Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Technieken die de bacterielast en een neutrofiele tegelijkertijd monitoren, kunnen inzicht geven in de mechanismen van Staph aureus persistentie en de werkzaamheid van behandelingsstrategieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat meerdere parameters in de lengterichting kunnen worden gemeten in een live host gedurende de duur van de infectie. Het is van cruciaal belang om te laten zien waar de wond op een muis dorsum moet worden gezet, hoe de huid moet worden verwijderd en hoe de wond met Staph aureus moet worden ineenten.

Begin met het ontdooien van de bioluminescentie Staph aureus stam van belang van negatieve 80 graden Celsius opslag op ijs. Voordat de cultuur op een 5% runderbloed agar plaat. Voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend, breng drie tot vier individuele kolonies van de Staph aureus plaat in de tryptische sojabouillon, of TSB. Aangevuld met 10 microgram per milliliter chlooramfenicol voor een nachtelijke schudden incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, verdun 120 microliters van cultuur monster in zes milliliter TSB.

Met 10 microgram per milliliter chlooramfenicol, voor een incubatie van twee uur bij 37 graden Celsius en 200 rotaties per minuut. Wanneer de optische dichtheid op 600 nanometer 0,5 bereikt, breng dan drie milliliter bacteriële suspensie over in 10 milliliter ijskoud DPBS. Na het zorgvuldig decanteren van de supernatant, voeg extra gekoelde DPBS aan de pellet, en vortex de opnieuw opgehangen bacteriën grondig.

Na een tweede centrifugatie, opnieuw opschorten de bacteriële pellet in 1,5 milliliter PBS op ijs. Om de concentratie van bacteriën te verifiëren, verdunt u in de serie 100 microliter van de bacteriële suspensie met een factor 1 x 10 tot de 4e en 1 x 10 tot de 5e in verse PBS. En plaat 20 microliter van elke verdunning op individuele agar platen.

Tel na een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius het aantal kolonievormende eenheden door middel van brutoonderzoek om de bacteriële concentratie van de vorige dag te berekenen. Voor excisional huid verwonding van de ontvangende dieren, bevestigen een gebrek aan reactie op teen knijpen, voordat scheren een een door twee inch sectie op de achterkant van de muis. Veeg voorzichtig af om verdwaalde haren te verwijderen.

En desinfecteren de blootgestelde huid, met sequentiële 10%povidone jodium, en 70% ethanol doordrenkte gaas toepassingen. Naar buiten bewegen vanuit het midden van het chirurgische gebied, in een spiraalpatroon. Na het toestaan van de huid te drogen voor ongeveer een minuut, stevig druk op een steriele zes millimeter punch biopsie in het midden van de voorbereide chirurgische gebied.

Draai de punch biopsie om een cirkelvormige omtrek op de huid te creëren, die volledig snijdt door het huidweefsel, en ten minste een deel van de omtrek. Zorg ervoor dat u niet in de onderliggende fascia of weefsel snijdt. Gebruik vervolgens steriele schaar, en tangen, te snijden door de opperhuid en dermis, volgens de cirkelvormige patroon bedrukt door de punch biopsie.

Voor Staph aureus inenting, vul een 28-gauge insulinespuit met 50 microliter van de voorbereide bioluminescente bacteriële inentingsmiddelen. En gebruik een vinger om de dermis van het gewonde dier naar de kant te trekken. Houd de spuit bijna parallel aan het weefsel, steek de spuit langzaam in het weefsel totdat een plotselinge afname van de weerstand wordt gevoeld.

Wat wijst op piercing van de fascia. Met de naald geplaatst in het midden van de wond, langzaam leveren het gehele volume van de entmateriaal. Bevestig dat de entmateriaal een bel vormt in het midden van de wond, met minimale lekkage of dispersie.

En verwijder de spuit langzaam van het dier. Breng het dier dan terug naar zijn kooi met warmte en monitoring tot volledig herstel. Na het verwonden en infectie, en dagelijks tijdens het experiment, plaats de verdoofde muis in een bioluminescente en florescentie imager, met de wond zo plat mogelijk.

