Chemische isolatie, kwantificering en scheiding van lipiden van de huid van reptielen

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om bioactieve signaalmoleculen te isoleren die door reptielen in chemische communicatie worden gebruikt. Evenals de scheiding en zuivering van deze verbindingen voor extra testen, of zelfs identificatie. Met behulp van deze methode, onderzoekers kunnen verkrijgen van een bron van chemische signalen en vervolgens extraheren ze voor hun kwantificering of bioassay gebruik in isolatie.

Het demonstreren van de procedure vandaag zal Holly Rucker zijn, een honorsthesis student uit mijn laboratorium. Begin met het plaatsen van vijf centimeter vierkante stukken in een afsluitbare glazen container met een hexaan compatibel deksel en het toevoegen van genoeg hexaan aan de container om de schuur huid stukken volledig onder te dompelen voordat het verzegelen van de container. De volgende dag, gebruik maken van schone metalen tangen om de schuur stukken te verwijderen, schudden van de stukken als ze worden gevangen om eventuele resterende hexaan te behouden in de container.

Om de geëxtraheerde lipide massa te bepalen breng het extract naar een voorbeende, ronde bodemkolf en zet de vacuümbron aan op de roterende verdamper om ervoor te zorgen dat de vacuümdruk voldoende is om de kolf tegen de hals van de condensor te houden. Open de ventilatieopening aan het einde van de condensor, schuif de kolf op de hals van de condensor en sluit de ventilatieopening om het systeem te verzegelen. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de kolf niet los kan koppelen van de condensor wanneer de kolf wordt losgelaten.

Laat de kolf tot alleen de onderste 10% van de kolf raakt het water in het bad, en start de rotatie op gemiddelde snelheid. Als het vacuüm, de snelheid, de condensorstroom en de badtemperatuur optimaal zijn, zal de oplosmiddeldamp die de kolf verlaat, condenseren op de spoel en in de terugwinningskolf druppelen. Verdamp het monster onder het vacuüm tot een kraal vloeistof met een diameter van minder dan een centimeter zichtbaar is in de bodem van de kolf.

Schakel vervolgens de rotatie en het vacuüm uit en til de kolf uit het bad. Houd de kolfhals vast terwijl de vacuümafdichting wordt losgelaten en draai de hals aan de zijkant van de kolf van de condensor. De kraal vloeistof in het extract zal stollen als de hexaan verdampt.

Nadat de kraal ongeveer vijf minuten op kamertemperatuur is gedroogd, vormen de lipiden een doorschijnende witte tot gele was in de kolf. Weeg de kolf om de uiteindelijke massa te verkrijgen en oplos de lipiden in het geregistreerde volume van hexaan om een milligram of meer lipide per een milliliter hexaan op te leveren. Om een chromatografiekolom voor te bereiden, gebruikt u een houten dowelstang, langer dan de kolom om een vierkant van vier bij vier centimeter gevouwen glasvezel aan de onderkant van een glazen chromatografiekolom te plaatsen.

Zet de kolom in een rookkap vast aan een standaard ringstandaard en open de stopcock. Giet vervolgens gewassen en gedroogd zand in de kolom tot ongeveer drie centimeter zand boven de glasvezel rust. Plaats vervolgens donker papier onder de kolom en tik er zachtjes op.

Nu, plaats een 500 milliliter bekerglas onder de kolom en langzaam nat het zand met ongeveer 25 milliliter hexaan, het sluiten van de stopcock wanneer er ongeveer 0,5 centimeter van hexaan boven het zand. Om de neutrale illumina te activeren, heeft pipetwater gedeïioniseerd met een volume gelijk aan 6% van de illuminamassa in druppels in de hele illumina. En bedek de kolf van geactiveerde illumina, krachtig wervelende de oplossing om gelijkmatig verspreiden van de lading.

Wanneer er geen zichtbare klonten van illumina blijven, voeg hexaan totdat de illumina volledig is bedekt met ongeveer 0,5 centimeter van hexaan. Draai de kolf om een drijfmest te vormen en plaats een nieuwe 500 milliliter glazen bekerglas onder de kolom. Open de stopcock, dan wervelen de illumina weer, voordat gestaag gieten van de illumina in een geventileerde trechter gehouden in het reservoir van de kolom, oppassen dat de illumina vestigt zich gelijkmatig in de kolom en dat er geen grote bellen of scheuren vormen.

De kolom wordt gevormd wanneer de bovenkant van de illumina stabiel is en ongeveer vier centimeter onder de hals van de kolom aan de basis van het reservoir. Gebruik vervolgens een pipet om de binnenkant van het reservoir met hexaan te spoelen voor restalfaaan en voeg voorzichtig een tweede laag zand op de aalfa aan ongeveer een centimeter onder het reservoir toe. Voor fractionering van het lipideextract gebruikt u een lange glazen pipet om het lipidemonster naar de kolom over te brengen en het extract langzaam te pipetten om te voorkomen dat de zandlaag wordt verstoord.

Spoel het extract verachtelijk met vijf milliliter hexaan en breng de was naar de kolom. Wanneer al het extract was toegevoegd, opent u de stopcock en laat u het monster in de kolom laden. Zodra het monster is toegevoegd, moet de kolom verzadigd blijven met oplosmiddel.

Als de kolom uitdroogt, gaat het monster verloren. Plaats een vooraf gewogen en gelabelde ronde bodemkolf onder de kolom om de eerste fractie te verzamelen. En gebruik een geventileerde glazen trechter om 100% procent hexaan aan de zijkant van het reservoir te gieten om te voorkomen dat de zandlaag wordt verstoord.

Open vervolgens de stopcock om de elutie te beginnen en sluit de stopcock wanneer ongeveer drie milliliter hexaan boven het zand boven in de kolom blijft. Aangezien grotere dieren van nature meer huidlipiden produceren vanwege hun grotere totale huidoppervlakte, is het belangrijk om de geëxtraheerde lipidemassa te standaardiseren aan de snuitopjelengte van het dier. Eenmaal gestandaardiseerd aan de totale schuur huidmassa, de lineaire relatie van de geëxtraheerde huid lipide massa met de massa van de schuur huid geëxtraheerd is volledig verwijderd.

Na fractionering kan dezelfde standaardisatiebenadering worden gebruikt met de massa's van de afzonderlijke fracties. Bijvoorbeeld, hier elke fractie is niet even dragen aan de totale geëxtraheerde lipide massa, als de neutrale lipiden zijn de dominante set van verbindingen per massa verhouding, in vergelijking met elke set van meer polaire lipiden. Als de identificatie van verbindingen het uiteindelijke doel is, gebruik dan schoon glaswerk en u moet voorkomen dat kunststoffen om verontreiniging van de monsters te voorkomen.

Voor samengestelde identificatie, vloeistof of gaschromatografie, in combinatie met massaspectrometrie kan worden nagestreefd nadat de monsters zijn verzameld. Als alternatief kunnen bioassays worden uitgevoerd om de bioactiviteit van het monster op te helderen.