Een real-time potentie test voor Chimerische antigeen receptor T-cellen gericht op vaste en hematologische kankercellen

xCELLigence real-time celanalyse stelt u in staat om het doden van kankercellen kwantitatief te controleren door immuuncellen onder labelvrije omstandigheden en in de loop van meerdere dagen. Dit systeem biedt een volledige tijd cursus van doel kanker cel doden waardoor de gelijktijdige screening van een groot aantal constructies, effector celtypes, of combinatie therapieën bij lage effector-doelratio's. Begin met het zaaien van 1,5 keer 10 tot de zeven HEK293FT cellen in DMEM cultuurmedium in een 150 milliliter celkweekschotel voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide met vochtigheid.

Meng de volgende ochtend 2,5 milliliter transfectieverdunningsoplossing aangevuld met vijf microgram lentivirale vectorplasmide DNA en 22,5 microgram lentivirale verpakkingsmix met 82,5 microliter transfection reagens in 2,5 milliliter transfectieverdunningsoplossing. Na een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur breng je de reactiedruppel verstandig over in de schotel van HEK293FT-cellen en breng je de cellen terug naar de couveuse voor een tweede nachtelijke incubatie. De volgende ochtend, vervang de supernatant met 19 milliliter verse DMEM cultuur medium en de cellen terug te keren naar de incubator 's nachts.

Verzamel de supernatant in een enkele 50 milliliter conische buis voor vier graden Celsius opslag voor de komende twee dagen voor het sedimenteren van het lentivirus door centrifugatie op de tweede ochtend om alle cellen of puin te verwijderen uit de oplossing. Breng alles behalve ongeveer een milliliter van het lentivirus met supernatant over naar een ultraheldere centrifugebuis voor ultracentrifugatie. Na ultracentrifugatie, voorzichtig aanzuigen van het resterende virus met supernatant, voorzichtig voeg 100 microliters van DMEM aan de pellet, en plaats de buis op ijs gedurende 15 minuten.

Meng aan het einde van de incubatie de oplossing voorzichtig en lijd de lentivirusoplossing in voorgekoelde steriele buizen voor opslag bij min 80 graden Celsius. Bepaal vervolgens de titer van het lentivirus door middel van kwantitatieve RT-PCR volgens de instructies van de fabrikant. Voor car-t cel generatie en uitbreiding, activeer een tot twee keer 10 tot de zes perifere bloed mononucleaire cellen in een milliliter van CAR-T cel medium met een gelijk aantal CD3/CD28 gecoate microbeads in een put van een 24-well plaat in de celcultuur incubator voor 24 uur.

De volgende twee ochtenden, meng een microliter van transductie versterker agent met de cellen, gevolgd door de toevoeging van lentivirus bij een veelheid van infectie van vijf tot een. Monitor de T-cel groei om de twee tot drie dagen toe te voegen verse CAR-T cel medium als nodig is om de cellen te handhaven op een een tot twee keer 10 tot de zes cellen per milliliter concentratie. Om T-cel CAR-expressie door stroomcytometrie te detecteren, breng je drie keer 10 over naar de vijfde CAR- en niet-doorgezette T-cellen in afzonderlijke 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.

Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellets in 200 microliters van FACS buffer aangevuld met 1% menselijk serum. Splits elk celmonster in 100 microliter aliquots in individuele vijf milliliter polystyreen FACS buizen op ijs. Voeg na vijf minuten één microliter biotinylated FAB2-fragmenten van geitantimuis FAB2 toe aan één buis van elk celtype en twee microliters met PE-gelabelde anti-tag antilichaam aan de andere buis van elk celtype met grondig mengen.

Na 30 minuten op ijs, was de cellen met drie milliliter verse FACS buffer en na centrifugeren decanteren de supernatants. Resuspend de pellets in de resterende supernatant en voeg twee microliters van APC anti-CD3 en twee microliters van 7-AAD aan elke buis. Voeg een microliter van PE-gelabelde Streptavidin met korte menging aan de buis gekleurd met anti-FAB2 antilichaam en incubeer alle buizen op ijs gedurende 30 minuten.

Analyseer aan het einde van de incubatie de cellen door flow cytometrie volgens standaardprotocollen die de T-cellen vernevelen door voorwaartse spreiding versus zijverstrooiing en CD3 versus 7-AAD-expressie. Voor een real-time cytolyse potentie test, voeg 50 tot 100 microliter van doelcel cultuur medium aan elke put van een e-plaat en meet de achtergrond impedantie in een cel analyzer instrument. Detecteer het doel kankercellen van de cultuur plaat met behulp van trypsine.

Was de cellen in 15 milliliter vers kweekmedium en centrifuge. Resuspend de kankercelpellet in vijf milliliter vers medium voor het tellen en pas de celdichtheid aan de juiste concentratie van de doelcel aan. Voeg de cellen toe aan het juiste aantal putten en laat de e-plaat gedurende 30 minuten op kamertemperatuur zodat de cellen zich gelijkmatig op de bodem van de putten kunnen vestigen.

Plaats de plaat aan het einde van de evenwichtsperiode in de real-time celanalyzer en start de impedantie automatisch om de 15 minuten 's nachts. De hechting en proliferatie van de doelcellen kunnen in realtime worden gevolgd. De volgende ochtend verdun de effector CAR en controleer T-cellen tot de juiste concentratie in afzonderlijke buizen en verwijder 50 tot 100 microliter uit elke put van de e-plaat, zodat het uiteindelijke volume in elke put 100 microliter is.

Vervolgens, zaad de effector en controle T-cellen in de juiste putten op de juiste effector tot doel verhoudingen in 100 microliter van medium per put. Vervolgens de e-plaat 30 minuten op kamertemperatuur in evenwicht brengen voordat u de plaat terugbreedt naar het celanalyzersysteem. Om de werkzaamheid van de T-cel bemiddelde doden van de doelgroep kankercellen te meten, controleer de CAR-T gemedieerde doden gedurende 96 uur.

Ongeveer 50% van de CAR-T cellen gekleurd positief voor anti-single chain variabele fragment antilichaam wat de expressie van CAR in ongeveer 50% van de T-cellen. In dit representatieve experiment werd voor alle groepen een effector-één effector-doelratio gebruikt. Raji cellen alleen en CD22-CAR T cel behandeld Raji cellen weergegeven significante doden in vergelijking met de controle T-cel alleen en Mock CAR-T cel groepen.

In dit experiment waren alleen de CD47-CAR-T cellen effectief in het doden van de alvleesklierkankercellen. Verder was het impedantiesignaal van de CD47-CAR-T cellen alleen al slechts iets boven het signaal van de celindex gemeten in de medium alleen putten die aangeven dat het impedantiesignaal als gevolg van suspensiecellen zoals CAR-T-cellen minimaal is en niet bijdraagt aan het algehele impedantiesignaal wanneer CAR-T-cellen worden toegevoegd aan de doelkankercellen. Met name, de GITR co-stimulatie domein werd waargenomen effectiever in het verbeteren van CAR-T cel doden tegen epitheliale groeifactor receptor positieve doelcellen in vergelijking met de oorspronkelijke CAR constructen zonder de GITR domein.

Het medium uit e-plate putten kan worden verzameld om het cytokineprofiel op tijdstippen te analyseren tijdens of na de test volgens de behoeften van het experiment. Over het algemeen heeft xCELLigence de efficiëntie verbeterd van het evalueren van de potentie van diverse immunotherapieën, variërend van bispecifieke T-celin engagers en oncolytische virussen tot immuuncontrolepuntremmers in combinatietherapieën.