Name: Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Leer een methode om nano-emulsies van oleïnezuur-platina(II) te synthetiseren met KYF-tripeptide-stabilisatie voor kankertherapie. Deze aanpak verbetert de afgifte van cisplatine en toont veelbelovende resultaten bij eierstokkanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken financiële steun van de National Cancer Institute, verlenen SC2CA206194. Geen concurrerende financiële belangen worden gedeclareerd.

1. synthese van de geconjugeerde oliezuurgehalte Acids–Platinum(II)
<ol><li>Activering van cisplatine<ol>
<li>Schorten 50 mg (0.167 mmol) cisplatine in 4 mL water (bijvoorbeeld nanopure) bij 60 ° C.</li>
		<li>Voeg dropwise 55.2 mg (0.325 mmol) van AgNO3 in 0,5 mL water aan de oplossing van cisplatine en roer de reactie voor ten minste 2 uur bij 60 ° C. Het witte neerslag van AgCl zal vormen die de voortgang van de reactie aangeeft.</li>
		<li>Om te bepalen als de reactie van de activering is voltooid, het uitvoeren van de test met 10% HCl op de aanwezigheid van gratis Ag+ -ion in oplossing. De test moet negatieve (geen extra AgCl neerslag moet uitmaken).</li>
		<li>Centrifugeer het reactiemengsel bij 3220 x g gedurende 10 minuten en verwijder het witte neerslag van AgCl.</li>
		<li>De bovendrijvende vloeistof verzamelen en filteren via een 0,2 mm spuit filter. Test het supernatant op de aanwezigheid van platina door toepassing van 2-3 druppels van de oplossing via de Pipet van Pasteur op SnCl2 kristallen. De test is positief als de kleur van de coördinaat complex van tin met platina donker geel/oranje is.</li>
		<li>Gebruik het supernatant met geactiveerde Pt(II) voor de tweede stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reactie van oliezuur met geactiveerde Pt(II)<ol>
<li>Schorten 94.2 mg oliezuur (0.333 mmol) in 3 mL water bij 60 ° C.</li>
		<li>Toevoegen van 13,3 mg (0.333 mmol) van NaOH in 1 mL water en meng met de oplossing van geactiveerde Pt(II) uit stap 1.1</li>
		<li>Roer de reactie voor 2 h bij 60 ° C en daarna op kamertemperatuur 's nachts. Het ruwe product is een olieachtige bruin/geel neerslag.</li>
		<li>Centrifugeer het reactiemengsel bij 3220 x g gedurende 10 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Droog het ruwe product bij 25 ° C met een rotatieverdamper. Het zuiveren van het product door meerdere wasbeurten met acetonitril. De uiteindelijke kleur van pure oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde is lichtgeel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. synthese van KYF-Pt-NE, en de FITC-label Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>Synthese van de KYF-tripeptide en de fluorescently geëtiketteerde tripeptide FITC-KYF<ol>
<li>De KYF met behulp van standaard solid-state peptide chemistry synthetiseren. Gebruik de volgende standaard koppeling voorwaarden om te koppelen van elk aminozuur: Wang hars (2.19 mmol), het aminozuur Fmoc beschermd (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Zilvertetrafluorboraat (TBTU) (4.38 mmol) en diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Los van de aminozuren met TBTU in dimethylformamide (DMF) en DIPEA.</li>
		<li>Geniet van 5,7 g Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol hars (0.382 milli-equivalent/g) in 25 mL DMF voor 1 h voorafgaand aan gebruik.</li>
		<li>DEPROTECT de amine-groep van het aminozuur L-fenylalanine met 15 mL 20% piperidine/DMF oplossing voor 5 min, ontdoen van het oplosmiddel en herhaal het wassen met 20 min cyclus.</li>
		<li>Wassen van de hars voor 1 min met de volgende oplosmiddelen: DMF, isopropyl alcohol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Gooi het oplosmiddel na elke wasbeurt.</li>
		<li>Voer de Kaiser-test om te bepalen van de aanwezigheid van vrije NH2 groep op de hars uit (Zie substeps) en als positief (het zaad van de hars is paars), toevoegen het aminozuur Fmoc-L-tyrosine en de koppeling uit te voeren 's nachts.<ol>
<li>Bereiden Kaiser testoplossingen in afzonderlijke flessen.</li>
			<li>Los 5 g ninhydrine in 100 mL ethanol.</li>
			<li>Los 80 g van fenol in 20 mL ethanol.</li>
			<li>Meng 2 mL van 0,001 M waterige oplossing van kaliumcyanide met 98 milliliters pyridine.</li>
