Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen
March 22nd, 2019
Hier beschrijven we hoe het gebruik van de geautomatiseerde screening en mailopties voor gegevens verzamelen beschikbaar op sommige synchrotron straallijnen. Wetenschappers verzenden de synchrotron, cryocooled monsters en de diffractie eigenschappen worden gescreend, de verzamelingen gegevens worden verzameld en verwerkt en, waar mogelijk, de oplossing van een structuur wordt uitgevoerd — allemaal zonder menselijke tussenkomst.
X-Ray kristallografie is de dominante techniek voor het bepalen van 3D structurele informatie van eiwitten. Synchrotron bundel lijnen zijn nodig om gegevens te verkrijgen van de kleine, zwak diffracting kristallen van de eiwitten produceren. Massive one is een unieke bundellijn omdat het het proces van het verzamelen van gegevens uit biologische macromoleculen volledig automatiseert.
Van voorbeeldmontage, locatie en definitieve gegevensverzameling. Volledige automatisering van dit soort is erg belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om hun tijd door te brengen in het lab, in plaats van het verzamelen van gegevens op de bundellijn. De bundel lijn is ook intelligent en gemiddeld, kan het verzamelen van betere gegevens dan wanneer de bundel lijn wordt bediend door de mens.
Om dit protocol te beginnen, voert u kristalmontage uit en vraagt u beam time op Massive, zoals beschreven in het tekstprotocol. Navigeer naar het informatiesysteem voor eiwitkristallografiebundellijnen of ISPyB-website. Kies MX-experimenten, log in met het experimentnummer en wachtwoord.
Klik op verzending, voeg nieuw toe en geef de nodige informatie. Klik vervolgens op opslaan. Klik op Pakket toevoegen en vul de gevraagde informatie in.
Klik op Opslaan en klik vervolgens op Container toevoegen. Geef de puck barcode als de naam, en kies wervelkolom puck, nogmaals klik op opslaan. Klik op het containersymbool en bewerk en vul de nodige informatie in over de monsters, zoals de eiwitnaam, de gewenste werkstroom en de kristalpositie, in de puck.
Kies het eiwit dat is goedgekeurd door de ESRF-veiligheidsgroep. Voer een unieke voorbeeldnaam in om elk afzonderlijk voorbeeld te identificeren. Scan eventueel de pincode.
De rest van de informatie op te nemen is ook optioneel. Voer voor elk afzonderlijk voorbeeld het experimenttype in. Hiermee wordt gedefinieerd welke automatische workflow wordt gebruikt om elk kristal te verwerken.
Aangezien de GCSH-kristallen naalden zijn, kiest u MX-druk op P.Next, voer u een ruimtegroep in. Indien aanwezig, zal dit worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens strategie berekeningen, en door de automatische gegevensverwerking pijp lijnen beschikbaar. Voer de gewenste resolutie in.
Hiermee definieert u de afstand van kristal tot detector van de eerste mesh-scans, karakterisering en standaardgegevensverzameling. Stel nu de gewenste drempelresolutie in om te voorkomen dat volledige gegevenssets worden verzameld van kristallen die niet tot deze limiet worden beperkt. Dit kan gegevensopslagruimte besparen en tijd analyseren.
De vereiste volledigheid instellen. Stel vervolgens de vereiste veelheid in. Als er meer dan één kristal op de monsterondersteuning staat, stelt u het maximumaantal te analyseren kristallen in.
De standaardwaarde is een of vijf voor MX-druk op P.De juiste bundelgrootte kan ook worden geselecteerd. Plaats de ruimtegroep, indien bekend, in de kolom met krachtruimtegroep. Stel vervolgens de stralingsgevoeligheid van de kristallen in.
Stel desgewenst de totale rotatiehoek in die moet worden verzameld voor het verzamelen van de volledige gegevensset. Zodra alle informatie in het systeem is ingevoerd, slaat u de waarden op. Klik hierop, ga terug naar zendingen en druk op verzending naar ESRF.
Druk het verzendlabel af en stuur de monsters. Gebruikers moeten een pick-up regelen met een koerier met behulp van de ESRF-accountgegevens. Op de dag van het experiment worden monsters overgedragen aan de Massive one high capacity dauw-er.
Beam line wetenschappers lanceren dan de gegevensverzameling, die op afstand kan worden gevolgd door gebruikers. Voor elk ander voorbeeldtype ontvangen gebruikers een e-mail waarin ze worden geïnformeerd dat de gegevensverzameling is gestart. De uitvoering van alle stappen in alle workflows kan online en in realtime worden gevolgd.
