEN 20 van de gekoelde celgebaseerde testkit naar de kamertemperatuur. Bereid vervolgens meer dan 200 milliliter PBS-wasbuffer voor met 0,2 procent TWEEN 20 voor elke biochipdia.Gebruik de wasbuffer om 10-voudige seriële verdunningen van elk serummonster te maken. Bereid positieve en negatieve controles voor volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 30 microliter 10-voudige seriële verdunningen van het monster, de positieve controle en de negatieve controle toe aan vijf afzonderlijke reactievelden op de reagenslade.Houd de biochipg door de dia's en verwijder de beschermhoes zonder de reactievelden aan te raken. Leg de schuif bovenop de reagenslade en broed de installatie 30 minuten op kamertemperatuur uit. Spoel de biochipguis voorzichtig af met de wasbuffer.Dan onderdompelen in een 500 milliliter bekerglas gevuld met 100 milliliter van de wasbuffer, en laat het op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Haal de biochipg van de wasbuffer eruit. Gebruik een papieren handdoek om de resterende buffer van buiten de reactievelden zorgvuldig weg te vegen.Laat de glijbaan één tot twee minuten luchtdrogen. Voeg in de donkere kamer 25 microliter fluorescerend secundair antilichaam toe aan elk reactieveld van de reagenslade. Leg de schuif bovenop de reagenslade en broed de installatie 30 minuten op kamertemperatuur uit.Spoel de biochipguis voorzichtig af met de wasbuffer. Dompel het vervolgens onder in een bekerglas van 500 milliliter gevuld met 100 milliliter van de verse wasbuffer en laat het 10 minuten op kamertemperatuur. Haal de biochipg van de wasbuffer eruit.Gebruik een papieren handdoek om de resterende buffer van buiten de reactievelden zorgvuldig weg te vegen. Laat de glijbaan één tot twee minuten luchtdrogen. Voeg voorzichtig een druppel van het inbeddingsmedium toe aan elk reactieveld op de biochipdia.Tot slot, verzegel de biochip glijbaan met een afdekglas terwijl het vermijden van luchtbellen en ga verder met beeldvorming. De zwakke fluorescentieintensiteit van de negatieve controle die in het besmette gebied wordt waargenomen, duidt op de niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam. De vergelijking tussen de gedetecteerde fluorescentieintensiteiten van de positieve controle in de geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde gebieden geeft de specifieke binding aan van de anti-AQP4 IgG aan AQP4M1 in de geïnfecteerde cellen.Het anti-AQP4 IgG negatieve serum vertoont bindende patronen die vergelijkbaar zijn met de negatieve controle in zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde gebieden. Het positieve serum vertoont bindende patronen die vergelijkbaar zijn met de positieve controle in zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde gebieden. Monsters worden beschouwd als anti-AQP4 IgG positief wanneer fluorescentie heterogeen toeneemt in het besmette gebied.De intensiteit van fluorescentie is gecorreleerd aan anti-AQP4 IgG titer in het serum. Monsters worden waarschijnlijk als positief beschouwd wanneer slechts een klein aantal cellen in het transfected gebied detecteerbare fluorescentieintensiteiten vertoont. Een monster moet als anti-AQP4 IgG-negatief worden beschouwd wanneer de intensiteit ervan in het besmette gebied slechts homogeen sterker is dan in het niet-besmette gebied.Het vermijden van luchtbellen is van vitaal belang en moeilijk. Om luchtbellen te elimineren, gebruik je eerst een pipet om luchtbellen in druppels te voorkomen. Ten tweede, terwijl het toepassen van de biochip schuif op de reagens lade, eerst laat een kant van de dia raken de druppels, en vervolgens het niveau van de dia langzaam.Raak bovendien de reactievelden tijdens het experiment niet aan.

human-serum-anti-aquaporin-4-immunoglobulin-g-detection-cell-based

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the hydrophobic interaction liquid chromatography-based characterization of antibody-drug conjugates. Using a butyl ligand-based chromatography column, the antibody-drug conjugates are characterized via hydrophobic interactions with the ligand.

Butyl-Dependant Hydrophobic Interaction Liquid Chromatography: A Technique to Characterize Antibody-Drug Conjugates Based on Hydrophobic Interactions

This video describes an immunoassay technique using fluorescent magnetic beads or microspheres coupled with different antigens to simultaneously detect various antibody isotypes in a serum sample. The assay is helpful in understanding seroconversion during an infection or post-vaccination.

Multianalyte Immunobead Assay: A Flow-Based Immunoassay Technique for Concurrent Detection of Multiple Antibody Subtypes in Human Serum Sample

The video demonstrates a cell-based assay for detecting anti-aquaporin-4 immunoglobulin G using a biochip containing untransfected cells and transfected cells expressing aquaporin-4. This method has applications in diagnosing neuromyelitis optica spectrum disorders, confirmed by strong green fluorescence on the biochip.

An Assay to Detect Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G

The video demonstrates a paper-based immunoassay, involving amine-functionalized cellulose discs cross-linked with glutaraldehyde. Covalent immobilization of IgG-Fc-specific capture antibodies, followed by the introduction of immunoglobulin G and horseradish peroxidase-conjugated detection antibodies, results in a color change confirming the presence of immunoglobulin G.

A Paper-Based Immunoassay for the Detection of Immunoglobulin G

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.

Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen

Dit artikel bevat een beschrijving van een eenvoudige eiwit microarray methode voor profilering humorale immuunreacties aan een 7-plex panel van sterk gezuiverd Clostridium difficile antigenen in menselijke sera. Het protocol kan worden uitgebreid voor de bepaling van specifieke antilichaam reacties in preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline.

Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie

Hier presenteren we een cel-gebaseerde stroom cytometry methode voor het detecteren van neutraliserende antilichamen of andere factoren die met de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën in een menselijke matrix, zoals cerebrale spinal fluid (CSF) of menselijk serum interfereren.

Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

We presenteren een protocol voor het gebruik van een proteïne-Microarray die is geconstrueerd door het afdrukken van influenza-antigenen op nitrocellulose gecoate dia's om gelijktijdig sonde serum te gebruiken voor meervoudige antilichaam isotypes tegen meer dan 250 antigenen van verschillende virusstammen, dus het meten van de breedte van serum antilichamen over virus subtypen mogelijk te maken.

Gebruik van een influenza antigeen Microarray voor het meten van de breedte van serum antilichamen over de virus subtypen

Leer cel-gebaseerde assay-detectie van anti-AQP4 IgG in menselijk serum voor diagnose van neuromyelitis optica spectrumstoornissen. Deze methode biedt hogere gevoeligheid en specificiteit dan andere detectiemethoden.

Menselijk Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G detectie van cel-gebaseerde Assay

Meer video's verkennen