			<li>Voeg 2-3 druppels van elk Kaiser test oplossingen voor de monster- en warmteproductie in kokend water gedurende 5 minuten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na succesvolle koppeling van tweede aminozuur, het uitvoeren van de Kaiser-test en als negatieve met deprotection protocol (stappen 2.1.3 aan 2.1.5 doorgaat). Herhaal het proces met het aminozuur fenylalanine-Fmoc.<ol>
<li>Wassen op de koppeling van alle aminozuren, de hars voor 1 min met 5 mL DMF, IPA, DMF, methanol, dichloormethaan en diethylether, na elke wasbeurt negeren het oplosmiddel. Sla de hars voor verdere verwerking.</li>
			<li>Gebruik de helft van de hars voor de volgende stappen (2.1.7-2.1.9) te wijzigen van de peptide met FITC. Volg de procedure vanaf 2.1.10 ongewijzigde KYF tripeptide om, te verkrijgen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Het wijzigen van het N-terminaal aminozuur van de KYF tot KYF-N3 met 6-azidohexanoic zuur. Te dien einde, meng 1 g (0.382 mmol) van KYF Wang hars en 120.1 mg (0.764 mmol) 6-azidohexanoic zuur met 245.2 mg (0.764 mmol) van TBTU en 197.1 mg (1.528 mmol) DIPEA in 30 mL DMF. Roer de reactie 's nachts bij kamertemperatuur.</li>
		<li>De KYF-FITC verkrijgen bij de synthese van de KYF-N3 met propargyl fluoresceïne via een klik op reactie. Te dien einde, meng 253 mg (0.097 mmol) van de KYF-N3 Wang hars met 3.78 mg (0.019 mmol) CuI solide, 71.9 mg (0.193 mmol) propargyl fluoresceïne en 2.24 mg (0.017 mmol) van DIPEA. De reactie moet wijzigen kleur van groen naar bruin.</li>
		<li>Na 24u, door het hars voor 1 min afwisselend met 5 mL DMF en IPA vijf keer, methanol en water driemaal, DMF en driemaal, water en met dichloormethaan en diethylether driemaal te wassen. Gooi het oplosmiddel na elke wasbeurt.</li>
		<li>Klieven van de KYF-FITC of KYF peptide uit de hars met een oplossing van trifluorazijnzuur (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) /H2O op de verhouding van de 95/2.5/2.5 meer dan 3 uur.</li>
		<li>Het neerslaan van de ruwe peptide in een koude diethylether, wassen driemaal met koude ether, en vervolgens droog onder het vacuüm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthese van FITC-KYF-gestabiliseerde nanoemulsion met Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) en KYF-Pt-NE<ol>
<li>Los 10 mg (0.0126 mmol) van oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde in 1,5 mL isopropanol en breng dit in een 5 mL spuit.</li>
		<li>Plaats de injectiespuit met oliezuurgehalte acids–Pt(II) geconjugeerde in een spuitpomp en de stroom ingesteld op 0,1 mL/min.</li>
		<li>Om de FITC-KYF-Pt-NE synthetiseren, los 1 mg (0.00105 mmol) van FITC-KYF en 1 mg (0.00219 mmol) van KYF (de molaire verhouding 1:2 van de FITC-KYF:KYF) in 20 mL water en aanpassen van de temperatuur van de oplossing tot 37 ° C. Betrekking hebben op de muren van de container met aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching van de FITC-fluorophore. Om de KYF-Pt-NE synthetiseren, 2 mg (0.0044 mmol) los van KYF tripeptide in 20 mL water en aanpassen van de temperatuur van de oplossing tot 37 ° C.</li>
		<li>De geconjugeerde oliezuurgehalte acids–Pt(II) ontkleuring aan de oplossing van de FITC-KYF/KYF of KYF-tripeptide toevoegen. Voer deze stap onder de motorkap.</li>
		<li>Roer de oplossing om 's nachts bij kamertemperatuur kunnen organische oplosmiddelen verdampen en kunnen de zelf-assemblage van FITC-KYF-Pt-NE of KYF-Pt-NE.</li>
		<li>De FITC-KYF-Pt-NE of KYF-Pt-NE concentreren in een centrifugaal concentrator (10k MWCO), en wassen driemaal met 4 mL van het nanopure water.</li>
		<li>Opslaan van de waterige oplossingen van KYF-Pt-NE en FITC-KYF-Pt-NE bij 4 ° C.</li>
		<li>Analyseren voor platina inhoud met behulp van atomaire absorptie spectroscopie (AAS), na de fabrikant gids48.<ol>
<li>Platina normen in 10% HCl-oplossing te bereiden voor de ijkcurve (effectieve bereik voor AAS ligt tussen 100 tot 1.200 ppb (deeltjes per miljard)).</li>
			<li>Los 50 µL van KYF-Pt-NE oplossing van stap 2.2 in 100 µL van aqua regia (een mengsel van 3:1 van geconcentreerd zoutzuur en salpeterzuur) en laat op kamertemperatuur 's nachts. Voeg 850 µL van water tot een volume van het uiteindelijke monster van 1 mL. Analyseren van het monster met behulp van AAS. De definitieve zuurconcentratie moeten 10% in alle geanalyseerde monsters.</li>
