Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Onze methode helpt bij het bestuderen van de kinetiek van een eiwitcomplexe formatie. Het beschrijft hoe strak een eiwitcomplex is, en of de eiwitcomplexe vorming wordt verstoord door andere eiwitten. Deze techniek maakt het mogelijk om eiwit-eiwit interactie op kwantitatieve wijze te bestuderen met behulp van fluorescentie als verslaggever, onze test kan de associatie en ontkoppeling van een eiwitcomplex in real-time monitoren.

Om te beginnen ontwerpt u de FRET-test die begint met de gegevens voor het COL1 CAND1-complex uit de eiwitdatabase. Laad de structuur in PyMOL en ga vervolgens naar het tovenaarsmenu en gebruik de meetfunctie om de afstand tussen het eerste aminozuur van CAND1 en het laatste aminozuur van COL1 te schatten. Laad vervolgens de online spectra-viewer en bekijk tegelijkertijd de excitatie en emissiespectra van 7-amino-4-methylcoumarine en FlASH.

AMC is de FRET donor en FlASH is de FRET acceptor. Bereid cellen voor met het FRET-donoreiwit door mee te volgen in het bijbehorende tekstprotocol. Zuiver vervolgens het COL1 sortase RBX1-complex door eerst 50 milliliter lysebuffer toe te voegen aan een pellet van E.Coli-cellen die het COL1 sortase RBX1-complex uitdrukken.

IJs de cellen op ijs met sonicatie op 50%amplitude. Wissel de stroom gedurende drie minuten af, zodat deze één seconde aan staat en vervolgens één seconde af om oververhitting van het monster te voorkomen. Breng het resulterende cellysaat over in een 50 milliliter centrifugatiebuis en verwijder het celpuin door middel van centrifugatie op 25.000 keer g gedurende 45 minuten.

Voeg vervolgens de supernatant toe aan vijf milliliter glutathionkralen en broed ze uit op vier graden Celsius om de cellysaat te zuiveren. Na incubatie, centrifugeren de kraal lysate mengsel op 1, 500 keer g gedurende twee minuten op vier graden Celsius. Verwijder vervolgens de supernatant.

Was vervolgens de kralen met 5 milliliter lysebuffer zonder proteaseremmer. Na het centrifugeren van de oplossing, verwijder de supernatant. Voeg nu drie milliliter lysebuffer toe aan de gewassen kralen en breng de kraaldrijfmest over in een lege kolom.

Voeg aan de nieuwe kolom ook vijf milliliter elutiebuffer toe en vervolgens de kolom gedurende 10 minuten uitbroeden en verzamel het eluaat. Voeg vervolgens 200 microliter trombine met vijf milligram per milliliter toe aan het eluaat van de glutathionkralen. Na een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius verdun het eiwitmonster drie maal met buffer A.Load het eiwitmonster naar een buffer A geëquilibrated cationic exchange chromatografiekolom op nul punt vijf milliliter per minuut.

Voeg vervolgens een verloop van nul tot 50% van buffer B toe in buffer A om het eiwit te ontwijken met een stroomsnelheid van 1 milliliter per minuut. Vervolgens, pool de eluate fracties met de FRET donor eiwit en concentraat tot twee punt vijf milliliter met behulp van een ultrafiltratie membraan met een 30 kilodalton cutoff. Voeg nu 7-amino-4-methylcoumarine toe aan het c-eindpunt van COL1 door middel van sortase gemedieerde transpeptidatie door eerst de buffer in het FRET-donoreiwitmonster in de sortasebuffer te veranderen met behulp van een ontziltingskolom.

Om dit te bereiken, eerst evenwicht een desalting kolom met 25 milliliter van sortase buffer. Laad vervolgens twee punt vijf milliliter van de FRET-donoreiwitoplossing in de kolom en gooi de stroom erdoor weg. Vervolgens, elute het monster met drie punt vijf milliliter van sortase buffer en het verzamelen van de stroom door.

Voeg in 900 microliter van het eluaat 100 microliter van 600 micromolar gezuiverde sortase A-oplossing en 10 microliters van een 25 millimolar GGGG-AMC peptide toe. Incubeer het reactiemengsel bij 30 graden Celsius in het donker 's nachts te genereren COL1-AMC-RBX1. Laad nu al het monster op de chromatografiekolom voor grootteuitsluiting en maak het met één punt vijf keer het kolomvolume van de buffer.

Verpool uiteindelijk de eluate-fracties met COL1-AMC-RBX1. Volg mee in het tekstprotocol om het FRET acceptor eiwit voor te bereiden. Veel van de stappen zijn vergelijkbaar met de FRET donor eiwit preparaat.

Bereid de FlASH CAND1-oplossing voor nadat deze klaar is. Voeg eerst één microliter van de FlASH-oplossing toe aan 50 microliter van de vers bereide tetra-cys-CAND1-oplossing. Meng de gecombineerde oplossingen goed en broed het mengsel bij kamertemperatuur in het donker gedurende één tot twee uur om de FlASH CAND1-oplossing te vormen.

