Name: Controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Leer longitudinale fluorescentiemicroscopie om overleving van individuele corticale neuronen te volgen en voorspellers van celdood te identificeren. Deze methode biedt inzicht in neurodegeneratieve mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Steve Finkbeiner en leden van de lab Finkbeiner voor baanbrekende robotic microscopie. Wij danken ook Dan Peisach voor gebouw de eerste software vereist voor beeldverwerking en geautomatiseerde survival analyse. Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en Stroke (NINDS) R01-NS097542, de Universiteit van Michigan Protein Folding ziekte initiatief en Ann Arbor actief tegen ALS.

Alle gewervelde dieren werk werd goedgekeurd door de Commissie op het gebruik en de verzorging van dieren aan de Universiteit van Michigan (protocol # PRO00007096). Experimenten zijn zorgvuldig gepland om te minimaliseren van het aantal dieren geofferd. Zwangere vrouwen wild-type (WT), niet-transgene lange Evans ratten (Rattus norvegicus) zijn afzonderlijk ondergebracht in kamers uitgerust met milieu verrijking en verzorgd door de eenheid voor laboratorium dier geneeskunde (ULAM) aan de Universiteit van Michigan, in komstig de NIH-ondersteunde gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Alle ratten werden gehouden in routine huisvesting voor zo weinig mogelijk voorafgaand aan de euthanasie, conform de aanbevelingen van de richtsnoeren inzake euthanasie van de Amerikaanse veterinaire medische vereniging en de Universiteit van Michigan tijd methoden van euthanasie door Soorten richtsnoeren.
1. materiële voorbereiding
<ol><li>Ontleden van corticale neuronen van embryonale dag die 19 – 20 rat pups en cultuur corticale neuronen op 0,5 x 106 cellen per milliliter op poly-D-lysine gecoate platen voor 4 dagen in vitro, rat zoals eerder beschreven13,14, 15,16,17,18,19.</li>
	<li>Voorbereiden van de plasmide DNA van belang na de stappen door een endotoxine-vrije plasmide DNA isolatie kit (Zie Tabel van materialen). Kwantificeren van de resulterende DNA met een spectrofotometer.</li>
	<li>Bij in vitro dag 4 (DIV4), aliquoot, filter steriliseren en Incubeer de volgende media op 37 ° C: 6 mL verminderd serum media (RSM; bijvoorbeeld., OptiMEM), 25 mL neuronale basale media (NBM), 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic zuur + 10 mM MgCl2, aangepast aan een pH van 7. 4), 10 mL NBC (NBM + 1 x neuronale cel cultuur supplement + 1 x L-glutamine supplement + 1 x Pen Strep). Opmerking: Volumes vermeld zijn voldoende voor transfecting een 96-wells-plaat. Verwijzen naar de Tabel van de materialen voor specifieke reagentia.</li>
</ol>2. de transfectie van Rat corticale neuronen
<ol><li>Het gegeven voorbeeld transfectie blad wijzigen (Zie aanvullende bestand 1) door het aanpassen van de plaat type, plaat, kaart, aantal Ani, DNA-concentratie en aantal wells ("groene dozen"). Opmerking: Het totale DNA bedragen naar 0,2 µg per putje, ongeacht of men (bijv.., DNA-A) of meerdere (bijvoorbeeld DNA B en C) DNA-constructies worden toegevoegd aan elk putje.</li>
	<li>Werken vanuit de spreadsheet, combineren de juiste hoeveelheid RSM en DNA in één buis. Het combineren van de juiste hoeveelheid RSM en transfectie reagens (bijvoorbeeld Lipofectamine) in een aparte buis.</li>
	<li>Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Combineren van het DNA en transfectie reagens RSM mengsels en Incubeer bij RT gedurende 20 min.</li>
	<li>Tijdens deze stap van de incubatie, gebruik maken van een meerkanaalspipet en steriele kunststof troggen te wassen 2 x met 100 µL per putje van NBM cellen. De geconditioneerde media (CM) reserveren en op te slaan bij 37 ° C. Voor dit en stappen uit te voeren, zorgen om te minimaliseren van de hoeveelheid tijd die neuronen worden blootgesteld aan lucht.</li>
	<li>Verwijder de NBM-media en vervang met 100 µL per putje van NBKY.</li>
	<li>Na 20 minuten verstreken zijn, voeg toe 50 µL van het mengsel van transfectie reagens/DNA ontkleuring aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer de cellen met de transfectie reagens/DNA complexen gedurende 20 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Spoel 2 x met NBKY en vervangen door 100 µL van CM en NBC 100 µL per putje.</li>