Selecteer in de imager-software luminescentie en fotografeer als beeldmodi. De belichtingstijd moet worden ingesteld op één minuut bij kleine binning, F/Stop 1 voor luminescentie, F/Stop 8 voor foto en open voor het emissiefilter. Klik vervolgens op acquire om de afbeelding op te nemen.

Voor in vivo fluorescentie beeldvorming, selecteer fluorescentie, en foto, als de beeldvorming modi. De belichtingstijd moet worden ingesteld op een seconde bij kleine binning, F /Stop 1 voor fluorescentie, F/Stop 8 voor foto, en Opwinding en emissiegolflengten van 465 meer dan 30 nanometer, en 520 meer dan 20 nanometer, met een hoge lampintensiteit, respectievelijk. Klik vervolgens op acquire om de afbeelding op te nemen.

Na het verkrijgen van beide sets van beelden, terug te keren het dier naar zijn kooi, met monitoring, tot volledig herstel. Open voor beeldanalyse de te kwantificeren afbeelding in een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse en plaats het standaard cirkelgebied dat van belang is over het gehele wondgebied, inclusief de omringende huid. Klik op het interessegebied meten en nota van de waarden voor de gemiddelde flux voor de wond, zodat de gemiddelde flux van elk signaal kan worden uitgezet ten opzichte van de tijd.

Om de wondgenezing te meten, past u een cirkelvormig gebied van belang over de wondrand en meet u het gebied van de wond in vierkante centimeters, zodat de fractionele verandering van de basislijn versus de tijd kan worden uitgezet. In dit representatieve experiment, voorwaardelijke EGFP expressie myeloïde differentiatie primaire respons 88, Of MyD88 knock-out muizen, toonde een grotere gevoeligheid voor Staph aureus inenting, dan niet-voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren. Met een 80%-letaliteit waargenomen tijdens de eerste acht dagen van infectie.

Beide stammen van muizen verloren ongeveer 5% van hun lichaamsgewicht onmiddellijk na infectie. Echter, de voorwaardelijke EGFP uitdrukken muizen herstelden hun oorspronkelijke gewichten door dag twee. Terwijl de MyD88 muizen dat niet deden.

Wondsluiting in aanwezigheid van Staph aureus infectie was niet verschillend tussen de twee stammen. Echter, steriel gewonde MyD88 knock-out muizen, had een aanzienlijk defect in wondgenezing, in vergelijking met voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren. De hele beeldvorming van dieren toonde een hogere bacteriële belasting, zoals blijkt uit een verhoogd bioluminescent signaal in de wonden van MyD88 knock-outdieren, in vergelijking met voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren.

Een daling van 40% in de initiële neutrofiele handel tot niet-geïnfecteerde wonden van MyD88 knock-out dieren, werd ook waargenomen in vergelijking met voorwaardelijke EGFP uitdrukken van dieren. Toen onmiddellijk na het verwonden 1 x 10 tot de 7e kolonievormende eenheden van Staph aureus werden geïntroduceerd, werd de neutrofielehandel aanzienlijk verzwakt bij knock-outdieren in vergelijking met voorwaardelijke EGFP-uitdrukkende dieren. Voordat u de bacteriën uitdeelt, moet u ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de spuit zitten en dat de locatie van de naald correct in het midden van de wond is geplaatst.

Dierlijk weefsel kan worden geoogst op het eindpunt om de expressie van eiwitten van belang en bacteriële verspreiding van de wond te meten. Staph aureus is besmettelijk voor de mens. Als zodanig moeten persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen bij het hanteren van de bacteriën, en voorzichtigheid moet worden betracht bij het hanteren van een spuit die de ziekteverwekker bevat.

Deze techniek heeft geholpen bij het verkennen van het gebruik van biologische behandelingen voor Staph aureus infecties die de gastheren aangeboren immuunrespons tegen infectie te verbeteren.