Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen
22 maart 2019
Hier beschrijven we hoe het gebruik van de geautomatiseerde screening en mailopties voor gegevens verzamelen beschikbaar op sommige synchrotron straallijnen. Wetenschappers verzenden de synchrotron, cryocooled monsters en de diffractie eigenschappen worden gescreend, de verzamelingen gegevens worden verzameld en verwerkt en, waar mogelijk, de oplossing van een structuur wordt uitgevoerd — allemaal zonder menselijke tussenkomst.
X-Ray kristallografie is de dominante techniek voor het bepalen van 3D structurele informatie van eiwitten. Synchrotron bundel lijnen zijn nodig om gegevens te verkrijgen van de kleine, zwak diffracting kristallen van de eiwitten produceren. Massive one is een unieke bundellijn omdat het het proces van het verzamelen van gegevens uit biologische macromoleculen volledig automatiseert.
Van voorbeeldmontage, locatie en definitieve gegevensverzameling. Volledige automatisering van dit soort is erg belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om hun tijd door te brengen in het lab, in plaats van het verzamelen van gegevens op de bundellijn. De bundel lijn is ook intelligent en gemiddeld, kan het verzamelen van betere gegevens dan wanneer de bundel lijn wordt bediend door de mens.
Om dit protocol te beginnen, voert u kristalmontage uit en vraagt u beam time op Massive, zoals beschreven in het tekstprotocol. Navigeer naar het informatiesysteem voor eiwitkristallografiebundellijnen of ISPyB-website. Kies MX-experimenten, log in met het experimentnummer en wachtwoord.
Klik op verzending, voeg nieuw toe en geef de nodige informatie. Klik vervolgens op opslaan. Klik op Pakket toevoegen en vul de gevraagde informatie in.
Klik op Opslaan en klik vervolgens op Container toevoegen. Geef de puck barcode als de naam, en kies wervelkolom puck, nogmaals klik op opslaan. Klik op het containersymbool en bewerk en vul de nodige informatie in over de monsters, zoals de eiwitnaam, de gewenste werkstroom en de kristalpositie, in de puck.
Kies het eiwit dat is goedgekeurd door de ESRF-veiligheidsgroep. Voer een unieke voorbeeldnaam in om elk afzonderlijk voorbeeld te identificeren. Scan eventueel de pincode.
De rest van de informatie op te nemen is ook optioneel. Voer voor elk afzonderlijk voorbeeld het experimenttype in. Hiermee wordt gedefinieerd welke automatische workflow wordt gebruikt om elk kristal te verwerken.
Aangezien de GCSH-kristallen naalden zijn, kiest u MX-druk op P.Next, voer u een ruimtegroep in. Indien aanwezig, zal dit worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens strategie berekeningen, en door de automatische gegevensverwerking pijp lijnen beschikbaar. Voer de gewenste resolutie in.
Hiermee definieert u de afstand van kristal tot detector van de eerste mesh-scans, karakterisering en standaardgegevensverzameling. Stel nu de gewenste drempelresolutie in om te voorkomen dat volledige gegevenssets worden verzameld van kristallen die niet tot deze limiet worden beperkt. Dit kan gegevensopslagruimte besparen en tijd analyseren.
De vereiste volledigheid instellen. Stel vervolgens de vereiste veelheid in. Als er meer dan één kristal op de monsterondersteuning staat, stelt u het maximumaantal te analyseren kristallen in.
De standaardwaarde is een of vijf voor MX-druk op P.De juiste bundelgrootte kan ook worden geselecteerd. Plaats de ruimtegroep, indien bekend, in de kolom met krachtruimtegroep. Stel vervolgens de stralingsgevoeligheid van de kristallen in.
Stel desgewenst de totale rotatiehoek in die moet worden verzameld voor het verzamelen van de volledige gegevensset. Zodra alle informatie in het systeem is ingevoerd, slaat u de waarden op. Klik hierop, ga terug naar zendingen en druk op verzending naar ESRF.
Druk het verzendlabel af en stuur de monsters. Gebruikers moeten een pick-up regelen met een koerier met behulp van de ESRF-accountgegevens. Op de dag van het experiment worden monsters overgedragen aan de Massive one high capacity dauw-er.
