Een verbeterde en hoge doorvoer respiratoir syncytieel Virus (RSV) Micro-neutralisatie Assay

Er is behoefte aan een nauwkeurige en hoge doorvoermethode voor het meten van RSV-neutraliserende antilichamen, als een belangrijke marker van bescherming tegen het syncytieel virus van de luchtwegen. Deze methode is zeer reproduceerbaar met variaties tussen de tests voor het referentieantiserum van minder dan 10%Wij geloven dat deze test gemakkelijk kan worden vastgesteld in veel laboratoria wereldwijd tegen relatief lage kosten. We beschrijven hier een op beeldvorming gebaseerde microneutralisatietest die is getest op RSV-subgroep A en ook kan worden aangepast voor RSV-subgroep B en verschillende monstertypen.

Het aantonen van de procedure zal Reuben Tse zijn, een lid van het onderzoeksteam van MCRI. Om platen op dag één te zaaien, worden eerst A549-cellen opnieuw opgetrokken in DMEM-media, met 10%FCS en 1.000 eenheden Penicilline-Streptomycine mengsel met een concentratie van 400, 000 cellen per milliliter. Dan zaad 96-well flat-bottom steriele platen met 40,000 A459 cellen bij een dichtheid van 100 microliter per put.

Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide milieu 's nachts. Om de serumverdunning op dag twee voor te bereiden, ontdooit u eerst het menselijke RSV-referentieserum en serummonsters bij kamertemperatuur. Plaats ze vervolgens 30 minuten in een waterbad op 56 graden Celsius om ze te verwarmen en te activeren.

Bereid vervolgens meer dan 110 microliter van een één tot 100 verdunning van het referentieserum door 1,5 microliter van het referentieserum te mengen met FCS-vrije DMEM-media met Penicilline-Streptomycine-mengsel tot een eindvolume van 150 microliter. Pipette 110 microliter van deze verdunning in goed A12 van een 96-well U-bottom steriele plaat. Om seriële een tot twee verdunningen van de plaat te maken, voeg eerst 55 microliters van FCS-vrije DMEM-media toe met Penicilline-Streptomycine mengsel aan putten B12 tot H12.

Dan met een nieuwe tip transfer 55 microliters van goed A12 naar goed B12. Pipette vijf keer op en neer om de oplossing te mengen en door te gaan tot je goed H12 hebt. Pipette uit de overtollige 55 microliters van de oplossing van goed H12.

Bereid vervolgens een tot 100 verdunning van serummonsters en voeg 110 microliter van elke verdunning toe aan de overeenkomstige putten A1 tot A9 en E1 tot E9 van de 96-bronsternige plaat. Voeg vervolgens 55 microliters van FCS-vrije DMEM-media toe met Penicilline-Streptomycine mengsel aan putten in kolommen één tot en met negen. Maak serienummers één tot twee verdunningen van rij A naar rij D en van rij E naar rij H zoals eerder beschreven.

Voeg 55 microliters FCS-vrije DMEM-media toe met Penicilline-Streptomycine mengsel aan putten in kolommen 10 en 11. Om de virusvoorraad voor te bereiden, plaats je eerst een bevroren flesje RSV in een waterbad van 37 graden Celsius om het snel te ontdooien en plaats je het flesje op ijs. Voeg vervolgens het virus toe aan de DMEM-media die penicilline-Streptomycine-mengsel bevatten bij ongeveer 200 PFU per put om een totaal volume van 55 milliliter voor 100 putten te maken.

Om het virusserummengsel voor te bereiden, voegt u eerst 55 microliter van het verdunde virus toe aan alle putten van de kolommen één tot en met negen en putten van rijen E tot en met H van de kolommen 10 en 11. Voeg vervolgens 55 microliters van FCS-vrije DMEM-media met Penicilline-Streptomycine mengsel toe aan alle putten van rijen A tot en met D van kolommen 10 en 11, en broed de plaat in 37 graden Celsius in 5% kooldioxide-omgeving gedurende een uur. Voorafgaand aan de inenting van A549 cellen met RSV, onderzoekt de celplaat onder een lichtmicroscoop om te bevestigen dat A549 celmonolagen 80% confluent zijn.

