Controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de overleving te controleren op een eencellige basis en identificeren variabelen die aanzienlijk voorspellen celdood of overleving. Conventionele cytotoxiciteitstesten beoordelen populaties cellen en missen het vermogen om individuele cellen te discrimineren. Longitudinale microscopie maakt de toewijzing van het tijdstip van overlijden voor elke cel in een populatie mogelijk.

Deze techniek is zeer geschikt voor het evalueren van nieuwe therapieën voor neurodegeneratieve ziekten en andere aandoeningen. Deze methode heeft bewezen van onschatbare waarde voor het verkennen van ziektemechanismen in neurodegeneratieve aandoeningen, en kan worden toegepast met gelijke werkzaamheid ten opzichte van andere aandoeningen waarin celdood is van belang. Onderzoekers kunnen worstelen met het bereiken van adequate transfectie efficiëntie zonder onnodige toxiciteit.

De praktijk met de multichannel pipet en vertrouwdheid met het protocol moet verminderen deze moeilijkheidsgraad na verloop van tijd. Microscopie is een inherent visuele methodologie. Daarom kan de techniek gemakkelijker worden begrepen door te kijken in aanvulling op het lezen.

Om te beginnen, combineren de juiste hoeveelheid verminderde serum media en transfectie reagens in een buis, en verminderde serum media en DNA in een aparte buis. Broed ze vijf minuten op kamertemperatuur. Combineer vervolgens de inhoud van beide buizen en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

Gebruik een multichannel pipet en steriele plastic troggen om de corticale neuronen twee keer te wassen met 100 microliters neurale basale media per put. En bewaar de geconditioneerde media en andere resterende media op 37 graden Celsius. Vervang de NBM door 100 microliters van eerder voorbereide NBKY oplossing per goed.

Na 20 minuten, pipet 50 microliters van de transfectie reagens en DNA-mengsel dropwise in elke put. Broed de cellen 20 minuten in op 37 graden Celsius. Spoel de cellen twee keer af met nbky-oplossing.

Voeg vervolgens 100 microliter geconditioneerde media en 100 microliter nbc-oplossingen toe aan de putten. Om te beginnen met het beeldvorming van de cellen, plaats de 96 goed plaat op een fluorescerende microscoop. Gebruik een fiduciair teken dat uniek is voor elke plaat als referentie voor toekomstige uitlijning en sla een afbeelding op voor toekomstige referentie.

Navigeer vervolgens naar interessegebieden en noteer hun x- en y-coördinaten ten opzichte van het merk. Gebruik een fiduciair teken dat uniek is voor elke plaat als referentie voor toekomstige uitlijning en sla een afbeelding op voor toekomstige referentie. Tot slot, focus op de doorgetransfecteerde cellen uitdrukken van een fluorescerend label.

Maak meerdere foto's met regelmatig gesprede intervallen in de juiste tl-kanalen. Om te beginnen met het verwerken van afbeeldingen, dubbelklikt u op het Fiji-pictogram. Klik vervolgens op en sleep de afbeelding onder de verwerkingsmacro naar de Fiji-balk om de macro binnen Fiji te openen.

Lijn twee tot en met zeven van de afbeelding aanpassen, wordt de verwerkingsmacro volgens het tekstprotocol weergegeven. Klik vervolgens op stiksels en vervolgens op het raster/de verzameling stiksels. Pas de instellingen in de vervolgkeuzemenu's, het type en de volgorde aan totdat een nauwkeurig gestikte afbeelding wordt geproduceerd.

Pas rastertype en steekvolgordevariabelen in lijnen acht en negen aan volgens deze selecties. Pas vervolgens regel 10 aan om het aantal afbeeldingen per put op te geven en stel de optie achtergrondaftrekking in lijn 14 in op true, indien nodig. Pas regel 15 aan om de straal van de rollende bal in te stellen volgens het tekstprotocol en klik op Uitvoeren.

Ten slotte, open de uitvoer afbeelding stapels en handmatig identificeren van de dode neuronen volgens het tekstprotocol. Neem de gegevens op in een spreadsheetbestand. Als u statistische analyses wilt uitvoeren, dubbelklikt u op het pictogram voor het overleven.

R-script. Markeer regel twee en klik op de run-knop om de overlevingsbibliotheek te laden. Wijzig vervolgens het pad in regel vijf om de invoerspreadsheet aan te roepen en klik op de knop Uitvoeren.

Markeer lijnen acht en negen en klik op de run-knop om de cox proportionele gevarenanalyse uit te voeren. Markeer de lijnen 12 tot en met 16 en 19 tot en met 24. Klik op de run-knop om het cumulatieve risico op overlijden en de overlevingsgegevens als een Kaplan-Meier-curve in kaart te brengen.

In deze studie, rat corticale neuronen werden doorgesch doorgesch doorgeschat op vier dagen na beplating met een plasmide codering van het fluorescerende eiwit M appel. 24 uur na de transfectie, neuronen werden afgebeeld door fluorescentie microscopie elke 24 uur voor 10 opeenvolgende dagen. Na het verwerven van afbeeldingen werden beelden verwerkt en achtereenvolgens onderzocht om de celdood te markeren.

Het tijdstip van overlijden voor elke cel werd bepaald door veranderingen in fluorescentie, morfologie en fragmentatie van het cellichaam. Cox proportionele gevaren analyse uitgevoerd op de overlevingsgegevens van de mutant neuronen resulteerde in een hazard ratio van 2.2. Dit resultaat wees op een sneller sterftepercentage in de gemuteerde neuronen in vergelijking met de wilde typepopulatie.

Het belangrijkste om te onthouden bij een poging deze procedure is om voorzichtig pipet. Het minimaliseren van blootstelling aan lucht en het vermijden van bellen is van cruciaal belang voor een succesvolle transfectie. Na transfectie kan longitudinale fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om verschillende factoren bij te houden die kunnen bijdragen aan celdood, waaronder eiwitlokalisatie, omzet en expressieniveau, naast celoverleving.

Op het gebied van neurodegeneratie heeft de dynamische aard van longitudinale microscopie licht geworpen op de vraag of de aggregatie van ziekte-geassocieerde eiwitten een toxische of beschermende gebeurtenis vertegenwoordigt. Geen van deze reagentia of instrumenten zijn gevaarlijk.