Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

Deze video zal gedetailleerde protocollen voor in vitro vorm experimenten om de secundaire structuur van RNA sequenties van belang in de aanwezigheid van een RNA gericht op kleine molecuul te bepalen. In vitro vorm is een kosteneffectieve methode om de dynamiek van elke nucleotide te begrijpen op een amino-sized RNA element dat meestal minder dan 200 nucleotiden. Na het voorbereiden van de RNA-sjabloon zoals beschreven in het manuscript, radio label reverse transcriptie primers door het toevoegen van een gamma 32P ATP, omgekeerde transcriptie primer.

10XPNK reactiebuffer, polynucleotide kinase en RNA's gratis water in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis in een totaal volume van 20 microliter. Dan broeden op 37 graden Celsius voor een uur. Vervolgens activeert u de monsters gedurende 20 minuten sinds 65 graden Celsius en filtert u de monsters vervolgens in een ontziltingskolom en centrifuge bij 1000 keer G.Voeg 25 microliters 2XTBE ureum monsterbuffer en mix toe.

Verlaag deze gelabelde producten in een 10%acrylamide gel en zorg ervoor dat u het bloeden van de radioactiviteit in de bovenste reservoirs. Voer de gel op 20 watt voor een uur. Verwijder na de run de glasplaten van de gelcassette.

Leg de gel op het stuk plastic folie. Vouw het plastic op de bovenkant van de gel om een luchtdichte sandwich te maken. Leg de gel sandwich op een calcium-tungstate fosfor scherm en bloot met een verbeeldend instrument.

Beeld de gel opnieuw met regelmatig licht om te weten waar de randen van de gel zijn. Gebruik een software voor beeldverwerking om de twee afbeeldingen te bedekken en de lichte en donkere afbeeldingen te bedekken. Maak vervolgens het bovenste beeld enigszins ondoorzichtig om beide beelden tegelijkertijd te zien.

Zorg ervoor dat de afgedrukte afbeelding dezelfde grootte heeft als de werkelijke gel. Vervolgens lijnt u de gel op de afgedrukte afbeelding uit. Gebruik ten slotte een gesteriliseerd scheermesje om de gewenste bochten uit de gel te snijden en plaats elk stuk gel in een aparte 1,7 milliliter microcentrifugebuis.

Om het DNA te herstellen van de gel slice door passieve elutie, voeg 0,3 milliliter elution neerslag mix aan elke 1,7 milliliter buis. Broed de buizen in een radioactief-veilige container op een rotator op vier graden Celsius gedurende 16 uur. Breng de vloeistof na incubatie in een nieuwe buis van 1,7 milliliter.

Voeg 2,5x ijskoude 200 proof ethanol toe en keer de buizen zes keer om om de vloeistof te mengen. Broed de buizen op min 80 graden Celsius voor een minimum van een uur. Na het centrifugeren op 10, 000g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, verwijder de supernatant zorgvuldig door pipetteren.

Voeg een milliliter van 80% ethanol toe om de pellet te wassen. Vortex gedurende 15 seconden en centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Na het verwijderen van de supernatant door pipetting, lucht-droog de DNA-pellet gedurende vijf minuten.

Voeg 50 microliter gratis water van RNA toe en meng door 10 keer op en neer te pipetten. Normaliseer de DNA-concentratie tot ongeveer 100.000 tellingen per minuut per microliter in een scintillatieteller. Om vier monsters voor te bereiden op chemische modificatie, voeg acht picomoles RNA in 32 microliter van 0,5 XTE buffer toe aan een 1,7 milliliter microcentrifuge buis.

Verwarm op 80 graden Celsius gedurende twee minuten en snap koel op ijs voor ten minste een minuut. Voeg vervolgens acht microliters van 5x vouwmix, meng een toewijzen van negen microliters van dit RNA mengsel in elk van de vier PCR buizen, gelabeld van een tot vier. Voeg een microliter van 10% DMSO in de buis gemarkeerd als een, een microliter van geconcentreerde kleine molecuul oplossing in buis twee, een microliter van verdunde kleine molecuul oplossing in buis drie en een microliter van water in buis vier.

Incubeer alle PCR-buizen bij 37 graden Celsius in een thermische cycler gedurende 30 minuten. Direct voor de twee eerste OH modificatiereactie verdun je een microliter van twee molaire NAI-voorraadoplossing in drie microliters met DEPC-behandeld water om een 0,5-molaire werkoplossing op te leveren. Voeg onmiddellijk een microliter van deze oplossing in buizen een, twee en drie.

Voeg een microliter van 25%DMSO in buis vier en incubeer in een thermische cycler op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Bereid vier verse 1,7 milliliter microcentrifugebuizen en voeg 100 microliters elution neerslag mix en twee microliter glycogeen aan elke buis. Vervolgens in elk van deze buizen overdracht van alle vloeistof uit de bijbehorende PCR buizen.

Voeg 0,34 milliliter ijskoude 200-proof ethanol in elke buis en meng door vijf seconden te vortexen. Plaats de buizen in een min 80 graden Celsius vriezer voor ten minste een uur. Dan centrifugeren de buizen gedurende 15 minuten op 14.000 keer G op vier graden Celsius.