Keer vervolgens de plaat voorzichtig om om de media weg te gooien en de plaat lichtjes op een steriele absorberende papieren handdoek te dep. Na elk, wassen met gefilterde steriele PBS. Voeg vervolgens 100 microliter per put van het virusserummengsel toe aan de overeenkomstige putten op de A549-celplaat volgens de plaatsjabloon in het manuscript en broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide.

Gebruik aan het einde van de incubatie een pipet om 90 microliter per put te verwijderen en voeg 100 microliter van de media toe die 1XM199, 1,5%CMC en 2%FCS in penicilline-Streptomycinemengsel bevatten. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende drie dagen. Om een testplaat te fixen en te ontwikkelen, moet u eerst de met RSV geïnfecteerde A549-celplaat voorzichtig omkeren om de media met M199, CMC, 2%FCS en Penicilline-Streptomycine-mengsel te verwijderen.

Voeg dan langzaam 200 microliters fixatiebuffer toe aan elke put. Broed de plaat 20 minuten lang in op min 20 graden Celsius. Gooi vervolgens de fixatiebuffer weg en dep voorzichtig op een absorberende papieren handdoek.

Laat de plaat 10 minuten naar beneden drogen. Maak vervolgens met gefilterde PBS-buffer met 05 polysorbate 20 5%melkblokkeringsoplossing. Voeg 200 microliter van de blokkeeroplossing toe aan elke put en broed de plaat 30 minuten op kamertemperatuur uit.

Aan het einde van de incubatie de plaat voorzichtig omkeren om de oplossing weg te gooien en des te deken op een absorberende papieren handdoek. Om het primaire antilichaam te maken, verdun je een tot 500 geit XRSV-antilichaam in de blokkeringsoplossing. Voeg 50 microliter toe aan elke put en broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius.

Was de plaat drie keer met gefilterde PBS-polysorbaat. Maak vervolgens het secundaire antilichaam door één tot 5.000 Alexa Fluor ezel anti-geit immunoglobuline G in de blokkerende oplossing te verdunnen. Voeg 50 microliter toe aan elke put en broed gedurende een uur uit met 37 graden Celsius.

Was de plaat vijf keer met gefilterde PBS-polysorbaat. Om plaques met een automatische spotslezer te tellen, gebruikt u eerst een ongebruikte 96-put cultuurplaat om het instrument samen te werken door de telinstellingen in het FITC-kanaal in te voeren. Lees dan de celplaat, wikkel het in folie en bewaar het op vier graden Celsius.

Controleer vervolgens de afbeeldingen van putten op artefactuele plaques of verstoorde celmonolagen en sluit putten uit met verstoorde celmonolagen. Het gemiddelde aantal plaques van de no-serum controleputten werd berekend en gebruikt om de 50% neutralisatie cut-off te bepalen die zou resulteren in 50% remming van de virusactiviteit. De wederkerige serumverdunning werd uitgezet op de x-as en het aantal plaques op de y-as van een semi-loggrafiek van een lijn die tussen de twee punten is getrokken.

De 50%neutralisatie-titers van de testserummonsters waren rood en serumverdunningen met tellingen direct boven of onder de 50% waarde van de no-serum controleputten werden geïdentificeerd. RSVAPRN testen in twee verschillende volwassen cohorten uit Gambia en gezonde vrijwilligers in Melbourne resulteerde in de Gambiaanse volwassenen met een lagere gemiddelde NAB titer in vergelijking met de Melbourne volwassenen. Het getoonde menselijke RSV-referentieserum toont een zeer lage variabiliteit aan met de variatiecoëfficiënt van 6,82%Deze verbeterde rsv-plaquereductieneutralisatietest met hoge doorvoer kan gemakkelijk in veel laboratoria worden geïmplementeerd en zal de internationale harmonisatie-inspanning van de WHO voor RSV-neutraliserende antilichaamtesten ondersteunen.

Dit zal van cruciaal belang zijn voor de evaluatie van nieuwe RSV-vaccinkandidaten in de toekomst.