Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

Het doel van deze procedure is om een ex vivo model te hebben om bot remodelleren te evalueren en de tumor-bone micro-omgeving te recreëren met behulp van calvaria cultuur of co-cultuur met kankercellen. De meeste calvaria techniek is een orgaancultuur systeem met behulp van calvaria botten van neonatale muizen om bot remodelleren te evalueren. U het therapeutisch potentieel van diverse moleculen testen, of zelfs de bot-tumor micro-omgeving nabootsen wanneer u coculturen met kankercellen gebruikt.

Dat alles in een eenvoudige en eenvoudige test in een korte tijd en een lage kosten. Het doel van deze techniek is om een hulpmiddel te hebben om botregeneratie in de kankerbotmicro-omgeving te evalueren, met behulp van een ex vivo model van de calvariale orgaancultuur van de muis. Selecteer eerst een muispup en plaats deze onder de motorkap.

We gebruiken calvaria van vijf- tot zeven dagen oude muizenpups. Neem het hoofd met de spuit, snijd de huid, en duidelijk de hoofdhuid genoeg voor de calvaria ontleden. Identificeer de hechtingen van de schedel, sagittale, coronale en lambdoïden.

Maak een rechte snede langs de lambdoid hechtingen, tot ongeveer het niveau van het oog. Snijd aan elke kant, van de lambdoïde hechtingen naar de coronale hechting. Maak onder een hoek van 45 een andere snede om het uiteinde van de snede te verbinden met de snede van de voorste fontanel.

Het is uiterst belangrijk om de schedelhechtingen, sagittale, frontale, coronale, lambdoïde te definiëren, om de juiste weefselinclusie en histologieanalyse te garanderen. Met fijne tips tangen, verwijder de calvaria, en zet het op een petrischaal deksel. Maak met een scalpel een rechte snede van de achterste fontanel langs de sagittale hechting door de coronale hechting.

Er worden twee hemicalvarias verkregen. Pak elke calvaria met de tangen, en leg ze in een nieuwe petrischaal met PBS. Voor cultuur, plaats de hemicalvaria in een 24-well weefsel kweekplaat, met een milliliter van de media, en incubeer gedurende 24 uur op 37 graden.

We kunnen ook primaire calvarial culturen gebruiken om de tumor-bot micro-omgeving te reproduceren voor botreptie. Om dat te doen, we co-cultuur calvarias met kankercellen, of met geconditioneerde media uit kankercellen. 24 uur later, verwijder de media en vervang deze door media met de behandeling die u wilt testen.

Als u kankercellen en botinteracties wilt evalueren, of de micro-omgeving van het tumorbot opnieuw wilt maken, geef de calvaria dan door aan een lage cellulaire bevestigingsplaat, om de bevestiging van de kankercellen aan de plaat te voorkomen. Trypsinize de kankercellen, tel ze, en plaats ze zorgvuldig op de top van de hemicalvaria. U ook gebruik maken van voorwaardelijke media van kankercellen, en gebruik het om de hemicalvaria uit te broeden.

Zes tot zeven dagen incubeer bij 37 graden, met vijf procent CO2. Op de derde dag, verander de media en blijven broeden. Het aantal cellen dat in de co-cultuur wordt gebruikt, is afhankelijk van de cellijn van kanker.

U moet eerst het aantal cellen optimaliseren dat nodig is om een reactie in de ene te induceren. Na de cultuur, de calvaria passeren een proces van fixatie, ontkalking, en paraffine-embedded. Verder worden de weefsels geneist in een microtome, gekleurd, en histomorphometrische analyse wordt uitgevoerd.

De opname van de calvaria kan lastig zijn. Om ervoor te zorgen dat het weefsel wordt beschermd tijdens de opname, u het weefsel tussen sponzen of gebruik een tissue papier of ander absorberend papier voordat het in de cassette. Voor weefselverwerking, wikkel de hemicalvaria in tissue papier.

Plaats het vervolgens in een inbeddingscassette en bevestig het in neutrale buffer in formaline, gedurende 24 uur op vier graden. Om de calvaria te ontkalken, plaatst u de cassette gedurende 48 uur bij vier graden in een EDTA van 10%EDTA. Verwerk de weefselcassettes met de hemicalvaria in een automatische weefselprocessor.

Volg een regelmatige dag rotatie cyclus, dan, omvatten in paraffine. Voor het doorsnijden, snijd vier microtische secties met een microtome, monteer de secties op glazen microscoop dia's, en vlek met hematoxylin, eosine. Histologie analyse werd gebruikt om kwantitatieve analyse van het botoppervlak en het bot remodelleren gebieden uit te voeren.

De beelden van de calvaria op de zeven dagen werden geanalyseerd met behulp van de imaging software. Voor kwantitatieve beoordeling, in de eerste plaats, definiëren het gebied voor de analyse. Kijk in de secties op de telopa waar vier X om de oriëntatie en de hechtingen te identificeren.

Definieer de coronale hechting en identificeer het lange botoppervlak aan de ene kant en vervolgens het korte oppervlak aan de andere kant. Onder de 40X vergroting, identificeer de coronale hechting en beweeg twee of drie optische velden uit de buurt van de hechting, langs het lange oppervlak. Leg het beeld van dit gebied vast om te analyseren.

U afbeeldingensoftware gebruiken om de structurele integriteit van het bot te analyseren. Kwantitatieve histomorfometrische analyse voor de dikte en het botgebied van de hemicalvaria kan worden gedaan. De juiste calvaria-analyse hangt af van een goede inbedding en de juiste oriëntatie voor consistente histologische resultaten.

Zorg ervoor dat u ten minste drie calvaria per experimentele aandoening gebruikt. Hier kunnen we de structuur van het bot zien. In oranje wordt het bot waargenomen.

We kunnen ook de aanwezigheid van het periosteum, ostocyte, endosteum en andere delen van het bot zien. In ons geval gebruiken we insuline om de botremodellering te verhogen. Vergeleken met een controle, kunnen we een aanzienlijke toename van het botgebied zien.

Hier zien we het effect van MDA-MB-231 cellijn op modelcalvaria. We kunnen zien, in vergelijking met de controle, dat de aanwezigheid van kankercellen osteolytische factoren induceert die botvernietiging stimuleren. We gebruikten calvaria model om botregeneratie en kankercel-bot interacties te meten door co-culturen met kankercel en histologie.

We valideren onze gegevens ook op kwantitatieve real-time PCR. Dit ex vivo model heeft veel voordeel, zoals de driedimensionale organisatie en de cellulaire diversiteit van het bot worden bewaard, en de experimentele omstandigheden kunnen worden gecontroleerd. Bovendien is het model eenvoudig, u resultaten zien in een korte periode van tijd, en het is low-cost.

En het kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals kwantitatieve real-time PCR, microscopie en micro-CT.