Zonder de RNA-pellet te storen, verwijder je de supernatant van elke buis. Voeg 0,5 milliliter van 80% ethanol per buis toe om de RNA-pellet en vortex gedurende 15 seconden te wassen. Na het centrifugeren onder dezelfde omstandigheden opnieuw, verwijder de supernatant en luchtdroog de RNA pellet gedurende vijf minuten.

Voeg negen microliter van gratis water RNA's en pijp die op en neer 10 keer te mengen. Breng het gemodificeerde RNA over in vier nieuwe PCR-buizen en label ze één tot vier zoals in de vorige stap. Voeg twee picomolen RNA in zeven microliters van DEPC-behandeld water toe aan elk van de vier extra PCR-buizen en label ze met nummers vijf tot acht.

Voeg twee microliters van de teruggewonnen radiogelabelde primer toe aan elk van de acht PCR-buizen die één tot acht zijn gemarkeerd. Na vijf minuten verwarmen bij 65 graden Celsius, koel dan onmiddellijk af tot vier graden Celsius in de thermische fietser. Voeg vier microliters van 5x RT buffer, een microliter van 0,1 molaire DTT en een microliter van DNTP mix aan elk van de buizen.

Voeg vervolgens twee microliters van DEPC-behandeld water toe aan buizen van één tot vier. Voeg vier microliter van vijf millimolar ddATP toe aan buis vijf, vier microliters van vijf millimolar ddTTP aan buis zes en vier microliter van vijf millimolar ddCTP aan buis zeven en een microliter van vijf millimolar ddGTP en drie microliter desPC-behandeld water aan buis acht en pipet vier keer te mengen. Na het verwarmen van alle PCR buizen op 52 graden Celsius voor een minuut in een thermische cycler, voeg een microliter van omgekeerde transcriptase aan elke buis en pijp het op en neer vier keer te mengen.

Broed de reacties op 52 graden Celsius gedurende 20 minuten in de thermische cycler. Om het RNA te hydrolyseren, voeg een microliter van vijf molaire natriumhydroxide toe aan elk van de buizen en verwarm ze vijf minuten lang bij 95 graden Celsius. Voeg vervolgens vijf microliters van één molair zoutzuur toe om de reactie te neutraliseren en de ethanolneerslag te herhalen zoals eerder beschreven.

Voeg na het drogen van de DNA-pellet gedurende vijf minuten 10 microliter water en 10 microliter 2xTBE ureum monster laadbuffer toe in 1,7 milliliter buizen en pijp het 10 keer op en neer om te herdooien. Verwarm de monsters op 70 graden Celsius gedurende vijf minuten, dan plaats de buizen op ijs, alvorens te laden op de gel. Laad 10 microliter van het monster dat op ijs is geplaatst op 8%polyacrylamide sequencing gel.

Voer de gel op 65 watt gedurende twee uur of totdat de bodem kleurstof bereikt de 3/4ths van de gel. Verwijder de afstandsaar en steek voorzichtig een spatel in om de bovenste siliconen glasplaat te verwijderen. Bedek de gel met een stuk groot filterpapier en druk voorzichtig op om de gel aan het filterpapier te laten hechten.

Begin vanaf de onderkant, til het filterpapier en verwijder de gel van de glasplaat samen met het papier. Na het overbrengen van de gel naar een inpakpapier zoals eerder gedaan, droog het op 70 graden Celsius voor een uur met een vacuüm, zorg ervoor dat verschillende filterpapieren tussen de gel en de droger te gebruiken. Breng de gel sandwich op een foto-gebleekte fosfor opslag scherm cassette en bloot de radioactiviteit van de gel op het scherm voor vier tot 16 uur.

Plaats ten slotte het fosforopslagscherm op een beeldverwerkingsapparaat en scan ongeveer 30 minuten met een gemiddelde resolutie. Na het blootstellen van polyacrylamide sequencing gel aan de fosfor opslag scherm, een succesvolle vorm experiment toonde een enkele en meest intense bocht aan de bovenkant van de gel en bochten in de gel op enkele nucleotide resolutie zonder uitstrijkje. De gel toonde ook aan dat de intensiteit van sommige bochten veranderde in de aanwezigheid van kleine moleculen, wat wijst op veranderingen van de basiskoppelsterkte.

Een veel voorkomend probleem in de pagina-analyse is dat een uitstrijkje gebied bekend als de zout front kan verschijnen in het midden van de gel, waarschijnlijk te wijten aan een hoge concentratie van zout, DMSO of andere ongewenste stof in het laden monster. Dat kan worden vermeden door het verwijderen van de ongewenste stof door ethanol neerslag. Een homogene RNA-sjabloon heeft de voorkeur voor in vitro vorm.

We gebruiken ribosomen op zowel vijf prime als drie prime ends om zo'n RNA te verkrijgen. In-cell vorm kan ook worden uitgevoerd om RNA secundaire structuur te verkrijgen in de cellulaire context. Vergeet niet dat in vitro vorm niet kan recapituleren in vivo RNA bindende eiwit interacties.

In vitro vorm is een krachtige methode voor het detecteren van veranderingen in RNA structuur als gevolg van de aanwezigheid van een klein molecuul. Dit wordt gedaan door veranderingen in de patroonsterkte van omgekeerde transcriptase stops te kwantificeren. Wees voorzichtig dat alle experimenten beschreven in deze video worden uitgevoerd in een geautoriseerde radioactieve werkplek met de juiste persoonlijke bescherming en plexiglas afscherming.