			<li>Noteer de lezing van Pt concentratie in ppb en berekenen van de uiteindelijke platina inhoud in de steekproef (account voor monsterverdunning en eerste volume van nanoemulsion).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. confocal beeldvorming van de cellulaire opname van FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>6 cellijnen van eierstokkanker (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G en ES2), zaad in 4 goed-kamer confocal gerechten op de dichtheid van 4.7 x 104 cellen per kamer, en vooraf cultuur 's nachts bij 37 ° C.</li>
	<li>Na 24 h, het wassen van de cellen driemaal met fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) en incubeer met FITC-KYF-Pt-NE in cel kweekmedium (zie stap 6.1 voor cel lijn specifieke details) gedurende 15 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Na incubatie, verwijder het medium en wassen van de cellen drie keer met PBS.</li>
	<li>Herstellen van de cellen met de koude methanol gedurende 5 minuten bij-20 ° C en was driemaal met 1 mL PBS.</li>
	<li>Permeabilize van de cellen met 1 mL 0,1% Triton-X gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en wassen drie keer met 1 mL PBS.</li>
	<li>Incubeer de cellen gedurende 90 minuten met LAMP1 antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (1 mL) bij 1:50 verdunning in PBS bij kamertemperatuur. Vervolgens wassen de cellen 3 keer met PBS.</li>
	<li>Verdun DAPI stockoplossing (1 mg/mL) tot 1 mg/mL in PBS. Vervolgens 1 mL van de verdunde oplossing toevoegen aan elke kamer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de cellen 3 keer met PBS.</li>
	<li>Mount coverslips op een dia met behulp van montage medium.</li>
	<li>Afbeelding van de cellen met behulp van levende cellen confocal microscoop bij excitatie golflengte van 405 nm, 488 nm en 633 nm. Stel de detectie-parameters als volgt: laser vermogen van 0,2% en niet meer dan 1%, Pinole 1 luchtige eenheid, krijgen meester 650-750, digitaal offset 0.</li>
	<li>Afbeelding openen in beeldbewerkingssoftware. Onder de afbeelding van de weergegeven, selecteert u afbeeldingen en selecteer Invoegen schaal Bar, de bar van de schaal naar de afbeelding invoegen.</li>
</ol>4. drug Release Studies
<ol><li>De drug release studies in PBS verrichten. De pH-waarden van drie PBS buffers 7.4, 6,8 en 5.0 respectievelijk aanpassen.</li>
	<li>Verdun 5 μL van KYF-Pt-NE in 180 μL van de juiste pH PBS buffer, transfer naar 3,5 kDa MWCO mini dialyse cup en Incubeer bij 37 ° C in PBS.</li>
	<li>Buffer te verwijderen van elk drie mini dialyse buizen op 2, 4, 6, 24, 48 en 140 h en meten van de platina concentraties door AAS. Alle monsters volgens stap 2.2.8 bereiden maar het uiteindelijke volume van het monster tot 500 µL.</li>
</ol>5. cel kweekmethoden
<ol><li>Cultuur cel lijnen A2780 CP70 SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 cel kweekmedium (DMEM) met 10% (A2780, CP70 SKOV-3, ES-2) of met 15% (TOV - 21G, OV-90) foetale runderserum (FBS), aangevuld met L-Glutamine en penicilline/streptomycine. Groeien alle cellen in een 5% CO2, water verzadigde atmosfeer bij 37 ° C.</li>
	<li>Zaad 3 x 105 cellen in elke 96-wells-plaat en pre cultuur 's nachts voor in vitro incubatie experimenten. De KYF-Pt-NE, cisplatine en carboplatin oplossingen in water voor te bereiden. Aanpassen van de concentratie van Pt(II) in KYF-Pt-NE aan de concentratie van carboplatin en cisplatine voor elke regel van de cel. Incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Na incubatie, evalueren van de cellulaire levensvatbaarheid met behulp van een colorimetrische bepaling (de bepaling van MTT celproliferatie). Kort, medium verwijderen en toevoegen van 110 μL van 10% MTT op middellange tot elk goed en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C. Dan 100 μl wasmiddel toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Controleer de extinctie bij 570 nm met behulp van-afleesapparaat. Analyseer de resultaten met behulp van statistische analyse met Z- en P-test.</li>
</ol>

