Toepassing van geavanceerde In Vitro kweken van technologie om te bestuderen van de menselijke darmflora

Het doel van dit protocol is om de cultuur gut microbiota in vitro. Het zal de studie van de dynamiek van microbiota mogelijk maken zonder rekening te houden met de bijdrage van een moderne component. Met behulp van dit multi-stage in vitro systeem tellen we de microbiota gemeenschap te ontwikkelen in de lumin en op het slijmvlies van multi-regio's van de dikke darm kan gelijktijdig worden gestart.

Een visuele demonstratie van deze methode is nuttig vanwege de complexiteit van dit in vitro systeem. Begin met het vullen van de opgaande dikke darm met 500 milliliter gedefinieerd medium, de dwarse dikke darm met 800 milliliter gedefinieerd medium, en de dalende dikke darm met 600 milliliter gedefinieerd medium. Voeg mucin agricarriers toe aan de colongebieden in een bedrag dat evenredig is met het volume van de reactor, en gebruik de monsterbuis en spuit om overtollig gedefinieerd medium uit elke reactor te verwijderen.

Gebruik de pH-sondes om de pH in elke reactor aan te passen. En zet de stikstof flush voor 20 minuten. Ontdooi vervolgens het fecale homogenaat volgens de richtlijnen van de fabrikant voordat u een spuit van 60 milliliter laadt met het fecale homogenaatmonster.

Dan, inenting elke dikke darm reactor door de monsterpoort met een hoeveelheid homogenaat gelijk aan 5% van elke reactor volume voor 's nachts cultuur met pH-controle. De volgende ochtend, reinig de luer slot op de monsterpoort van elke bioreactor met alcohol. Wanneer de havens zijn opgedroogd, sluit u de 30 milliliter spuit, vrijgekomen van alle lucht, aan op een van de monsterpoorten.

Trek de zuiger drie tot vijf keer om een grondige vermenging van de onderdelen van het vat te garanderen voordat 15 milliliter van de cultuur supernate uit de bioreactor. Breng het luminale monster vervolgens over in een steriele Falcon-buis en plaats op ijs. Voor DNA-analyse, verzamel een tot drie milliliter luminale vloeistof met behulp van een vijf milliliter spuit.

Verzamel de supernate vormen de andere bioreactoren op dezelfde manier. Om monstermateriaal opzij te zetten voor de analyse van het korte ketenvetzuur, centrifugeren 15 milliliter van het luminale monster van belang, en spuit filtert de supernate door een 0,2 micrometer poriefilter voor min 80 graden Celsius opslag. Om monstermateriaal opzij te zetten voor DNA-analyse, een milliliter luminale vloeistof te centrifugeren en de pellet op te slaan bij min 80 graden Celsius.

Voor mucosale monster oogst, verwijder de bereide mucin dragers uit vier graden Celsius opslag en zet de stikstof flush. Open snel het reactordeksel en vervang 50% van de dragers in elke reactor door nieuwe. Wanneer alle dragers zijn vervangen, snel opnieuw het deksel en onderhouden van de stikstof flush voor nog eens 20 minuten.

Dan aliquot 0,25 tot 0,5 gram mucin drager agar in individuele twee milliliter buizen voor min 80 graden Celsius opslag tot DNA-extractie. Drie keer per dag fietst het systeem automatisch. Dit begint met 140 milliliter gedefinieerd medium overgebracht naar de maag bioreactor gevolgd door een een uur incubatie met pH-controle.

Aan het einde van de incubatie wordt de inhoud van de maag overgebracht naar de dunne darm, samen met 60 milliliter alvleeskliersap. In de kleine darmbioreactor wordt de pH automatisch aangepast tot 6,7 tot 6,9 en de inhoud gedurende 90 minuten inbroed. Tijdens deze incubatie wordt de stikstofspoeling voor elk systeem in totaal 10 minuten ingeschakeld.

Aan het einde van deze incubatie wordt de inhoud van de dunne darm overgebracht naar de opgaande dikke darm, van de opgaande dikke darm naar de dwarse dikke darm, van de dwarse dikke darm naar de dalende dikke darm en van de dalende dikke darm naar het afval. In deze representatieve hoofdcoördinatenanalyse veranderde de gemeenschap afschrijfbaar tussen dag één en zeven. Vanaf dag 11 na de inenting tot het einde van het experiment bezetten de monsters echter een klein gebied van de belangrijkste coördinatenanalyseruimte voor zowel steekproefsamples op basis van operationele taxonomische eenheid, aanwezigheid tot afwezigheid en overvloed.

De meting van drie prominente kortgeketende vetzuren blijkt dat propionzuur, butanoïnezuur en azijnzuur fluctueren vanaf het begin van het experiment tot dag 15 post-inenting. Na dag 15 bleven de hoeveelheden van deze zuren die in elke colonregio worden geproduceerd constant met slechts minimale veranderingen tot het einde van het experiment. Analyse van de stabiele gemeenschap voor de luminale en mucosale fase van elke colon regio toont aan dat de gemeenschappen die zich ontwikkelen in de individuele dikke darm regio's van het in vitro systeem zijn vergelijkbaar met de fecale entmateriaal samenstelling.

Vergelijking van de alfadiversiteit van het in vitro systeem toont een vergelijkbaar niveau van diversiteit aan als dat van het entmateriaal voor alle regio's, behalve de luminale monsters uit het opgaande gebied. Aantonen dat het in vitro cultuursysteem in staat is om een gemeenschap te produceren die vergelijkbaar is met het fecale entmateriaal, zowel qua samenstelling als diversiteit. Om een stabiele darmmicrobiota gemeenschap te produceren met behulp van dit protocol, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat oplossingen nauwkeurig worden voorbereid en dat anerobic voorwaarden en pH-parameters worden gehandhaafd tijdens het experiment.

Na deze procedure kunnen monsters worden geanalyseerd op gemeenschapssamenstelling met behulp van next gen DNA-sequencing, gevolgd door bio-informatica-analyse en voor functionaliteit met behulp van metabolomics.