Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins
26 januari 2019
We presenteren een protocol om te bouwen van moleculaire/naar vliegveld, waar kinesin oppervlak-in acht genomen motor eiwitten voortbewegen kleurstof-gelabelde microtubuli. Zwakke interacties van de kinesins met het oppervlak kunnen hun omkeerbare gehechtheid aan het. Dit creëert een nanoschaal-systeem dat dynamische montage en demontage van de onderdelen met behoud van zijn functionaliteit vertoont.
Dit protocol is belangrijk omdat het de deur opent voor verder onderzoek in het ontwerp van biologische systemen op nanoschaal die in dynamisch evenwicht verkeren. Deze techniek vult een deel van de kloof tussen gemanipuleerde en natuurlijke structuren, omdat het de studie van wat we zouden kunnen noemen, zelfherstellen'of de dynamische vervanging van moleculaire componenten mogelijk maakt. Het belangrijkste advies voor het uitproberen van deze techniek voor de eerste keer is ervoor te zorgen dat de experimentator alle veiligheidsprotocollen volgt.
Bereid eerst de voorraadoplossingen voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Pipette 21.8 microliters van BRB80 Buffer in een kleine microcentrifuge buis. Voeg 1 microliter van de magnesiumchloridevoorraadoplossing, 1 microliter van de GTP-voorraadoplossing en 1,2 microliter van de DMSO-voorraadoplossing toe om de groeibuffer van microtubuli klaar te maken.
Om te beginnen met microtubuli polymerisatie, voeg 6,25 microliter microliter microtubulier groeibuffer direct in een 20 microgram aliquot van lyophilized tubulin;gelabeld te worden opgewekt op 647 nanometer. Vortex op 40 RPS gedurende 5 seconden. Koel de aliquot 5 minuten af op ijs.
Dan, incubeer op 37 graden Celsius gedurende 45 minuten. Om te beginnen met microtubuli stabilisatie, voeg 5 microliters van de aliquoted paclitaxel oplossing tot 490 microliters van BRB80 buffer. Vortex de oplossing op 30 RPS voor 10 seconden.
Zodra de 45 minuten van incubatie voor de microtubuli is, voeg 5 microliter van die oplossing aan de BRB80, en paclitaxel mengsel, om de MT100 oplossing te creëren. Voeg eerst 9,0 microliter van de aliquoted casein-oplossing toe aan 291 microliters brb80-buffer. Pipette 83 microliter van de BRB80 caseïneoplossing in een nieuwe 6 milliliter microcentrifugebuis.
Voeg 1 microliter D-glucose, glucoseoxidase, catalase, DTT, creatinefosfaat en fosphokinase toe. Voeg vervolgens 1 microliter van de stock ATP-oplossing toe aan de beweeglijkheidsoplossing. Flick, of vortex de aliquot om homogeen te distribueren van de chemische stoffen.
Voeg vervolgens 1 microliter voorbereide kinesineoplossing toe aan de beweeglijkheidsoplossing, zodat de uiteindelijke concentratie 20 nanomolar is. Voeg 10 microliter van de MT100-oplossing toe aan de beweeglijkheidsoplossing. Gebruik voor stroomcellen zowel een grote coverslip als een kleine coverslip.
Spoel alle covers twee maal met ethanol en twee maal met ultrazuiver water. Sonicate de gewassen coverslips in ultrazuiver water gedurende 5 minuten. Droog vervolgens de coverslips in een oven bij een temperatuur tussen 50 en 75 graden Celsius.
Gebruik een UV-ozonreiniger om één kant van elke afdekking gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en in normale atmosferische omstandigheden te behandelen. Met behulp van een pincet, flip elke coverslip en gebruik UV-ozon om de onbehandelde kant te behandelen ook. Soniceer de behandelde coverslips gedurende 5 minuten in ultrazuiver water.
Droog ze vervolgens in een oven op een temperatuur tussen de 50 en 75 graden Celsius. Trek vervolgens beschermende kleding aan zoals beschreven in het tekstprotocol. Dompel elke coverslip 15 seconden onder in een zoutoplossing.