Auteurs hebben niet een belangenconflict openbaar te maken.

Kritische stappen in de nanoemulsion synthese omvatten aanpassing van de molaire verhouding van de substraten, temperatuur en debiet tarief controle houden tijdens oliezuurgehalte acids–Pt(II) toevoeging bieden voldoende tijd voor zelf-assemblage en zuiveren met behulp van het product een Centrifugaal concentrator kolom. Deze parameters invloed op de grootte en morfologie van de KYF-Pt-NE; het is dus belangrijk de juiste molaire verhouding te handhaven en de synthetische voorwaarden correct aan te passen.
<p class="j...

In de afgelopen jaren is er een groeiende interesse in de engineering van nanodeeltjes voor biomedische toepassingen zoals drug delivery en bioimaging1,,2,,3,4. De multifunctionaliteit van de nanoparticle gebaseerde systemen vereist vaak meerdere componenten binnen een formulering opnemen. De bouwstenen die zijn gebaseerd op lipiden of polymeren vaak verschillen in hun fysisch-chemische eigenschappen alsmede hun biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid, die uiteindelijk gevolgen voor de functie van de nanostructuur1, hebben kan 5,6. Biologisch afgeleide materialen, zoals eiwitten en peptiden, hebben lang erkend als veelbelovende onderdelen van multifunctionele nanostructuren vanwege hun volgorde flexibiliteit7,8. Peptiden zelf monteren in zeer geordende supramoleculaire platforms vormen spiraalvormige ribbons9,10, vezelig steigers11,12, en nog veel meer, dus de weg effent naar gebouw Biomolecuul gebaseerde hybride nanostructuren met behulp van een bottom-up aanpak13.
Peptiden werden onderzocht voor toepassingen in geneeskunde en biotechnologie, met name voor de antikanker therapie14 en vaatziekten15 alsook wat betreft de antibiotica ontwikkeling16,17, metabole aandoeningen18en19van de infecties. Er zijn meer dan honderd van kleine-peptide therapeutics klinische proeven20ondergaan. Peptiden zijn eenvoudig aan te passen en snel te synthetiseren tegen lage kosten. Daarnaast zijn ze biologisch afbreekbaar, die sterk vergemakkelijkt hun biologische en farmaceutische toepassingen21,22. Het gebruik van peptiden als structurele componenten omvat de engineering van responsieve, peptide gebaseerde nanodeeltjes en hydrogel depots voor gecontroleerde afgifte23,24,25,26 , 27, peptide gebaseerde biosensoren28,29,30,31of bio-elektronische apparaten32,33,34. Nog belangrijker is, zelfs korte peptides met twee of drie aminozuur residuen die fenylalanine bevatten bleken te begeleiden de zelf-assemblage processen35,36,,37 en maken van gestabiliseerde emulsies38 .
Platina gebaseerde drugs, vanwege hun hoge doeltreffendheid, worden gebruikt in vele kanker behandeling regimes, zowel alleen als in combinatie met andere agentia39,40. Platina verbindingen veroorzaken schade van DNA door de vorming van kruisverbindingen van monoadducts en intrastrand of interstrand. De Pt-DNA laesies worden herkend door de mobiele machine en, als niet gerepareerd, leiden tot cellulaire apoptosis. Het belangrijkste mechanisme, door die Pt(II) draagt bij aan de dood van de cel van de kanker, is de remming van de DNA transcriptie41,42. Echter worden de voordelen van platinum therapie verminderd door de systemische toxiciteit van Pt(II) die als trigger fungeert van ernstige bijwerkingen. Dit leidt tot lagere klinische doseren van Pt(II)43, wat vaak resulteert in sub therapeutische concentraties van platina bereiken van het DNA. Dientengevolge, bijdraagt de DNA-reparatie die volgt aan de overleving van de cel van de kanker en het verwerven van Pt(II) weerstand. De platina chemo-resistentie is een groot probleem in antikanker therapie en de belangrijkste oorzaak van44,45van de mislukking van de behandeling.
We hebben een stabiele nanosystem die de Pt(II) agent kapselt om te zorgen voor een beschermend effect in de systemische circulatie en vermindert de bijwerkingen Pt II-geïnduceerde ontwikkeld. Het systeem is gebaseerd op een oliezuurgehalte acids-Pt(II) kern gestabiliseerd met een KYF-tripeptide te vormen van een nanoemulsion (KYF-Pt-NE)-46. De bouwstenen van KYF-Pt-NE, de aminozuren van de tripeptide evenals de oliezuur, hebben de status van de over het algemeen erkend als Safe (GRAS) met Food and Drug Administration (FDA). De KYF-Pt-NE is bereid met behulp van een nanoprecipitation methode47. Kortom, is de geconjugeerde oliezuurgehalte acids-Pt(II) opgelost in een organisch oplosmiddel en vervolgens ontkleuring toegevoegd aan een waterige oplossing van de KYF (Figuur 1) bij 37 ° C. De oplossing wordt bewogen gedurende enkele uren om zelf-assemblage van de KYF-Pt-NE. De nanoemulsion is geconcentreerd in 10 kDa centrifugaal concentrators en drie keer gewassen met water. De chemische modificatie van de KYF met een fluorophore kunt de synthese van fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE geschikt voor biomedische beeldbewerking.