Beam line wetenschappers lanceren dan de gegevensverzameling, die op afstand kan worden gevolgd door gebruikers. Voor elk ander voorbeeldtype ontvangen gebruikers een e-mail waarin ze worden geïnformeerd dat de gegevensverzameling is gestart. De uitvoering van alle stappen in alle workflows kan online en in realtime worden gevolgd.
Dit is toegankelijk voor de gebruiker door in te loggen op ISPyB. De resultaten kunnen ook worden bekeken en gedownload. Voor elk geanalyseerd monster, de resultaten van het automatische experiment op ISPyB onderzoeken.
Klik op de gewenste experimentele sessie op ID30A1. Selecteer de voorkeurspijplijn voor automatische verwerking. Download de gegevens die zijn uitgeschreven in de juiste ruimtegroep met de hoogste volledigheid en hoogste resolutie.
Door te klikken op de laatste resultaten te verzamelen en vervolgens te downloaden. De MX press P workflow werd gebruikt door de ESRF bundel lijn Massive een volledig automatisch monteren, centreren in de x-ray beam, karakteriseren, en het verzamelen van volledige diffractie gegevenssets van een reeks kristallen van de menselijke GCSH. De monsters werden gemonteerd en de lus geanalyseerd voor een gebied te scannen.
Na de diffractieanalyses werden vier punten geselecteerd in het kristal voor het verzamelen van gegevens. Handmatige structuur bepaling door moleculaire vervanging leverde een hoge kwaliteit elektronendichtheid kaart na een enkele geautomatiseerde verfijning cyclus. Voor deze gegevensset, de geautomatiseerde pijplijn snijd de gegevens op een punt drie twee angstrom resolutie.
Gebruikers kunnen echter besluiten om de gegevens met een lagere resolutie te knippen. Continue elektronendichtheid is zichtbaar voor de gehele aminozuurketen, afgezien van eterminal histidine tag. Van de vier substituties die menselijke en rundvee-GCSH onderscheiden, zijn er drie gemakkelijk herkenbaar in de elektronendichtheid.
Dit is minder duidelijk voor de aspartic zuur tot lysine 125 substitutie. Waarvoor de elektronendichtheid van de zijketen slechts gedeeltelijk wordt opgelost door flexibiliteit. Het momenteel verkregen model heeft een R-werkwaarde van 20 punt vier procent en een R-vrije waarde van 23 punt acht procent en kan verder worden geoptimaliseerd door extra cycli van geautomatiseerde en handmatige modelbouw en verfijning.
Het is belangrijk om de eisen aan uw systeem af te stemmen. Als u bijvoorbeeld de reeds waargenomen resolutie op een bekende waarde stelt, kan dit tijd besparen en zorgen voor een betere gegevensverzameling. Volledig automatische gegevensverzameling heeft gedemocratiseerd kristallografie en nu zelfs kleine laboratoria kunnen beginnen aan beroemde project toen dit haalbaar was voor slechts met enorme mankracht.
Overzicht
Dit artikel beschrijft het geautomatiseerde screenings- en gegevensverzamelingsproces bij synchrotron-straallijnen voor eiwitkristallografie. Het volledig geautomatiseerde systeem stelt onderzoekers in staat om efficiënt gegevens van cryogekoelde monsters te verzamelen en te verwerken zonder menselijke tussenkomst.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Eiwitkristallografie
- Röntgendiffractie
- Automatisering van gegevensverzameling
Achtergrond
- Röntgendiffractie is essentieel voor het bepalen van eiwitstructuren.
- Synchrotron-beamlines zijn cruciaal voor het verkrijgen van gegevens van zwak diffracterende kristallen.
- Automatisering verhoogt de efficiëntie en kwaliteit van de gegevensverzameling.
- Massive one beamline biedt een volledig geautomatiseerde workflow voor biologische macromoleculen.
Doel van de studie
- Om het geautomatiseerde proces van gegevensverzameling bij synchrotron-beamlines te demonstreren.
- Om de voordelen van automatisering in de eiwitkristallografie te belichten.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden dat onderzoekers kunnen volgen.
Gebruikte methoden
- Het monteren en verzenden van monsters naar de synchrotron.
- Gebruik van het ISPyB-informatiesysteem voor experimentbeheer.
- Geautomatiseerde workflows voor gegevensverzameling en -verwerking.
