Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

Dit protocol maakt het mogelijk om de specifieke etikettering en daaropvolgende verrijking en identificatie van endogene CK2 substraten uit een complex biologisch monster zoals een cel of weefsellysaat. Deze methode kan worden toegepast op elk celtype of weefsel. Aldus het vergemakkelijken, de studie van CK2 in diverse biologische contexten.

Het aantonen van de procedure zal John Chojnowski, een afgestudeerde student van mijn laboratorium. Om te beginnen, mechanisch lyse het weefsel monster of gekweekte cellen zoals beschreven in het tekstprotocol om een totaal van 900 microliter van het monster te verzamelen. Centrifuge bij 17, 500 keer zwaartekracht en bij vier graden Celsius gedurende drie minuten.

Breng vervolgens 270 microliter van de supernatant over naar elk van de drie nieuwe 1,7 milliliter microcentrifugebuizen. Verwijder 40 microliter van de resterende supernatant te worden gebruikt als een input control, en breng het naar een nieuwe buis. Leg alle monsters op ijs.

Ten eerste, label elk van de drie monsterbuizen zoals hier getoond. Voeg aan de Kinase Reaction-buis 2,7 microliter CK2 en 2,7 microliter van 2,5 millimolar GTPgammaS toe. Veeg de buis te mengen, en onmiddellijk plaats het op ijs.

Voeg aan de GTPgammaS-buis 2,7 microliter van 2,5 millimolar GTPgammaS en 2,7 microliter Lysis Buffer toe. Veeg deze buis om te mengen, en onmiddellijk plaats het op ijs. Voeg aan de PNBM Only tube 5,4 microliter Lysis Buffer toe.

Veeg de buis te mengen, en onmiddellijk plaats het op ijs. Broed alle drie de buizen in een waterbad op 30 graden Celsius gedurende een minuut. Voeg hierna 13,5 microliter PNBM met 12 milligram per milliliter aan elke buis toe.

Keer de buizen om de monsters te mengen en de monsters een uur lang op kamertemperatuur uit te broeden. Terwijl de monsters uitbroeden, labelt u elk van de kolommen voor het te laden monster, zoals hier wordt weergegeven. Bereid de kolommen voor door elke kolom meerdere keren om te keren om de Sephadex G-25-hars in de opslagbuffer opnieuw op te stellen.

Bevestig elke kolom aan een klemstandaard en laat deze ongeveer vijf minuten ongestoord zitten om de hars te laten bezinken. Plaats vervolgens een buis onder de onderste opening van elke kolom. Verwijder de doppen van zowel de boven- als de onderkant van elke kolom, zodat de opslagbuffer door de zwaartekracht in de buizen kan uitlekken.

Zodra de opslagbuffer is uitgeput, voegt u ongeveer 2,7 milliliter Lysis Buffer toe aan elke kolom om ze te equiliben, zodat u de stroom door verzamelt en weggooit. Herhaal dit proces van het toevoegen van Lysis Buffer en het verwijderen van de stroom door, drie keer. Laad om te beginnen elk monster in de respectievelijke kolom.

Verzamel en gooi de stroom erdoor weg. Voeg 420 microliter lysebuffer toe aan elke kolom om de monsters te wassen. Laat de Lysis Buffer door de kolom filteren en verzamel en verwijder de stroom erdoorheen.

Plaats vervolgens buizen in positie onder elke kolom voor monsterverzameling. Voeg 500 microliters lysisbuffer toe aan elke kolom om de monsters te ontlopen. Verzamel de stroom door, die nu een verrijkte populatie van thiophosforylated en alkylated CK2 substraten in de kinase reactie bevat.

De gtpgammas enige reactie bevat substraatjes thiophoshorylated en alkylated door een endogene CK2 aanwezig. De PNMB enige reactie zal achtergrond alkylated eiwitten bevatten. Verwijder 80 microliter uit elke Elution als een Elution Input Control monster.

Splits vervolgens elk monster in twee buizen die elk 200 microliters bevatten. Label elk van de buizen als anti-thiofofosfaat ester of immunoglobuline G, zoals hier getoond. Voeg 2,8 microgram anti-thiofofosfaat ester antilichaam toe aan elk van de anti-thiofofosfaat ester buizen.

Voeg 2,8 microgram Isotype Control-antilichaam toe aan elk van de IGG-buizen. Plaats vervolgens de buizen op een rotator op vier graden Celsius gedurende twee uur. Gebruik tijdens de laatste 15 minuten van de monster incubatie een schoon scheermesje om het uiteinde van een P200 pipettip af te snijden om de maatgrootte te vergroten.

Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, kort vortex de opslagbuis met de agarose kralen. Breng met behulp van de gesneden pipetpunt 100 microliter van de kralen slurry per immunoprecipitatie over naar een nieuwe 1,7 milliliter microcentrifugebuis. Het is belangrijk om de kralen voor elke overdracht te laten bezinken.

Centrifugeren de buizen op 17, 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius voor een minuut. Verwijder en gooi de supernatant weg. Resuspend de kralen door het toevoegen van 200 microliters van Lysis Buffer en kort vortexing te mengen.

Herhaal dit proces van centrifugeren en het wassen van de kralen drie keer. Na de laatste wasbeurt, plaats de kralen op ijs tot klaar om verder te gaan. Wanneer de monsters klaar zijn met uitbroeden, centrifugeren ze op 17, 500 keer de zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende drie minuten.

Breng vervolgens 200 microliter van elk monster over naar de buizen met de gewassen kralen. Plaats de buizen op een rotator op vier graden Celsius gedurende een uur. Vervolgens centrifugeren de buizen op 17, 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius voor een minuut.

Verwijder 40 microliter uit elke supernatant om op te slaan als een uitputtingscontrole. Verwijder en gooi de rest van de supernatant weg, voorzichtig om de kralen niet te storen. Was de monsters door het toevoegen van 200 microliters van Lysis Buffer aan elk en vortexing kort.

Centrifuge bij 17, 500 keer zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende een minuut, het weggooien van de supernatant. Herhaal dit was- en centrifugatieproces drie keer en zorg ervoor dat de kralen niet storen. Voeg hierna 50 microliter 2x monsterbuffer toe aan elk monster met kralen.

Voor alle andere monsters, waaronder het invoerbeheer, de Elution-invoerbesturingselementen en de uitputtingsbesturingselementen, voegt u 8 microliter 6x-voorbeeldbuffer toe. Pipette elke buis op en neer te mengen met uitzondering van buizen met kralen, en verwarm alle monsters op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten alvorens verder te gaan met SDS-PAGE. Om te beoordelen of de immunoprecipitatie succesvol was, voer 25 tot 30 microliter van elk monster dat werd ontweken van kralen op een aparte 12,5%polyacrylamide gel.

Vlek elke gel met Coomassie Blue om verrijkte eiwitten uit verschillende stadia van het experimentele protocol te visualiseren. Met behulp van nieuwe, schone scheermesjes, zorgvuldig accijnzen alle unieke banden aanwezig in de kinase reactie anti-thiophosfaat ester IP Lane, terwijl het noteren van hun geschatte moleculaire gewichten. Voor elke unieke band moet een nieuw scheermesje worden gebruikt.

De onderliggende basis van deze techniek is deze techniek is het ongebruikelijke vermogen van CK2 om GTP te gebruiken voor overdracht van fosforylgroepen. Toevoeging van exogene CK2 holo-enzym samen met de GTP analoge, GTPgammaS, om een cellysaat, resulteert in een thiophosphorylation van endogene CK2 substraten. Latere behandeling van het lysaat met het alkylating reagens p-Nitrobenzyl mesylaat genereert thiofosfaten ester moiety op deze specifieke substraateiwitten, die vervolgens kunnen worden gepubsmenteerd met behulp van een anti-thiofosfate esterantilichaam en uiteindelijk geïdentificeerd door Mass spectrometrie.

In de representatieve positieve resultaten hier getoond, CK2 afhankelijk, thiophosphorylation en daaropvolgende alkylation waren succesvol. Zoals verwacht, een verbeterde anti-thiofosfate ester signaal door westerse blotting wordt waargenomen alleen in de baan met de volledige kinase reactie, en niet in de GTPgammaS alleen en PNMB alleen behandeld monsters. Een Coomassie Blue gekleurde gel van de immuunprecipiteerde en gezinspeelde eiwitten, tonen ook een positief resultaat.

Zoals meerdere unieke banden zijn alleen zichtbaar in de anti-thiofosfaten ester IP Lane, waarin het lysaat werd geïncubeerd met exogene CK2 en GTPgammaS. De gemarkeerde band wordt vervolgens uit de gel verwijderd en door massaspectrometrie voor eiwitidentificatie ingediend. Volgens deze procedure moeten vermeende CK2-substraten die door een massaspectrometrie zijn geïdentificeerd, worden gevalideerd met behulp van een aanvullende benadering, zoals door CK2-afhankelijke fosforylatie in een standaard in vitro kinasetest.