Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

Hallo, mijn naam is Bartolomeo Bosco, en ik ben een promovendus aan het Laboratorium van Transcriptie Netwerk aan het Centrum voor Integratieve Biologie van de Universiteit van Trento in Italië. Zoals u weet, transcriptie is een uiterst complex proces waarbij ruimtelijke en temporele organisatie van transcriptie factor en cofactor. De meeste van hen, met inbegrip van de menselijke P53, herkennen specifieke cis-handelende elementen, genaamd responselementen, en de binding op deze DNA-sequencing is vereist voor de modulatie van de transcriptie van doelgenen.

In dit werk willen we u het protocol laten zien om P53-sequentiespecifiek in transactivatiefuncties te bestuderen met gist als modelsysteem als eiwit in een kleurverslaggevergen of de luciferase of op de kwantificering van celgroei om de belangrijkste experimentele stappen en de veelzijdigheid van deze benaderingen te benadrukken. Protocol een, de bouw van verslaggever gist stammen die een specifieke P53 reactie element stroomopwaarts van de adenine-2 of de firefly luciferase gen bevatten. Om een reporter stam te construeren, volg eerst stappen 1.1 tot en met 1.15 om gistcellen te transformeren met oligonucleotiden gericht op de gewenste promotor regio.

De transformatie is gebaseerd op het standaard protocol op basis van lithiumacetaat. Zodra transformanten verschijnen op 5-FOA platen, meestal na drie dagen van incubatie bij 30 graden, replica plaat ze op niet-selectieve YPDA platen en ook op YPDA platen met G418, markering elke plaat om hun latere vergelijking te vergemakkelijken. Incubeer de platen 's nachts op 30 graden.

De volgende dag, identificeren van de kandidaat-verslaggever stammen uit kolonies die G418-gevoelig, maar groeide op YPDA platen. Streep de geïdentificeerde kolonies op een nieuwe YPDA plaat om enkele kolonie isolaten te verkrijgen, en laat ze groeien voor twee dagen op 30 graden. Controleer de juiste integratie van het gewenste P53-responselement en het uitvoeren van een PCR-reactie met voorwaarden vermeld in stap 1.20.

Laad een aliquot van het PCR-product op agarose gel om de juiste ampliconlengte te controleren voordat Sanger sequencing. Protocol twee, presenteren we een voorbeeld van hoe te evalueren P53 eiwit transactivatie vermogen met behulp van de kwalitatieve kleur gebaseerde adenine-2 gisttest. Transformeer gistcellen met P53-expressievectoren volgens hetzelfde protocol op basis van lithiumacetaat dat in deel één wordt beschreven.

Streep enkele gist transformant kolonies, tot zes per plaat, op een nieuwe selectieve plaat, en laat ze groeien 's nachts op 30 graden. De dag erna, met behulp van steriele fluweel, replica plaat de strepen op nieuwe selectieve platen die het mogelijk maken voor de beoordeling van de kleur fenotype, dat wil zeggen selectieve platen met beperkende hoeveelheid adenine.

Incubeer op 30 graden gedurende drie dagen. Dezelfde strepen kunnen meerdere keren worden gerepliceerd. Protocol drie, presenteren we nu een voorbeeld van de evaluatie van P53 eiwit transactivatie vermogen met behulp van de kwantitatieve luminescentie gebaseerde LUC1 gisttest.

Transformeer eerst gistcellen met P53-expressievectoren volgens, nogmaals, het protocol op basis van lithiumacetaat dat in deel twee wordt beschreven. Patch enkele transformatoren op nieuwe selectieve platen met glucose als koolstofbron, en laat ze groeien op 30 graden 's nachts. Maak voor elk transformatietype vijf tot zeven verschillende patches.

Na de nachtelijke groei, resuspend een kleine hoeveelheid cellen met behulp van een steriele tandenstoker of een pipet tip in synthetische selectieve medium met raffinose als koolstofbron. Deze celsuspensies moeten een optische dichtheid hebben van 600 nanometer rond 0,4 en kunnen vervolgens worden gesplitst in meerdere 96-putplaten voor incubatie bij verschillende temperaturen, behandelingen of om cellen bloot te stellen aan verschillende hoeveelheid galactose om P53-expressie te activeren. Om de firefly reporter activiteit te meten, breng 10 tot 20 microliter celsuspensie van de transparante 96-put plaat in een witte 384-put plaat, en meng de cellen met een gelijk volume van lyse buffer, incubateren voor 10, 15 minuten bij kamertemperatuur op een shaker.

Voeg 10, 20 microliters vuurvlieg luciferase substraat. En meet lichtunits met behulp van een multilabel plaatlezer. Meet ook de optische dichtheid van de culturen in de 96-putplaat.

Protocol vier, presenteren we nu een voorbeeld van hoe de remming van de groei van gist veroorzaakt door P53 te benutten. Transformeer gistcellen met P53-expressievectoren, of transformeer ze met expressievectoren om P53 en een van de cofactoren, zoals MDM2, samen te stellen, na, nogmaals, het protocol op basis van lithiumacetaat beschreven in sectie één. Kweek transformantcellen in selectief middel aan ongeveer één optische dichtheid.