<table><tbody><tr><td>2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU)</td><td>ANASPEC INC.:</td><td>AS-20376</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>4-well chamber confocal dish</td><td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>6-bromohexanoic acid</td><td>Chem-Impex INT&rsquo;L INC.</td><td>24477</td><td>Click modificatie voor peptide</td></tr><tr><td>A2780</td><td>Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital</td><td></td><td>Ovariaal kankercel lijn</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure</td><td>Thermo Fisher</td><td>D11901</td><td>waterfiltratie systeem</td></tr><tr><td>BUCHI rotavapor R-3</td><td>Buchi</td><td>Z568090</td><td>Voor verwijdering van oplosmiddelen en het drogen van monsters</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811F</td><td>Voor scheiding van platina complexen</td></tr><tr><td>Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>in vitro tests</td></tr><tr><td>CP70</td><td>Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital</td><td></td><td>Ovariaal kankercel lijn</td></tr><tr><td>Digital water bath</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>Voor het opwarmen van media voor celcultuur</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>Voor metingen van de grootte van nanodeeltjes</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>ovariaal kankercel lijn</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79%</td><td>Chem-Impex INT&rsquo;L INC.</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g),</td><td>Chem-Impex INT&rsquo;L INC.</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>HERACELL 150i CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td></td><td>incubator</td></tr><tr><td>High pressure syringe pump</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>Voor toevoeging van platina complexen in de synthese van nanodeeltjes</td></tr><tr><td>Hotplate/roerder</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Voor het roeren en verwarmen van monsters</td></tr><tr><td>LAMP-1 Antilichaam (geconjugeerd met Alexa Fluor 647)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>005027</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Ninhydrine 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10409</td><td>Kaiser test</td></tr><tr><td>Oleïnezuur</td><td>Chem-Impex INT&rsquo;L INC.</td><td>01421</td><td>Voor platina complex synthese</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>Ovariaal kankercel lijn</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Voor cel wassen</td></tr><tr><td>Permount montage medium</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Kaiser test</td></tr><tr><td>Fosforwolfraamzuur</td><td>Fisher Chemical</td><td>A248-25</td><td>negatieve kleuring voor TEM</td></tr><tr><td>Piperidine 99%</td><td>BTC</td><td>219260-2.5L</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Platinum AAS standaard oplossing</td><td>Alfa Aesar</td><td>88086</td><td>1000ug/ml voor calibratiecurve</td></tr><tr><td>Propargyl bromide 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>Voor alkyn modificatie van fluoresceine</td></tr><tr><td>Wetenschappelijke biologische kast</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Bio-hood voor celcultuur</td></tr><tr><td>Zelfreinigende vacuüm systeem</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>Vacuumpomp voor rotavapor</td></tr><tr><td>Zilvernitraat</td><td>Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>Cisplatin activering</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Ovariaal kankercel lijn</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>Voor platina complex synthese</td></tr><tr><td>Tin (II) chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208256</td><td>Test voor platina aanwezigheid</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>Ovariaal kankercel lijn</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur 99% (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan (TIPS)</td><td>Chem-Impex INT&rsquo;L INC.</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Uranine poeder 40%</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25328A</td><td>Voor alkyn modificatie van fluoresceine</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td><td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>Voor Nanoparticle wassen en condensatie</td></tr><tr><td>VWR Inverted Microscoop</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>Voor celcultuur monitoring</td></tr></tbody></table>

een tripeptide-gestabiliseerde nanoemulsion van oliezuur

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Beschrijven we een methode voor de productie van een nanoemulsion samengesteld uit een oliezuurgehalte acids-Pt(II) kern en een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). De KYF-Pt-NE Pt(II) kapselt op 10 pm %, heeft een diameter van 107 ± 27 nm en een negatieve lading van de oppervlakte. De KYF-Pt-NE is stabiel in water en in serum, en biologisch actief is. De vervoeging van een fluorophore te KYF kunt de synthese van een fluorescerende nanoemulsion die geschikt is voor biologische beeldvorming. De synthese van de nanoemulsion wordt uitgevoerd in een waterige omgeving, en de vormen van de KYF-Pt-NE via zelf-assemblage van een korte KYF peptide en een conjugaat oliezuurgehalte acids-platinum(II). De zelf-assemblage proces hangt af van de temperatuur van de oplossing, de molaire verhouding van de substraten, en het debiet van de toevoeging van het substraat. Cruciale stappen omvatten handhaven van de optimale roeren tarief tijdens de synthese toelaat voldoende tijd voor zelf-assemblage en de nanoemulsion vooraf geleidelijk te concentreren in een centrifugaal concentrator.