Dit is toegankelijk voor de gebruiker door in te loggen op ISPyB. De resultaten kunnen ook worden bekeken en gedownload. Voor elk geanalyseerd monster, de resultaten van het automatische experiment op ISPyB onderzoeken.
Klik op de gewenste experimentele sessie op ID30A1. Selecteer de voorkeurspijplijn voor automatische verwerking. Download de gegevens die zijn uitgeschreven in de juiste ruimtegroep met de hoogste volledigheid en hoogste resolutie.
Door te klikken op de laatste resultaten te verzamelen en vervolgens te downloaden. De MX press P workflow werd gebruikt door de ESRF bundel lijn Massive een volledig automatisch monteren, centreren in de x-ray beam, karakteriseren, en het verzamelen van volledige diffractie gegevenssets van een reeks kristallen van de menselijke GCSH. De monsters werden gemonteerd en de lus geanalyseerd voor een gebied te scannen.
Na de diffractieanalyses werden vier punten geselecteerd in het kristal voor het verzamelen van gegevens. Handmatige structuur bepaling door moleculaire vervanging leverde een hoge kwaliteit elektronendichtheid kaart na een enkele geautomatiseerde verfijning cyclus. Voor deze gegevensset, de geautomatiseerde pijplijn snijd de gegevens op een punt drie twee angstrom resolutie.
Gebruikers kunnen echter besluiten om de gegevens met een lagere resolutie te knippen. Continue elektronendichtheid is zichtbaar voor de gehele aminozuurketen, afgezien van eterminal histidine tag. Van de vier substituties die menselijke en rundvee-GCSH onderscheiden, zijn er drie gemakkelijk herkenbaar in de elektronendichtheid.
Dit is minder duidelijk voor de aspartic zuur tot lysine 125 substitutie. Waarvoor de elektronendichtheid van de zijketen slechts gedeeltelijk wordt opgelost door flexibiliteit. Het momenteel verkregen model heeft een R-werkwaarde van 20 punt vier procent en een R-vrije waarde van 23 punt acht procent en kan verder worden geoptimaliseerd door extra cycli van geautomatiseerde en handmatige modelbouw en verfijning.
Het is belangrijk om de eisen aan uw systeem af te stemmen. Als u bijvoorbeeld de reeds waargenomen resolutie op een bekende waarde stelt, kan dit tijd besparen en zorgen voor een betere gegevensverzameling. Volledig automatische gegevensverzameling heeft gedemocratiseerd kristallografie en nu zelfs kleine laboratoria kunnen beginnen aan beroemde project toen dit haalbaar was voor slechts met enorme mankracht.
Overzicht
Dit artikel beschrijft het geautomatiseerde screening- en gegevensverzamelingproces bij synchrotronstralen voor eiwitkristallografie. Het volledig geautomatiseerde systeem stelt onderzoekers in staat om efficiënt gegevens te verzamelen en verwerken van cryogekoelde monsters zonder menselijke tussenkomst.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Eiwitkristallografie
- Röntgendiffractie
- Automatisering in gegevensverzameling
Achtergrond
- Röntgenkristallografie is essentieel voor het bepalen van eiwitstructuren.
- Synchrotronstralen zijn cruciaal voor het verkrijgen van gegevens van zwakke diffractiekristallen.
- Automatisering verbetert de efficiëntie en kwaliteit van gegevensverzameling.
- Massive one biedt een volledig geautomatiseerd werkproces voor biologische macromoleculen.
Doel van het onderzoek
- Om het geautomatiseerde gegevensverzamelingproces bij synchrotronstralen te demonstreren.
- Om de voordelen van automatisering in eiwitkristallografie te benadrukken.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden dat onderzoekers kunnen volgen.
Gebruikte methoden
- Stapelmontage en verzending naar de synchrotron.
- Gebruik van het ISPyB-informatiesysteem voor experimentbeheer.
- Geautomatiseerde gegevensverzameling en verwerkingsworkflows.
- Real-time monitoring van gegevensverzameling en resultatenanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verzameling van hoogwaardige diffractiegegevens van menselijke GCSH-kristallen.
- Geautomatiseerde verwerking leverde een hoge-resolutie elektronendichtheidskaart op.
- Geïdentificeerde structurele verschillen tussen menselijke en runder GCSH.
- Demonstratie van de effectiviteit van geautomatiseerde workflows in kristallografie.
Conclusies
- Automatisering in gegevensverzameling democratiseert toegang tot kristallografie.
- Kleinere laboratoria kunnen nu complexe projecten ondernemen die eerder beperkt waren tot grotere faciliteiten.
- Aanpassen van experimentele parameters kan de efficiëntie van gegevensverzameling verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