Was de covers twee maal in tolueen en drie keer in methanol. Gebruik onder druk genomen stikstof om de coverslips te drogen. Zodra de coverslips droog zijn, snijd een stuk van dubbelzijdige tape die is 2 centimeter door 2,5 centimeter.
Snijd dit stuk verticaal doormidden in twee stroken van 1 centimeter bij 2,5 centimeter. Leg de grote coverslip op een delicate taakwisser en plak de tape strips aan, lengte-wijs langs de randen om een 1 centimeter bij 2,5 centimeter gebied tussen de stukjes tape te creëren. Plak de kleine coverslip op de tape strips om de flow cell assemblage af te maken.
Eerst stroom ongeveer 20 microliter van de PEG-PPG-PEG-oplossing in de geassembleerde stroomcel. Laat de oplossing 5 minuten op het oppervlak absorberen en wissel deze oplossing vervolgens drie keer uit met 20 microliters BRB80-buffer door de buffer naar binnen te stromen. Stroom 20 microliters van de beweeglijkheidsoplossing in de stroomcel.
Sluit hierna de randen van de stroomcel af met vet om verdamping te voorkomen als het geplande experiment langer dan een uur duurt. Voer de beeldvorming uit met behulp van een objectieve-type totale interne florescentiemicroscopie. Plaats een druppel onderdompelingsolie op het doel.
Plaats vervolgens de stroomcel op het microscoopplatform. En breng het doel tot er contact is tussen de olie op het doel en de stroomcel. Gebruik het interlock coversysteem van de microscoop om te voorkomen dat al het laserlicht ontsnapt.
Schakel vervolgens de laser in en focus op het onderste oppervlak van de stroomcel met behulp van een laser van 642 nanometer om de microtubuli in beeld te brengen, en een laser van 488 nanometer om de GFP-kinesinmotoren in beeld te brengen. Neem de afbeeldingen of video's van belang. Beelden kunnen worden opgenomen zolang er beweeglijkheid in de stroomcel.
In deze studie wordt een actief nanoschaalsysteem gepresenteerd, dat zelf zwak bindende bouwstenen assembleert om een eigen spoor te bouwen. Met behulp van tirf microscopie, glijdende microtubuli worden afzonderlijk afgebeeld van de kinesine motoren. Microtubuli zijn zichtbaar bij excitatie met een laser van 647 nanometer.
En de GFP kinesin zijn zichtbaar wanneer enthousiast met een 488 nanometer laser. De tijd tussen opwinding en het rode en groene licht was minder dan een seconde. Zoals te zien is, zweefvliegen microtubuli accumuleren kinesine motoren van oplossing en deponeren ze op het oppervlak.
De kinesin motoren blijven in het kielzog van de microtubuli voor een korte periode van tijd alvorens terug te keren naar oplossing. Het is zeer belangrijk om de juiste concentratie van reagentia in de antifade van de beweeglijkheidsoplossing te hebben, anders zou het bleken van foto's ervoor zorgen dat het experiment mislukt. Deze techniek maakt de weg vrij voor een efficiënter gebruik van eiwitmotoren in nanoschaalingeniesystemen.
Dus, waardoor het ontwerp en de studie van meer complexe nanostructuren.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het construeren van moleculaire shuttles die kinesine-motorproteïnen gebruiken om met kleurstof gelabelde microtubuli voort te stuwen. Het systeem maakt dynamische assemblage en desassemblage mogelijk terwijl de functionaliteit behouden blijft.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Biofysica
- Nanotechnologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Moleculaire shuttles zijn essentieel voor het begrijpen van biologische systemen op nanoschaal.
- Kinesine-motoren faciliteren de beweging van microtubuli in cellulaire processen.
- Dynamisch evenwicht in systemen op nanoschaal kan leiden tot zelfhelende eigenschappen.
- Veiligheidsprotocollen zijn cruciaal voor het uitvoeren van experimenten met deze componenten.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het bestuderen van nanoschaalsystemen in dynamisch evenwicht.
- Om de kloof tussen technisch vervaardigde en natuurlijke biologische structuren te overbruggen.