Vertegenwoordiger TEM afbeelding van KYF-Pt-NE opgesteld op basis van dit protocol wordt getoond in figuur 2A. De KYF-Pt-NEs zijn bolvormig in morfologie, goed verspreid, en uniform in grootte. De kerndiameter van de KYF-Pt-NEs, gemeten vanuit drie TEM beelden met een minimum van 200 metingen gedaan, is 107 ± 27 nm. De hydrodynamische diameter van KYF-Pt-NE, geanalyseerd met behulp van dynamische lichte spectroscopie (DLS), bleek te zijn 240 nm met een polydi...

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om een nanoemulsion voor een oliezuurgehalte acids-platinum(II) conjugate gestabiliseerd met een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF)-tripeptide synthetiseren. De nanoemulsion vormen onder zachte synthetische voorwaarden via zelf-assemblage van de KYF en de geconjugeerde.

Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Gezien het brede scala van korte peptide sequenties, kan deze methode worden uitgebreid tot vele andere nanodeeltjes ontwerpen. Peptide modificatie kan het systeem geschikt maken voor diagnostische doeleinden. Het inkapselen van anti-kanker platina aan geneesmiddelen met biologisch afbreekbare, lage toxiciteit stabiliserende agent is zeer relevant voor farmaceutische toepassingen.Voorlopige in-vivo studies met eierstokkanker zijn veelbelovend en zullen verder worden onderzocht. Om te beginnen, schort 50 milligram cisplatine in vier milliliter ultra-zuiver water op 60 graden Celsius. Voeg de zilvernitraatoplossing druppelgewijs toe aan de cisplatineoplossing en roer het mengsel bij 300 tot 400 RPM gedurende twee uur bij 60 graden Celsius in het donker.Gebruik daarna 10% zoutzuur in gewicht om te bevestigen dat er geen vrije zilverionen in de oplossing zijn. Als er geen extra zilverchloride ontstaat bij het toevoegen van zoutzuur, centrifugeer het mengsel op 3, 220 keer de zwaartekracht gedurende 10 minuten. Decanteer de supernatant en filter het door een spuitfilter van 0,2 micrometer.Test vervolgens het filtraat op platina door twee tot drie druppels toe te passen op 10 twee chloridekristallen. Platina is aanwezig als de vering donkerbruin of oranje wordt. Voeg vervolgens 13,3 milligram natriumhydroxide in één milliliter water toe in 94,2 milligram suspensie van oliezuur in drie milliliter water bij 60 graden Celsius.Roer het mengsel gedurende twee uur op 60 graden Celsius. Zet vervolgens het vuur uit en blijf 16 tot 24 uur roeren bij kamertemperatuur om het ruwe product te verkrijgen als een olieachtige, geelbruine neerslag. Centrifugeren het reactiemengsel bij 3, 220 keer zwaartekracht gedurende 10 minuten, en verwijder de supernatant.Droog de producten op een roterende verdamper op 25 graden Celsius. Schorst het ruwe product in vijf milliliter acetonitril door het product te laten vortexen en terug te winnen door middel van centrifugatie. Herhaal dit wasproces minstens twee keer nog minstens twee keer om de zuivere, oliezuur platina II conjugaat als een lichtgele vaste stof te verkrijgen.Eerst, weken 5,7 gram fmoc beschermde L-fenylalanine gefunctionaliseerd Wang hars in 25 milliliter dimethylformamide gedurende een uur. Dan, weken de hars in 15 milliliter van 20%piperidine in DMF gedurende vijf minuten, terwijl schudden op 80 RPM om de-bescherming van de amine. Giet de hars af en herhaal de de-bescherming gedurende 20 minuten.Was de hars daarna met DMF en isopropylalcohol. Zodra de bescherming is bevestigd, voeg fmoc beschermde L-tyrosine TBTU en DIPEA en roer het mengsel gedurende 16 tot 24 uur om koppeling uit te voeren. Was hars met DMF en isopropyl alcohol.Voer Kaiser-test uit en ga verder met de-bescherming en was zoals eerder beschreven. Paar en de-protect Fmoc beschermde lysine op dezelfde manier. Was de hars met DMF, IPA, methanol, dichloormethaan en diethylether daarna.Zet een gram KYF-dragende hars opzij voor FITC modificatie. Week de resterende hars in 95%trifluoroacetisch zuur. 2,5% triisopropylsilane en 2,5% water gedurende drie uur om het tripeptide uit de hars te klemmen.Precipitate de ruwe peptide met diethylether afgekoeld tot 20 graden Celsius. Was het neerslag drie keer door centrifugatie in 30 tot 40 milliliter porties koude diethylether en droog het onder vacuüm. Meng vervolgens de resterende gram KYF hars met 120,1 milligram 6-acetohexanoïnezuur in 30 milliliter DMF met TBTU en DIPEA.Roer het mengsel gedurende 16 tot 24 uur bij kamertemperatuur om de azide gemodificeerde tripeptide te verkrijgen. Combineer vervolgens 253 