	<li>Succesvol transfected cellen moeten zichtbaar door fluorescentie microscopie binnen 16 – 24 h van transfectie zijn. Te meten van efficiëntie, een fluorescente microscoop te gebruiken om te controleren van de transfectie na overnachting incubatie bij 37 ° C. Opmerking: Deze techniek resulteert in een totaal rendement van de transfectie van 5 tot 10%.</li>
</ol>3. beeldvorming
<ol><li>Plaats de plaat op een fluorescente microscoop met een gemotoriseerde stadium, en stellen een fiduciaire (bijvoorbeeld een merk aan de onderkant van de plaat), waarmee de gebruiker naar het uitlijnen van de plaat telkens wanneer die het image is gemaakt. Een afbeelding van dit fiduciaire voor verwijzing opslaan.</li>
	<li>Navigeer naar een gebied van belang en Let op de x-en y-coördinaten ten opzichte van de fiduciaire.</li>
	<li>Focus op transfected cellen, uiting geven aan een fluorescerende label.</li>
	<li>Deelnemen aan fluorescerende afbeeldingen het juiste kanaal of kanalen (bijv. rood fluorescerende eiwit [RFP], groen fluorescent proteïne [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] '), handmatig of op een geautomatiseerde manier. Door verschillende opnamen tussenpozen regelmatig regelafstand, een montage van de put tijdens beeldverwerking kan worden gemonteerd (zie stap 4). Opmerking: De afstand is afhankelijk van verschillende factoren, zoals de vergroting, de optica van de Microscoop, en de grootte van de detector. In het algemeen zullen de optische afstand tussen aangrenzende afbeeldingen tussen 90-95% van de grootte van elke afzonderlijke afbeelding, voorzien van een kleine mate van overlapping van de afbeelding te voorzien van uitlijning.</li>
	<li>Herhaal dit proces zo vaak als nodig, aanpassing aan de oorspronkelijke fiduciaire telkens. Voor de analyse van de overleving plaatsvindt imaging elke 6-24 h, afhankelijk van het celtype en het doel van het experiment.</li>
</ol>4. de beeldverwerking
Opmerking: Na overname van de afbeelding moeten een reeks stappen worden verwerkt vóór beeldanalyse. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, stiksels, stapelmogelijkheden en achtergrond aftrekken (Figuur 1). Het doel van deze stappen is een afbeeldingsstapel, of tijdreeksen, waarin cellen zijn duidelijk waarneembaar is vanuit hun achtergrond en makkelijk te volgen over meerdere tijdstippen te produceren. Een toegewijde FIJI macro (Image_Processing.ijm, Zie aanvullende bestand 2) voert basic stiksels, stapelen, en achtergrond van aftrekken. Een uitleg van elke stap en de parameters te overwegen bij het uitvoeren van beeldverwerking vindt u in de sectie discussie.
<ol><li>Pas de onbewerkte gegevens of input map overeenkomen met de opmaak die is afgebeeld in Figuur 2.</li>
	<li>Als tijdstippen niet aaneengesloten (dat wil zeggen, T1, T2, T3), deze namen van mappen wijzigen zodat ze zijn. Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de Image_Processing macro niet crasht tijdens het stapelen.</li>
	<li>Dubbelklik op het pictogram van de Fiji open het programma, vervolgens klikt u op en sleep de macro Image_Processing naar de Fiji. Hiermee opent u de macro in Fiji.</li>
	<li>Lijnen 2-7 van de Image_Processing macro opgeven van de input map met afbeeldingen, de folder van de gewenste output voor gestikte en gestapelde afbeeldingen, aantal imaging timepoints, aantal fluorescerende kanalen en plaat-indeling aanpassen.</li>
	<li>Bepaalt de volgorde waarin de beelden werden verworven. Om dit te testen, steek handmatig een montage van beelden in FIJI door manoeuvreren naar de Plugins vervolgkeuzemenu | Binddraad | Raster/collectie stiksel. Pas de instellingen binnen de dropdown menu's Type en volgorde totdat een nauwkeurig gestikte afbeelding wordt geproduceerd.</li>
	<li>Aanpassen van de variabelen van het GRID_TYPE en STITCH_ORDER in de regels 8 en 9 van de Image_Processing macro die overeenkomen met deze selecties.</li>