- Real-time monitoring van de gegevensverzameling en analyse van de resultaten.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle verzameling van hoogwaardige diffractiegegevens van menselijke GCSH-kristallen.
- Geautomatiseerde verwerking leverde een elektronendichtheidskaart met een hoge resolutie op.
- Identificatie van structurele verschillen tussen menselijke en runder-GCSH.
- Aantoonbaarheid van de effectiviteit van geautomatiseerde workflows in de kristallografie.
Conclusies
- Automatisering in gegevensverzameling democratiseert de toegang tot de kristallografie.
- Kleinere laboratoria kunnen nu complexe projecten uitvoeren die voorheen beperkt waren tot grotere faciliteiten.
- Het aanpassen van experimentele parameters kan de efficiëntie van de gegevensverzameling verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Volledig geautomatiseerde synchrotron-beamlines verminderen de noodzaak van handmatige interventies in de macromoleculaire kristallografie, waardoor high-throughput screening en datacollectie van zwak diffracterende kristallen mogelijk worden. Deze automatisering verbetert de datakwaliteit en doorvoer, waardoor biopharma R&D-teams hun wetenschappelijke inspanningen kunnen richten op targetvalidatie en lead-optimalisatie in plaats van op de bediening van de beamline. De technologie democratiseert de toegang tot de structurele biologie en ondersteunt het vroegtijdig verminderen van risico's bij therapeutische targets door middel van betrouwbare 3D-structurele inzichten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door structurele gegevens met een hoge resolutie van biologische macromoleculen te leveren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via geautomatiseerde karakterisering en gegevensverzameling uit kristallisatieproeven.
- Predictieve waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetmodellen door consistente, hoogwaardige elektronendichtheidskaarten te leveren voor structure-guided design.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde kristalsystemen voor voor downstream-workflows door het automatiseren van het monteren, centreren en de diffractieanalyse.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid via vooraf gedefinieerde workflows en realtime monitoring via ISPyB.
- Schaalbaarheid: Maakt screening van grote aantallen kristallen en hergebruik van geautomatiseerde pipelines over verschillende projecten mogelijk.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt structurele gegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie door betrouwbare modellen te bieden voor mechanistische studies.
- Risicogebaseerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door structurele verschillen tussen soortvarianten te identificeren, zoals humane en bovine GCSH.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt bindingsplaatsen en flexibiliteit, wat helpt bij de interpretatie van structuur-activiteitsrelaties.
Integratie van Pipeline & Workflow
De geautomatiseerde beamline is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, en ondersteunt de generatie van gegevens voor downstream analytics en modellering.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten en pathway-verduidelijking door het oplossen van kristalstructuren van eiwitten en complexen.
- Screening: Levert assay-ready systemen met kwantitatieve output zoals resolutie, volledigheid en multipliciteit voor betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Biedt meetbare read-outs, waaronder R-work- en R-free-waarden, resolutie-cut-offs en elektronendichtheidskaarten om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt structurele inzichten met preklinische continuïteit door soortspecifieke modelverfijning mogelijk te maken, zoals aangetoond met GCSH.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar platform voor structurele screening over meerdere targets, waardoor de afhankelijkheid van locatie-specifieke expertise wordt verminderd.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid van doelmodellen, vermindering van mechanistische ambiguïteit en ondersteuning van structuurgebaseerd geneesmiddelontwerp.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van gegevensverzameling over verschillende monsters en projecten.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie door verminderde personeelsbezetting van de beamline en verlaagd biologisch risico bij de selectie van lead-verbindingen.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van structurele betrouwbaarheid en metrieken voor datakwaliteit.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in eiwitkristallografie en monsterpreparatie is vereist voor succesvolle kristalmontage en karakterisering.
- Toegang tot synchrotronfaciliteiten en instrumentatie, zoals de Massive one beamline, is essentieel voor geautomatiseerde gegevensverzameling.
- Standaardisatie tussen teams vereist consistent gebruik van ISPyB voor het bijhouden van experimenten, de selectie van workflows en het ophalen van resultaten.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen omvat het bijstellen van parameters zoals resolutiedrempels, ruimtegroep en stralingsgevoeligheid op basis van de kristaleigenschappen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van cryogekoelde monsters en de afhankelijkheid van de kristalkwaliteit, wat de succespercentages van geautomatiseerde workflows beïnvloedt.