milligram van deze hars met 3,78 milligram vast koper (I)iodide 71,9 milligram propargyl florisean en 2,24 milligram DIPEA. Laat het mengsel 24 uur lang trillen.Was vervolgens de fitc gemodificeerde KYF-lager hars grondig. Klem de FITC gewijzigde KYF van de hars en zuiver het op dezelfde manier als de ongewijzigde tripeptide. Los om te beginnen met de voorbereiding van de nanoeoulsie, los 10 milligram van het oliezuur platina II conjugaat op in 1,5 milliliter IPA.Trek deze oplossing in een spuit van 5 milliliter, bevestig een naald van 20 meter en monteer de spuit op een spuitpomp over het reactiegebied. Zet de spuitpomp op 0,1 milliliter per minuut. Los voor een nano-mulsie met FITC gemodificeerde KYF één milligram FITC gemodificeerde KYF en één milligram ongewijzigde KYF op in 20 milliliter water.Voor een nano-mulsie met ongewijzigde KYF, in plaats daarvan oplossen van twee milligram KYF in 20 milliliter water. Verwarm de FITC-gemodificeerde of ongewijzigde KYF-oplossing tot 37 graden Celsius. Zorg ervoor dat de KYF-oplossing beweegt bij ongeveer 400 RPM en dat de spuit is uitgelijnd met de oplossing.Dan, start de spuit pomp om te beginnen met het toevoegen van de oliezuur platina twee vervoeging daling verstandig. Zodra de conjugaat is toegevoegd, verlaag de roersnelheid tot 150 RPM en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Blijf roeren gedurende 16 tot 24 uur.Concentreer de nano-concentratie vervolgens in een 10.000 Daltons centrifugaalfiltereenheid. Was de nano-mulsie drie keer in een centrifugaalfiltereenheid met vier milliliter porties ultrazuiver water. En bewaar het dan als een waterige oplossing op vier graden Celsius.Het eindproduct is opalescent voor KYF nanodeeltjes en fluorescerend voor FITC-gemodificeerde nanodeeltjes. De druppels in een nanoemulsie bereid met ongewijzigde KYF waren bolvormig, goed verspreid, en relatief uniform in grootte. Gebaseerd op transmissie elektronenmicroscopie beelden, de kernen waren ongeveer 107 nanometer in diameter.De fitc-gemodificeerde nano-mulsie, die hier in het groen verschijnt, kan cellen van verschillende eierstokkankercellijnen binnenduit. Terwijl de hydrodynamische diameter van beide formuleringen steeg gedurende vier maanden van opslag in water, werden de totale afmetingen bewaard. Bovendien werd geen opsonisatie van de emulsie waargenomen na een dag van incubatie in 20%foetaal runderserum.De release van platina uit de emulsie was het langzaamst bij pH 7.4 met slechts 20,8% van het platina dat na vier uur werd vrijgegeven. De platina release versneld als de pH afgenomen. De platina-bevattende KYF gecoate nanoemulsie verminderde de levensvatbaarheid van deze eierstokkanker cellijnen in een veel grotere mate dan werd bereikt door carboplatine, de klinisch relevante analoge.De nano-mulsie toonde ook een vergelijkbare of grotere vermindering van de levensvatbaarheid dan cisplatine in vijf van de zes cellijnen. De KYF-gecoate nano-mulsie consequent veroorzaakt een vergelijkbare of grotere vermindering van de levensvatbaarheid dan de oliezuur platina II conjugaat alleen. Dit is een eenvoudige, efficiënte methode voor het inkapselen van hydrofobe therapieën binnen tripeptide basis nanodeeltjes steiger.Korte peptiden zijn biologisch afbreekbaar en hebben een lage toxiciteit, wat belangrijk is voor medicijnen en biotechnologie. Voer deze procedure uit onder de rookkap om blootstelling aan organische oplosmiddelen te voorkomen. Platina oliezuur en KYF platina nano-emulsies hebben anti-kanker eigenschappen en moeten daarom met speciale zorg worden behandeld.Deze methode is eenvoudig in termen van lage filabilator activiteit en apparatuur, maar het is afhankelijk van een goede toepassing van de synthesestrategie, en de onderliggende chemische concepten. Onze methode kan worden uitgebreid om andere kleine drugmoleculen te leveren. De nanodeeltjeskern bestaat uit oliezuur en is daarom geschikt voor inkapseling van hydrofobe agentia.

a-tripeptide-stabilized-nanoemulsion-of-oleic-acid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Faseverschuiving nanoemulsions (PSNE) kan worden verdampt met behulp van High Intensity Focused Ultrasound bij plaatselijke verwarming te verbeteren en thermische ablatie in tumoren te verbeteren. In dit rapport wordt de bereiding van stabiele PSNE met een smalle grootteverdeling beschreven. Bovendien is de impact van de verdampte PSNE op echografie-gemedieerde ablatie aangetoond in weefsel-nabootsende fantomen.