	<li>Geef het aantal beelden per putje door metrolijn 10 in de Image_Processing macro aan te passen. Opmerking: Voor de montage van een 2 x 2 van beelden, deze regel zou luiden DIM = 2.</li>
	<li>Als achtergrond aftrekken vereist is, passen lijn 14 van de macro Image_Processing BGSUB = true.</li>
	<li>Stel de rolstraal van de bal door lijn 15 in de Image_Processing macro aan te passen. Opmerking: Stel de straal in te stellen op ten minste het voor optimale resultaten, diameter van de grootste object op de voorgrond in de afbeelding.</li>
	<li>Klik op uitvoeren om te starten van de macro Image_Processing . Eenmaal gestart, zal de Image_Processing automatisch vooraf via stiksels, stapelmogelijkheden en achtergrond aftrekken.</li>
</ol>5. scoren celdood
Opmerking: Zie de sectie discussie voor meer informatie over scoren celdood en censureert gegevens.
<ol><li>Zoek de afbeeldingsstapels geproduceerd door het Image_Processing script. Open deze in FIJI.</li>
	<li>Kunt de wijs hulpprogramma binnen FIJI afzonderlijk label elke cel met een getal. Op t te drukken na elke punt de cel-id aan de ROI (regio-of-interest) Manager toevoegen zal. Opmerking: De id's kunnen worden gevisualiseerd door te klikken op de etiketten en Toon alle selectievakjes in de Manager van de ROI.</li>
	<li>
Vooruitgang door middel van de timepoints in elke afbeeldingsstapel en record het timepoint wanneer elke cel of sterft of moet worden gecensureerd in het bestand Survival_spreadsheet.csv (Zie aanvullende bestand 3).
	<ol>
<li>Elke cel is gevestigd in één rij in het werkblad, waarin een unieke identificatie (ID) voor elke cel bestaat uit haar goed overeenkomt en ROI getal in dat goed. tp_death is het laatste punt van de tijd dat een cel wordt waargenomen om te leven, terwijl time_death staat voor het werkelijke tijdstip van overlijden in uren. Voor elke cel, deze gegevens invoeren. Het is essentieel voor het handhaven van deze structuur voor latere analyse met behulp van de overleven. R (Zie aanvullende bestand 4). Opmerking: De criteria voor het bepalen van de dood van de cel zijn van cruciaal belang en kunnen variëren afhankelijk van het celtype. Drie belangrijkste criteria worden gebruikt bij de identificatie van dode neuronen11,20 (Figuur 3): verlies van de intensiteit van de fluorescentie (bijvoorbeeld Neuron 1 bij 69 h), afronding van de cel lichaam (bijvoorbeeld Neuron 2 op 188 h), en het verlies van neurite integriteit of blebbing (bijvoorbeeld Neuron 2 op 188 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De status van de censuur van de cel in de laatste kolom opnemen. Opmerking: Hier, als gevolg van de eigenaardige manier censuur wordt behandeld door R, gecensureerde cellen zijn gemarkeerd door 0, terwijl ongecensureerde cellen zijn gemarkeerd door 1. Merk op dat alle cellen die naar het laatste tijdstip leven zijn gecensureerd en daarom gemarkeerd als 0.</li>
</ol>6. het uitvoeren van Cox evenredige gevaren analyse en visualiseren van resultaten
<ol><li>Indien nodig, R studio op https://cran.r-project.org/mirrors.html downloaden.</li>
	<li>Open R studio en dubbelklik op het pictogram voor het voortbestaan van de . R script.</li>
	<li>Plaats de cursor op regel 2 overleven. R en klik op uitvoeren in het hoofdvenster van de R-studio om het laden van de overleving library.</li>
	<li>Lijn 5 van het voortbestaan van de wijzigen R script om de locatie van het bestand Survival_spreadsheet.csv. Klik op uitvoeren om de gegevens van de overleving als een dataframe te laden.</li>
	<li>Markeer lijnen 8 en 9 en klik op uitvoeren in het consolevenster van R studio om Cox proportionele gevaren analyses uit te voeren. Resultaten en statistieken van de uitvoer weergegeven in het consolevenster van R-studio.</li>
	<li>Markeer lijnen 12-16 overleven. R en druk op de knop uitvoeren om te produceren een cumulatieve risico van dood perceel, die op het tabblad van de percelen in R-studio verschijnen zal. Dit bestand kan worden opgeslagen door te klikken op de knop exporteren boven de plot.</li>
	<li>Zo is het wenselijk om de gegevens van de overleving als een Kaplan-Meier curve uitzetten, markering lijnen 19-24 overleven. R en druk op de knop uitvoeren .</li>
</ol>

