Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie
March 14th, 2020
De ex vivo cultuur van botexplants kan een waardevol instrument zijn voor de studie van de botfysiologie en de mogelijke evaluatie van geneesmiddelen bij botremodellering en botziekten. Het gepresenteerde protocol beschrijft de voorbereiding en cultuur van calvarias geïsoleerd van pasgeboren muizen schedels, evenals de toepassingen ervan.
Het doel van deze procedure is om een ex vivo model te hebben om bot remodelleren te evalueren en de tumor-bone micro-omgeving te recreëren met behulp van calvaria cultuur of co-cultuur met kankercellen. De meeste calvaria techniek is een orgaancultuur systeem met behulp van calvaria botten van neonatale muizen om bot remodelleren te evalueren. U het therapeutisch potentieel van diverse moleculen testen, of zelfs de bot-tumor micro-omgeving nabootsen wanneer u coculturen met kankercellen gebruikt.
Dat alles in een eenvoudige en eenvoudige test in een korte tijd en een lage kosten. Het doel van deze techniek is om een hulpmiddel te hebben om botregeneratie in de kankerbotmicro-omgeving te evalueren, met behulp van een ex vivo model van de calvariale orgaancultuur van de muis. Selecteer eerst een muispup en plaats deze onder de motorkap.
We gebruiken calvaria van vijf- tot zeven dagen oude muizenpups. Neem het hoofd met de spuit, snijd de huid, en duidelijk de hoofdhuid genoeg voor de calvaria ontleden. Identificeer de hechtingen van de schedel, sagittale, coronale en lambdoïden.
Maak een rechte snede langs de lambdoid hechtingen, tot ongeveer het niveau van het oog. Snijd aan elke kant, van de lambdoïde hechtingen naar de coronale hechting. Maak onder een hoek van 45 een andere snede om het uiteinde van de snede te verbinden met de snede van de voorste fontanel.
Het is uiterst belangrijk om de schedelhechtingen, sagittale, frontale, coronale, lambdoïde te definiëren, om de juiste weefselinclusie en histologieanalyse te garanderen. Met fijne tips tangen, verwijder de calvaria, en zet het op een petrischaal deksel. Maak met een scalpel een rechte snede van de achterste fontanel langs de sagittale hechting door de coronale hechting.
Er worden twee hemicalvarias verkregen. Pak elke calvaria met de tangen, en leg ze in een nieuwe petrischaal met PBS. Voor cultuur, plaats de hemicalvaria in een 24-well weefsel kweekplaat, met een milliliter van de media, en incubeer gedurende 24 uur op 37 graden.
We kunnen ook primaire calvarial culturen gebruiken om de tumor-bot micro-omgeving te reproduceren voor botreptie. Om dat te doen, we co-cultuur calvarias met kankercellen, of met geconditioneerde media uit kankercellen. 24 uur later, verwijder de media en vervang deze door media met de behandeling die u wilt testen.
Als u kankercellen en botinteracties wilt evalueren, of de micro-omgeving van het tumorbot opnieuw wilt maken, geef de calvaria dan door aan een lage cellulaire bevestigingsplaat, om de bevestiging van de kankercellen aan de plaat te voorkomen. Trypsinize de kankercellen, tel ze, en plaats ze zorgvuldig op de top van de hemicalvaria. U ook gebruik maken van voorwaardelijke media van kankercellen, en gebruik het om de hemicalvaria uit te broeden.
Zes tot zeven dagen incubeer bij 37 graden, met vijf procent CO2. Op de derde dag, verander de media en blijven broeden. Het aantal cellen dat in de co-cultuur wordt gebruikt, is afhankelijk van de cellijn van kanker.
U moet eerst het aantal cellen optimaliseren dat nodig is om een reactie in de ene te induceren. Na de cultuur, de calvaria passeren een proces van fixatie, ontkalking, en paraffine-embedded. Verder worden de weefsels geneist in een microtome, gekleurd, en histomorphometrische analyse wordt uitgevoerd.
De opname van de calvaria kan lastig zijn. Om ervoor te zorgen dat het weefsel wordt beschermd tijdens de opname, u het weefsel tussen sponzen of gebruik een tissue papier of ander absorberend papier voordat het in de cassette. Voor weefselverwerking, wikkel de hemicalvaria in tissue papier.
Plaats het vervolgens in een inbeddingscassette en bevestig het in neutrale buffer in formaline, gedurende 24 uur op vier graden. Om de calvaria te ontkalken, plaatst u de cassette gedurende 48 uur bij vier graden in een EDTA van 10%EDTA. Verwerk de weefselcassettes met de hemicalvaria in een automatische weefselprocessor.
Volg een regelmatige dag rotatie cyclus, dan, omvatten in paraffine. Voor het doorsnijden, snijd vier microtische secties met een microtome, monteer de secties op glazen microscoop dia's, en vlek met hematoxylin, eosine. Histologie analyse werd gebruikt om kwantitatieve analyse van het botoppervlak en het bot remodelleren gebieden uit te voeren.
De beelden van de calvaria op de zeven dagen werden geanalyseerd met behulp van de imaging software. Voor kwantitatieve beoordeling, in de eerste plaats, definiëren het gebied voor de analyse. Kijk in de secties op de telopa waar vier X om de oriëntatie en de hechtingen te identificeren.
Definieer de coronale hechting en identificeer het lange botoppervlak aan de ene kant en vervolgens het korte oppervlak aan de andere kant. Onder de 40X vergroting, identificeer de coronale hechting en beweeg twee of drie optische velden uit de buurt van de hechting, langs het lange oppervlak. Leg het beeld van dit gebied vast om te analyseren.
U afbeeldingensoftware gebruiken om de structurele integriteit van het bot te analyseren. Kwantitatieve histomorfometrische analyse voor de dikte en het botgebied van de hemicalvaria kan worden gedaan. De juiste calvaria-analyse hangt af van een goede inbedding en de juiste oriëntatie voor consistente histologische resultaten.
Zorg ervoor dat u ten minste drie calvaria per experimentele aandoening gebruikt. Hier kunnen we de structuur van het bot zien. In oranje wordt het bot waargenomen.
We kunnen ook de aanwezigheid van het periosteum, ostocyte, endosteum en andere delen van het bot zien. In ons geval gebruiken we insuline om de botremodellering te verhogen. Vergeleken met een controle, kunnen we een aanzienlijke toename van het botgebied zien.
Hier zien we het effect van MDA-MB-231 cellijn op modelcalvaria. We kunnen zien, in vergelijking met de controle, dat de aanwezigheid van kankercellen osteolytische factoren induceert die botvernietiging stimuleren. We gebruikten calvaria model om botregeneratie en kankercel-bot interacties te meten door co-culturen met kankercel en histologie.
We valideren onze gegevens ook op kwantitatieve real-time PCR. Dit ex vivo model heeft veel voordeel, zoals de driedimensionale organisatie en de cellulaire diversiteit van het bot worden bewaard, en de experimentele omstandigheden kunnen worden gecontroleerd. Bovendien is het model eenvoudig, u resultaten zien in een korte periode van tijd, en het is low-cost.
En het kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals kwantitatieve real-time PCR, microscopie en micro-CT.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor ex vivo-kweek van calvaria van pasgeboren muizen, gericht op het bestuderen van botfysiologie en het evalueren van geneesmiddeleffecten op botremodellering. De techniek maakt het mogelijk om de tumor-bot-micro-omgeving te recreëren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Botfysiologie
- Botremodellering
- Kankerbiologie
Achtergrond
- Bot-explantaten kunnen worden gekweekt om fysiologische processen te bestuderen.
- Calvaria van neonatale muizen dienen als model voor botstudies.
- Co-cultuur met kankercellen kan de tumor-bot-micro-omgeving nabootsen.
- Deze methode is kosteneffectief en eenvoudig.
Doel van het onderzoek
- Om botremodellering in een ex vivo-model te evalueren.
- Om het therapeutisch potentieel van verschillende moleculen te beoordelen.
- Om de bot-tumor-micro-omgeving te recreëren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van calvaria van pasgeboren muizen.
- Ex vivo-kweektechnieken voor bot-explantaten.
- Co-kweeksystemen met kankercellen.
- Evaluatie van botregeneratie en geneesmiddeleffecten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kweek van calvaria voor het bestuderen van botremodellering.
- Mogelijkheid om therapeutische middelen in een gecontroleerde omgeving te testen.
- Gedemonstreerde recreatie van de tumor-bot-micro-omgeving.
- De methode is efficiënt en laagdrempelig.
Conclusies
- De ex vivo-kweek van calvaria is een waardevol hulpmiddel voor botonderzoek.
- Het vergemakkelijkt het onderzoek naar geneesmiddeleffecten op botfysiologie.
- Co-kweeksystemen verbeteren het begrip van kankerinteracties met bot.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