Synthese van Phase-shift Nanoemulsions met smalle Grootte Uitkeringen voor akoestische Droplet-verdamping en Bubble-enhanced Ultrasound-gemedieerde Ablation

We beschrijven de productie en karakterisering van nanodeeltjes en microdeeltjes samengesteld uit poly(melkzuur-co-glycolzuur) met behulp van vitamine E-TPGS als emulgator. Door formuleringsparameters zoals de concentratie van emulgator te variëren, is het mogelijk om nanodeeltjes te produceren met gemiddelde diameters variërend van 220 nm tot 1,98 µm.

PLGA-nanodeeltjes gevormd door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS

We rapporteren over een slimme toepassing van koolstofnanobuizen voor de kinetische stabilisatie van lipidedeeltjes die zelf-geassembleerde nanostructuren bevatten in hun kernen. De bereiding van lipidedeeltjes vereist vrij lage concentraties van koolstofnanobuizen, wat hun gebruik mogelijk maakt in biomedische toepassingen zoals geneesmiddelafgifte.

Facile Bereiding van Intern Self-assembled Lipid Particles gestabiliseerd door koolstof nanobuisjes

De belangrijkste stappen van levende anionische polymerisatie van fenylglycidylether (PheGE) met methoxy-polyethyleenglycol (MPEG- -PPheGE b) worden beschreven. Het verkregen blokcopolymeer micellen (BCMS) werden beladen met doxorubicine 14% (gew%) en aanhoudende afgifte van geneesmiddel gedurende 4 dagen onder fysiologisch relevante omstandigheden werd verkregen.

Anionische polymerisatie van een amfifiele copolymeer voor de bereiding van blokcopolymeer micellen gestabiliseerd door π-π stapelen interacties

Om kankermedicijnen met hoge specificiteit en verminderde bijwerkingen naar tumorlocaties te brengen, zijn nieuwe methoden op basis van nanodeeltjes vereist. Hier beschrijven we disulfide-gekruiste micellen die gemakkelijk kunnen worden bereid door waterstofperoxide-gemedieerde oxidatie en die zich efficiënt kunnen dissociëren in een reducerende tumoromgeving om ladingen vrij te geven.

Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen ten opzichte van deze met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van één keten amfifielen. Hier beschrijven we technieken voor de voorbereiding, zuivering, en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van deze amfifielen.

Voorbereiding, zuivering, en het gebruik van vetzuur-bevattende liposomen

Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.

Voorbereiding en karakterisering van Nanoliposomes voor de Entrapment van bioactieve hydrofiele bolvormige eiwitten

Oliën die worden gebruikt voor medicijnafgiftetoepassingen kunnen het lipidenprofiel van patiënten verstoren, wat ongewenst is bij hart- en vaatziekten. Omega-3-vetzurenrijke oliën zijn een gezond alternatief voor conventionele oliën en hebben een enorm potentieel voor zelf-geëmulgeerde medicijnafgiftesystemen.

Zelf-nano-emulgering van gezonde oliën om de oplosbaarheid van lipofiele geneesmiddelen te verbeteren

Om efficiënt adjuvantia rationeel te ontwerpen, ontwikkelden we poly-melkzuur-co-glycolzuur nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE). De PNPE bezat unieke zachtheid en een hydrofobe interface voor krachtig cellulair contact en bood antigeenbelasting met een hoog gehalte, waardoor de cellulaire affiniteit van het afgiftesysteem voor antigeen-presenterende cellen werd verbeterd en efficiënte internalisatie van antigenen werd geïnduceerd.

Cellulaire affiniteit van deeltjesgestabiliseerde emulsie om antigeenintern internalisatie te stimuleren

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

In dit protocol hebben we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur (RA) ontwikkeld dat kan worden gebruikt als adjuvans om antigeenspecifieke systemische en mucosale reacties te bevorderen. Door de door de FDA goedgekeurde RA aan de nano-emulsie toe te voegen, werd antigeenspecifiek sIgA gepromoot in de vagina en dunne darm na intramusculaire injectie van de nano-emulsie.

Kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur als adjuvans ter bevordering van OVA-specifieke systemische en mucosale reacties

Leer een methode om nano-emulsies van oleïnezuur-platina(II) te synthetiseren met KYF-tripeptide-stabilisatie voor kankertherapie. Deze aanpak verbetert de afgifte van cisplatine en toont veelbelovende resultaten bij eierstokkanker.

Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur

Meer video's verkennen