<ol><li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li>
<li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+assays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li>
<li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death%3A+a+common+mechanism+in+necrosis%2C+apoptosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible%2C+ischemic+liver+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li>
<li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li>
<li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li>
<li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li>
<li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li>
<li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+survival+analysis+using+Cox%E2%80%99s+regression+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multivariate survival analysis using Cox’s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li>
<li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606(2018).</li>
<li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005(2017).</li>
<li>Park, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proline%2FArginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier, wordt methodologie rechtstreeks volgen neuronale overleven op basis van de eencellige gepresenteerd. In tegenstelling tot traditionele testen voor celdood die beperkt tot discrete tijd punten en de hele bevolking van cellen zijn, deze methode die geschikt is voor de continue beoordeling van een aantal factoren, zoals cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie, en kunt bepalen hoe elke factor cellulaire overleving in een prospectieve wijze beïnvloedt.
Deze methode kan worden aa...

Abnormale celdood is een drijvende factor in vele ziekten, waaronder kanker, neurodegeneratie en lijn1. Robuust en gevoelige testen voor de dood van de cel zijn essentieel voor de karakterisatie van deze aandoeningen, evenals de ontwikkeling van therapeutische strategieën tot verlenging of vermindering van de cellulaire overleven. Er zijn momenteel tientallen technieken voor het meten van celdood, ofwel rechtstreeks ofwel via surrogaat markeringen2. Bijvoorbeeld, kan celdood visueel worden beoordeeld met behulp van vitale kleurstoffen die selectief vlek dode of levende cellen3, of door de controle van het uiterlijk van specifieke fosfolipiden op het plasmamembraan4,5,6 . Metingen van intracellulaire componenten of cellulaire metabolieten vrijkomen van de media bij cellulaire ontbinding kunnen ook worden gebruikt als proxy's voor7,8van de dood van de cel. U kunt ook kan cellulaire levensvatbaarheid worden benaderd door metabole activiteit9,10te beoordelen. Al deze methoden snelle middel om de beoordeling overleving van de cel bieden, zijn zij niet zonder voorbehoud. Elke techniek merkt de cultuur als een enkele populatie, waardoor het onmogelijk is om te onderscheiden tussen afzonderlijke cellen en hun unieke tarieven van overleving. Bovendien zijn deze gehaltebepalingen bevolking gebaseerde kunnen factoren die belangrijk voor de dood van de cel zijn kunnen, met inbegrip van cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie gemeten. In veel gevallen, deze tests zijn beperkt tot discrete tijd punten, en sta niet voor de continue waarneming van cellen na verloop van tijd.
In tegenstelling, is longitudinale fluorescentie microscopie een zeer flexibele methodologie die rechtstreeks en continu het risico van overlijden op een eencellige basis11 monitoren. Kortom, kunt longitudinale fluorescentie microscopie duizenden afzonderlijke cellen worden bijgehouden op regelmatige tijdstippen gedurende langere perioden van tijd, waardoor nauwkeurige metingen van celdood en de factoren die het versterken of onderdrukken van celdood. Aan de basis wordt bij deze methode de voorbijgaande transfectie of signaaltransductie van cellen met vectoren codering van fluorescente proteïnen. Een unieke fiduciaire is dan vastgesteld en de positie van elke transfected cel met betrekking tot deze mijlpaal kan de gebruiker image & bijhouden van afzonderlijke cellen in de loop van uren, dagen of weken. Als deze beelden opeenvolgend worden weergegeven, wordt celdood gekenmerkt door karakteristieke wijzigingen in fluorescentie, morfologie en versnippering van het lichaam van de cel, waardoor de toewijzing van een moment van overlijden voor elke cel. Het berekende percentage van de dood, bepaald door de gevaar-functie, kan vervolgens worden kwantitatief vergeleken tussen voorwaarden, of aan het selecteren van cellulaire kenmerken met behulp van univariate of multivariate Cox proportionele gevaren analyse12gerelateerde. Deze benaderingen kunnen samen de correcte en objectieve discriminatie van tarieven van celdood onder mobiele bevolkingsgroepen, en de identificatie van variabelen die aanzienlijk celdood en/of survival (Figuur 1 voorspellen).
Hoewel deze methode kan worden gebruikt om te overleven in een post mitotische celtype in een verscheidenheid van formaten plating controleren, zal dit protocol voorwaarden voor transfecting en corticale neuronen rat gekweekt in een 96-wells-plaat imaging beschrijven.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>CompactPrep Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12863</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride Hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic Acid Hydrate</td><td>TCI</td><td>H0303</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-Lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>TPP</td><td>0876</td><td></td></tr></tbody></table>

controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

Standaard cytotoxiciteit testen, waarvoor de collectie lysates of vaste cellen op meerdere tijdstippen, hebben beperkte gevoeligheid en capaciteit te beoordelen factoren die van invloed zijn neuronale lot. Deze tests vereisen de waarneming van afzonderlijke populaties van cellen in discrete tijd punten. Dientengevolge, kunnen niet afzonderlijke cellen prospectief na verloop van tijd ernstig beperken het vermogen om te discrimineren of subcellular gebeurtenissen, zoals de vorming van de puncta of eiwit mislocalization, pathogene bestuurders van ziekte, homeostatische reacties, worden gevolgd of louter toeval verschijnselen. Eencellige longitudinale microscopie overwint deze beperkingen, waardoor de onderzoeker om te bepalen van verschillen in overleving tussen populaties en tekenen van causale relaties met verbeterde gevoeligheid. Deze video-gids zal schetsen een representatieve workflow voor experimenten eencellige voortbestaan van rat primaire corticale neuronen uitdrukken van een fluorescente proteïne marker te meten. De kijker leert hoe bereiken hoogrenderende transfections, verzamelen en verwerken van beelden, waardoor de potentiële tracking van afzonderlijke cellen en vergelijken van de relatieve overleving van neuronale populaties met behulp van Cox proportionele gevaren analyse.

Volgens de procedure van de transfectie hier, waren DIV4 rat corticale neuronen transfected met een plasmide codering van de fluorescente proteïne mApple. Begin 24u na transfectie, werden cellen beeld door fluorescentie microscopie elke 24u voor 10 opeenvolgende dagen. De resulterende afbeeldingen werden georganiseerd zoals aangegeven in Figuur 2, dan gestikt, gestapeld en scoorde voor de dood van de cel (Figuur 1). <strong class...

Hier presenteren we een protocol om te controleren van de overleving op basis van de eencellige en identificeren van variabelen die aanzienlijk celdood voorspellen.

Controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de overleving te controleren op een eencellige basis en identificeren variabelen die aanzienlijk voorspellen celdood of overleving. Conventionele cytotoxiciteitstesten beoordelen populaties cellen en missen het vermogen om individuele cellen te discrimineren. Longitudinale microscopie maakt de toewijzing van het tijdstip van overlijden voor elke cel in een populatie mogelijk.Deze techniek is zeer geschikt voor het evalueren van nieuwe therapieën voor neurodegeneratieve ziekten en andere aandoeningen. Deze methode heeft bewezen van onschatbare waarde voor het verkennen van ziektemechanismen in neurodegeneratieve aandoeningen, en kan worden toegepast met gelijke werkzaamheid ten opzichte van andere aandoeningen waarin celdood is van belang. Onderzoekers kunnen worstelen met het bereiken van adequate transfectie efficiëntie zonder onnodige toxiciteit.De praktijk met de multichannel pipet en vertrouwdheid met het protocol moet verminderen deze moeilijkheidsgraad na verloop van tijd. Microscopie is een inherent visuele methodologie. Daarom kan de techniek gemakkelijker worden begrepen door te kijken in aanvulling op het lezen.Om te beginnen, combineren de juiste hoeveelheid verminderde serum media en transfectie reagens in een buis, en verminderde serum media en DNA in een aparte buis. Broed ze vijf minuten op kamertemperatuur. Combineer vervolgens de inhoud van beide buizen en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.Gebruik een multichannel pipet en steriele plastic troggen om de corticale neuronen twee keer te wassen met 100 microliters neurale basale media per put. En bewaar de geconditioneerde media en andere resterende media op 37 graden Celsius. Vervang de NBM door 100 microliters van eerder voorbereide NBKY oplossing per goed.Na 20 minuten, pipet 50 microliters van de transfectie reagens en DNA-mengsel dropwise in elke put. Broed de cellen 20 minuten in op 37 graden Celsius. Spoel de cellen twee keer af met nbky-oplossing.Voeg vervolgens 100 microliter geconditioneerde media en 100 microliter nbc-oplossingen toe aan de putten. Om te beginnen met het beeldvorming van de cellen, plaats de 96 goed plaat op een fluorescerende microscoop. Gebruik een fiduciair teken dat uniek is voor elke plaat als referentie voor toekomstige uitlijning en sla een afbeelding op voor toekomstige referentie.Navigeer vervolgens naar interessegebieden en noteer hun x- en y-coördinaten ten opzichte van het merk. Gebruik een fiduciair teken dat uniek is voor elke plaat als referentie voor toekomstige uitlijning en sla een afbeelding op voor toekomstige referentie. Tot slot, focus op de doorgetransfecteerde cellen uitdrukken van een fluorescerend label.Maak meerdere foto's met regelmatig gesprede intervallen in de juiste tl-kanalen. Om te beginnen met het verwerken van afbeeldingen, dubbelklikt u op het Fiji-pictogram. Klik vervolgens op en sleep de afbeelding onder de verwerkingsmacro naar de Fiji-balk om de macro binnen Fiji te openen.Lijn twee tot en met zeven van de afbeelding aanpassen, wordt de verwerkingsmacro volgens het tekstprotocol weergegeven. Klik vervolgens op stiksels en vervolgens op het raster/de verzameling stiksels. Pas de instellingen in de vervolgkeuzemenu's, het type en de volgorde aan totdat een nauwkeurig gestikte afbeelding wordt geproduceerd.Pas rastertype en steekvolgordevariabelen in lijnen acht en negen aan volgens deze selecties. Pas vervolgens regel 10 aan om het aantal afbeeldingen per put op te geven en stel de optie achtergrondaftrekking in lijn 14 in op true, indien nodig. Pas regel 15 aan om de straal van de rollende bal in te stellen volgens het tekstprotocol en klik op Uitvoeren.Ten slotte, open de uitvoer afbeelding stapels en handmatig identificeren van de dode neuronen volgens het tekstprotocol. Neem de gegevens op in een spreadsheetbestand. Als u statistische analyses wilt uitvoeren, dubbelklikt u op het pictogram voor het overleven.R-script. Markeer regel twee en klik op de run-knop om de overlevingsbibliotheek te laden. Wijzig vervolgens het pad in regel vijf om de invoerspreadsheet aan te roepen en klik op de knop Uitvoeren.Markeer lijnen acht en negen en klik op de run-knop om de cox proportionele gevarenanalyse uit te voeren. Markeer de lijnen 12 tot en met 16 en 19 tot en met 24. Klik op de run-knop om het cumulatieve risico op overlijden en de overlevingsgegevens als een Kaplan-Meier-curve in kaart te brengen.In deze studie, rat corticale neuronen werden doorgesch doorgesch doorgeschat op vier dagen na beplating met een plasmide codering van het fluorescerende eiwit M appel. 24 uur na de transfectie, neuronen werden afgebeeld door fluorescentie microscopie elke 24 uur voor 10 opeenvolgende dagen. Na het verwerven van afbeeldingen werden beelden verwerkt en achtereenvolgens onderzocht om de celdood te markeren.Het tijdstip van overlijden voor elke cel werd bepaald door veranderingen in fluorescentie, morfologie en fragmentatie van het cellichaam. Cox proportionele gevaren analyse uitgevoerd op de overlevingsgegevens van de mutant neuronen resulteerde in een hazard ratio van 2.2. Dit resultaat wees op een sneller sterftepercentage in de gemuteerde neuronen in vergelijking met de wilde typepopulatie.Het belangrijkste om te onthouden bij een poging deze procedure is om voorzichtig pipet. Het minimaliseren van blootstelling aan lucht en het vermijden van bellen is van cruciaal belang voor een succesvolle transfectie. Na transfectie kan longitudinale fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om verschillende factoren bij te houden die kunnen bijdragen aan celdood, waaronder eiwitlokalisatie, omzet en expressieniveau, naast celoverleving.Op het gebied van neurodegeneratie heeft de dynamische aard van longitudinale microscopie licht geworpen op de vraag of de aggregatie van ziekte-geassocieerde eiwitten een toxische of beschermende gebeurtenis vertegenwoordigt. Geen van deze reagentia of instrumenten zijn gevaarlijk.