- Om de zelfassemblage en motiliteit van microtubuli te onderzoeken die worden aangedreven door kinesine-motoren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van microtubuli-groeibuffer en stabilisatieloplossingen.
- Assemblage van flowcellen met behulp van behandelde dekglasjes.
- Beeldvorming met behulp van total internal fluorescence microscopy.
- Registratie van de motiliteit van microtubuli en kinesine-motoren.
Belangrijkste Resultaten
- Microtubuli zijn succesvol afgebeeld en bleken kinesine-motoren te accumuleren.
- Het systeem vertoonde dynamische assemblage en disassemblage van componenten.
- Correcte reagensconcentraties waren cruciaal om fotobleken te voorkomen.
- De techniek maakt het ontwerp van complexere nanostructuren mogelijk.
Conclusies
- Dit protocol faciliteert de studie van nanoschaalsystemen met dynamische eigenschappen.
- Het vergroot het begrip van moleculaire interacties in technisch ontwikkelde systemen.
- De bevindingen banen de weg voor toekomstig onderzoek in de nanotechnologie en biofysica.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Dit protocol maakt het mogelijk om dynamische nanoschaalsystemen te bestuderen waarin moleculaire componenten in evenwicht assembleren en disassembleren, wat een model biedt voor mechanistische risicovermindering bij vroege targetvalidatie. Door biologisch transport na te bootsen met reversibel gebonden motorproteïnen, ondersteunt het de voorspellende betrouwbaarheid van screeningsassays die een aanhoudende, reproduceerbare motiliteit vereisen. Het systeem biedt een ziekterelevant platform voor het evalueren van het effect van verbindingen op de cytoskeletdynamiek zonder permanente immobilisatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de functie van motorproteïnen en de dynamiek van microtubuli-interacties te onderzoeken onder bijna-fysiologische omstandigheden.
- Operationele waarde: Ondersteunt de reversibele, vernieuwbare assemblage van actieve complexen voor herhaalde testcycli.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een kwantitatieve uitlezing van microtubuli-glijden en motor-rekrutering via TIRF-microscopie.
- Operationele waarde: Maakt real-time, labelgebaseerde detectie van zowel vracht- als motorproteïnen mogelijk in dezelfde assay.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert cytoskeletale transportmechanismen die relevant zijn voor neurodegeneratieve en proliferatieve ziektepaden.
- Operationele waarde: Maakt het mogelijk om door verbindingen geïnduceerde veranderingen in motiliteit en motorontkoppeling-kinetiek te beoordelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen workflows voor vroege ontdekking, waarbij target-engagement en functionele readouts prioriteit hebben boven lead-optimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing van motor-vracht interacties en modulatie van signaalpaden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve mobiliteitsmetingen die essentieel zijn voor de validatie van hits.
- Analytica: Maakt het mogelijk om de verblijftijd van de motor op het oppervlak te correleren met de microtubuli-snelheid en de loopafstand.
- Translationeel onderzoek: Verbindt functionele read-outs met preklinische modellen van axonale transportdefecten.
- Herbruikbaarheid in de onderneming: Vestigt een modulair platform voor het testen van diverse motorproteïnen of microtubuli-geassocieerde verbindingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door motorbinding te ontkoppelen van permanente oppervlaktehechting.
- Operationele waarde: Waarborgt de stabiliteit van de assay door voortdurende aanvulling van actieve motoren vanuit de oplossing.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door dynamische, op evenwicht gebaseerde functionele gegevens te verschaffen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets die betrokken zijn bij intracellulaire transportpaden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, de omgang met microtubuli en TIRF-microscopie.
- Is afhankelijk van toegang tot fluorescentiemicroscopen met dual-laser excitatie en milieuregeling.
- Necessiteert gestandaardiseerde oppervlaktepassivering en assemblage van de flowcell om aspecifieke binding te minimaliseren.
- Omvat optimalisatie van de concentraties van de motor en microtubuli om een dynamisch evenwicht te handhaven.
- Wordt beperkt door risico's op fotobleken als antifade-reagentia niet nauwkeurig zijn geformuleerd.