En verdun ze tot 0,05, en voeg een gekozen molecuul toe aan de juiste concentratie. Incubeer cellen op 30 graden op een shaker gedurende 42 uur. Dan, zaad 100 microliters van gistcelcultuur in minimale selectieve medium platen.

Incubeer voor twee dagen bij 30 graden. De juiste RE-integratie in plaats van de ICORE-cassette kan worden gecontroleerd door kolonie PCR, uitgaande van een kleine hoeveelheid cellen van kandidaat-gistklonen en met behulp van primers beschreven in tabel drie om de beoogde locus te versterken. PCR-producten, een band van ongeveer 500 nucleotiden, kunnen vervolgens worden gecontroleerd door Sanger sequencing om de volgorde van de bewerkte genomische locatie voor de aanwezigheid van de juiste P53-responselementsequentie te bevestigen.

De reporter stam is klaar om te worden gebruikt in functionele testen. Controleer de kleur van gistkolonies om het P53-eiwittransactivatievermogen te evalueren. We presenteren bijvoorbeeld een vergelijking tussen wild-type P53 en de mutanten R175H en R282W met behulp van twee verschillende verslaggevers, P21-5-prime en PUMA, en twee verschillende temperaturen, 30 graden en 37 graden.

Interessant, terwijl R175H is een verlies-van-functie P53 allel, rode kolonies in alle omstandigheden, R282W toont temperatuurgevoeligheid met resterende transactivering activiteit op 30 graden, wat resulteert in witte kolonies, maar verlies van activiteit op 37 graden, wat resulteert in rode of roze kolonies. Een uitgebreide dataset wordt gepresenteerd in figuur twee B.Wild-type P53 in vier mutante allelen werden getest op transactivatie met behulp van 10 verschillende P53 response element reporter stammen, drie temperaturen, en constitutieve expressie niveaus. Resultaten worden samengevat in een kleurcode die de gistkolonie kleur fenotype herinnert.

Het P53 K139E mutantallel behoudt gedeeltelijke activiteit en is koudgevoelig. Bijvoorbeeld, kolonies zijn rood in de GADD45 reporter stam op 24 en 30 graden, maar ze zijn wit op 37 graden. Hier presenteren we een voorbeeld van de resultaten verkregen met deze methode, het vergelijken van de transactivatie specificiteit van de mens en C.elegans P53 gist.

De resultaten in de staafgrafiek worden uitgedrukt als gemiddelde relatieve lichteenheden met standaardfout van vier replicaties. Vijf verschillende P53-responselementen werden vergeleken. Drie verschillende niveaus van P53 eiwitexpressie werden getest door de concentratie van galactose in het medium te variëren.

De twee P53 orthologs vertonen duidelijk verschillende transactivatie specificiteit. Dit wordt geïllustreerd door de resultaten met ced13- en V1-responselementen die dezelfde volgorde delen, met uitzondering van de aanwezigheid of afwezigheid van een 28-nucleotide-afstandsruimter. Human P53 vertoont veel hogere transactivering met de V1 binding site, terwijl C.elegans P53 toont het tegenovergestelde.

De resultaten zijn onafhankelijk van het niveau van P53 expressie onder de galactose-inducible promotor. Meet gistgroei door het tellen van het aantal kolonies verkregen in de 100 microliters cultuur daalt. Bereken het gemuteerde reactiverende effect van verbindingen gezien de groei van wild-type P53 uitdrukken gist als het maximaal mogelijke effect, ingesteld op 100%, terwijl de groei van cellen uitdrukken mutant P53 vertegenwoordigen nul niveau van reactivering.

In dit voorbeeld verlicht Nutlin-3a de remming van wild-type P53 veroorzaakt door de coexpressie van MDM2, terwijl PhiKan083 de Y220C P53 mutant gedeeltelijk reactiveert. In beide gevallen resulteert dit in een P53-afhankelijke vermindering van gistgroei. Gist basale cellen hebben bewezen nuttig om waarden te onderzoeken, aspecten van P53 eiwit functies.

Het protocol beschreven in dit werk zijn bijzonder gevoelig voor de evaluatie van transactivatie potentieel van wilde aard of kanker-geassocieerde mutant P53 aan varianten van doellocaties. Verder kan de aanpak worden gebruikt om kleine moleculen te identificeren die P53-functies beïnvloeden en om P53-interactie met cofactor te bestuderen. Het gebruik van de kleur verslaggevers, de miniaturisatie van de luciferase, evenals de groei remming test resulteren in kosteneffectieve en schaalbare testen potentieel vatbaar voor chemische bibliotheek screening.

Ten slotte kan het in dit werk beschreven systeem gemakkelijk worden aangenomen met de studie van andere sequentiespecifieke transcriptiefactoren.