Microelektrode impalement methode om membraan potentieel van een gecanuleerde middelste cerebrale slagader record

Dit protocol kan worden gebruikt om het membraanpotentieel van normale en zieke bloedvaten te meten en farmacologische agentia te evalueren die het membraanpotentieel, de vasculaire toon en de bloedstroom moduleren. Het membraan potentieel gegenereerd uit deze techniek zijn dicht bij het fysiologische bereik, omdat vasculaire gladde spieren binnen een vat zijn in een syncytium. Plaats voor het begin van de procedure een dual channel differentiële elektrometerversterker dicht bij de scheepskamer op de gewenste locatie.

Gebruik een BNC-BNC-kabel om de uitgang van het versterkerkanaal A of B aan te sluiten op de kanaalingang van de digitizer. Monteer de sonde in de micromanipulator en draai de micromanipulator naar de microscoop en de myograaf op een trillingsvrije tafel. Plaats de knoppen en schakelaars op de voorkant van de versterker in de juiste posities voor het experiment, zoals beschreven in de handleiding.

Sluit vervolgens de badgrond aan op de circuitgrond van de versterker met een geschikte elektrode en zorg ervoor dat de kooi wordt geaard op het chassis van de versterker. Om de borosilicelectrodes voor te bereiden, gebruikt u een standaardtrekker om een korte, geleidelijke, acht-tot 10-millimeter taper te bereiken met een diameter van minder dan één micrometer, tweemaal lussen voor hogere weerstanden en kleinere uiteinden. Gebruik een microvezelspuit om de micro-elektroder te vullen met kaliumchloride van drie weken, waarbij de zuiger tijdens de injectie langzaam wordt ingetrokken om ruimte te maken voor de vloeistof om te vullen en om de vorming van bellen in de micro-elektroden te voorkomen.

Plaats de volledig geladen micro-elektroden op de micro-elektrodenhouder en duw de elektrodesteel voorzichtig maar stevig in de houder door het verveelde gat. Verwijder overtollig vocht met een laboratoriumweefsel en sluit de elektrodehouder aan op de versterkersonde. Voer een elektrodetest uit om de elektrodeweerstand te meten.

Open vervolgens de opnamesoftware, wijs een naam toe aan het bestand en sla het bestand op voor toekomstige analyse. Spoel vervolgens de myograafkamer meerdere malen met gedestilleerd water voordat u de kamer laadt met vijf milliliter normale fysiologische zoutoplossing, of PSS. Met behulp van een vijf-of 10-milliliter spuit, vul zowel glazen canules en de bijgevoegde buizen met gefilterde normale PSS zonder de invoering van luchtbellen, en gebruik botte tangen om een halve knoop te maken in twee 10-0 monofilament nylon hechtingen.

Plaats vervolgens, met behulp van dissectie-tangen onder een dissectiemicroscoop, de gedeeltelijk gesloten hechtknopen op beide canules iets weg van de uiteinden. Voor midden cerebrale slagader isolatie, gebruik veer schaar en tangen te identificeren en ontleden een onvertakte segment van de middelste hersenslagader, met een binnendiameter van 100 tot 200 micrometer, van de rat hersenen. Gebruik fijne tangen om de middelste hersenslagader op de glazen canules te monteren en draai de hechtingen aan om de slagader aan de canule te beveiligen.

Sluit de distale canule af zodat er geen stroom in de slagader is en sluit de instroompipet aan op een reservoir van PSS. Visualiseer de gebliktuleerde middelste hersenslagader met behulp van een opgeladen apparaatcamera die is gemonteerd op een omgekeerde microscoop en beeldvormingssoftware. Stel de axiale lengte van de MCA zo in dat deze niet stijf of slap lijkt.

Equilibrate het bad oplossing met 95% zuurstof en 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius. Dompel de grond van de versterker onder in de PSS van de myograaf. Verlicht de vatkamer en visualiseer de punt van de micro-elektroder in de badoplossing door de microscoop.

Met behulp van de micromanipulator, beweeg de punt van de micro-elektroden dicht bij de buitenwand van het bloedvat, en begin met de opname. Beweeg langzaam de punt van de micro-elektroden naar het vat, gericht op het midden van het vat. Wanneer de punt in de nabijheid van het vat komt, gaat u de elektrode in één snelle beweging naar voren om het membraan van de spier te impaleren.

Zodra het membraan is doorgedrongen, kunnen veranderingen in het membraanpotentieel worden waargenomen. Raak de micromanipulator niet aan nadat het membraan is gespietst. Wanneer het membraan potentiële veranderingen zijn opgenomen, gebruik de manipulator om de micro-elektroder te verwijderen in een snelle beweging, en stop de opname voor het opslaan van de gegevensbestanden.

Impalement wordt als succesvol beschouwd wanneer er een snelle afbuiging naar negatieve waarden is, het membraanpotentieel minimaal 30 seconden stabiel is en de spanning abrupt terugkeert naar nul millivolt bij verwijdering van de elektrode. Na een succesvolle impalement en membraan potentiële stabilisatie, geneesmiddelen van belang kan worden geperfundeerd in het bad en veranderingen in het membraan potentieel kan worden geregistreerd. In dit representatieve experiment depolariseerde perfusie met kaliumchloride het membraan met ongeveer zes millivolt, terwijl perfusie met een calciumafhankelijke activator van grote geleiding calciumgeactiveerde kaliumkanalen het membraan met bijna vier millivolt hyperpolariseerde.

Het belangrijkste om te onthouden is om zeer resistente micro-elektroden die een korte, geleidelijke taper met een minder-dan-een-micrometer diameter te trekken.