Voeg in 300 microliter FRET-buffer COL1-AMC-RBX1 toe aan een uiteindelijke concentratie van 70 nanomolar en breng de oplossing over in een cuvette. Plaats de cuvette in de monsterhouder van een fluoriometer. Prikkel het monster met 350 nanometer excitatielicht en scan de emissiesignalen van 400 tot 600 nanometer bij een nanometer stappen.

Voeg vervolgens in 300 microliter FRET-buffer zowel COL1-AMC-RBX1 als FlASH-CAND1 toe aan een uiteindelijke concentratie van 70 nanomolar. Prikkel het monster met 350 nanometer excitatielicht en scan de emissiesignalen van 400-600 nanometer bij een nanometer stappen. Stel het excitatielicht in op 350 nanometer en gebruik een bandpassfilter waarmee 450 nanometer emissielicht kan passeren en 500 tot 650 nanometer emissielicht blokkeert.

Met de monsterkleppen op de vulpositie sluit een drie milliliter spuit gevuld met water. Dan, was de twee monsterspuiten met water door het verplaatsen van het monster spuit rijden op en neer meerdere malen, het weggooien van het water wanneer u klaar bent. Sluit vervolgens een spuit van drie milliliter aan gevuld met FRET-buffer.

Was de twee monsterspuiten met de FRET-buffer door de monsterspuit meerdere keren op en neer te bewegen en het water weg te gooien als het klaar is. Sluit nu een spuit van drie milliliter aan en laad de eerste monsterspuit, spuit A, met 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 in de FRET-buffer. Draai vervolgens de monsterklep op de aandrijfpositie Ook sluit u een spuit van drie milliliter aan op spuit B en laad spuit B met 100 nanomolar FlASH CAND1 in de FRET-buffer en zet de klep naar de aandrijfpositie.

Open het bedieningspaneel onder acquire in de software en noteren de emissie van COL1-AMC in de loop van 60 seconden. Neem dan een enkel schot. Pas de daling en de fluorescerende signalen gemeten in de tijd van elk schot tot een enkele exponentiële curve.

Was het systeem zoals eerder getoond en voeg vervolgens een oplossing van 100 nanomolar COL1-AMC-RBX1 en 100 nanomolar FlASH CAND1 in de FRET buffer in spuit A.Connect het aan het systeem terwijl het in de vulpositie Load spuit A en zet het monster klep naar de drive positie. Laad vervolgens een oplossing van Skp1-Skp2 in spuit B.Connect it to the system while it is in the fill position. Laad spuit B en draai het monster naar de aandrijfpositie.

In de software, ga naar het verwerven en open het bedieningspaneel. Stel het programma in om de uitstoot van COL1-AMC over 30 seconden vast te leggen. Neem dan een enkel schot.

De fluorescentie signalen toenemen na verloop van tijd na het mengen van oplossingen van spuit A en spuit B.When 70 nanomolar elk van COL1-AMC en FlASH CAND1 werden gemengd om FRET te genereren, twee emissiepieken aanwezig waren in de emissiespectra. En de piek van COL1-AMC werd lager, en de piek van FlASH CAND1 werd hoger. Toen de volledige lengte CAND1 werd gebruikt voor FRET vertoonde de donorpiek een intensiteitsdaling van 10%.

Echter, toen CAND1 met zijn eerste helix afgekapt werd gebruikt, werd de vermindering van de intensiteit van de donorpiek verhoogd tot 30%, wat duidt op een hogere FRET-efficiëntie Om te bevestigen dat de signaalwijzigingen het gevolg waren van FRET tussen COL1-AMC en FlASH CAND1, werd de donor FRET gemengd met overtollige niet-geëtiketteerde CAND1 die bekend staat als de Chase in de acceptor. Als gevolg hiervan werd de donorpiek volledig hersteld en werd de acceptorpiek verminderd. Hier wordt een plot weergegeven van de gemiddelde waargenomen K-waarde met de CAND1-concentratie na lineaire regressieanalyse.

Om de constante van het complex te meten, werd 50 nanomolar COL1-AMC gebruikt in een reeks waargenomen dissociatiesnelheidconstanten werden gemeten door 50 nanomolar COL1-AMC te mengen met toenemende concentraties FlASH CAND1. Vergelijkbaar met de meting van de op constante, de waargenomen dissociatie constante van COL1 en CAND1 werd gevonden door het toezicht op het herstel van het donorsignaal na verloop van tijd op de gestopte stroomfluorometer. Hier steeg het donorsignaal snel en het openbaarde een waargenomen K waarde van nul punt vier per seconde.

Wanneer daarentegen een buffer werd toegevoegd aan het voorgemonteerde complex, werd er geen signaalverhoging waargenomen die suggereert dat de snelle dissociatie van COL1 CAND1 werd geactiveerd door Skp1 Skp2. Zorg ervoor dat de hoeveelheid licht waar de donor en acceptor-eiwitten aan worden blootgesteld, worden geminimaliseerd. Probeer fluoroforen zoveel mogelijk in het donker te houden.