monitoring-neuronal-survival-via-longitudinal-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Beschrijven we een protocol dat beeldvorming van mitochondriën kan in levende neuronen via fluorescentie microscopie over lange duur. Imaging gedurende langere perioden wordt bereikt door lentivirus-gemedieerde expressie van een mitochondrially gerichte fluorescerend eiwit en het gebruik van een goedkope stage-top incubator, dat is ontworpen en gebouwd in ons laboratorium.

Neuromodulatie en Mitochondriale Transport: Live Imaging in hippocampale neuronen dan lange duur

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Source: Krishnamurthy, K. et al. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates real-time calcium imaging to monitor synaptic activity in ALS-mutant neurons expressing a genetically encoded calcium biosensor. It outlines the steps for preparing the neurons for imaging, stimulating calcium dynamics, and recording fluorescence to measure real-time changes in intracellular calcium levels, which reflect...

Fluorescence Imaging of Synaptic Calcium Dynamics in an In Vitro Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Intracellulair Ca2+-remodellering bij veroudering kan bijdragen aan excitotoxiciteit en neuronbeschadiging, processen gemedieerd door Ca2+-overbelasting. We wilden Ca2+-remodellering in de verouderende hersenen onderzoeken door middel van fluorescentie- en bioluminescentie-beeldvorming van cytosolisch en mitochondriaal Ca2+ in langetermijnculturen van hippocampusneuronen van ratten, een model voor neuronale veroudering.

Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged hippocampus Neuronen

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Leer longitudinale fluorescentiemicroscopie om overleving van individuele corticale neuronen te volgen en voorspellers van celdood te identificeren. Deze methode biedt inzicht in neurodegeneratieve mechanismen.

Controle van de neuronale overleven via longitudinale fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen