Real-time opvolgen van de DNA Strand Exchange reactie gemedieerd door Rad51
13 februari 2019
Fluorescentie resonantie energie overdracht gebaseerde real-time opvolgen systemen van DNA strand uitwisseling reactie gemedieerd door Rad51 werden ontwikkeld. Met behulp van de protocollen die hier gepresenteerd, zijn wij kundig voor speurder van de vorming van reactie tussenproducten en hun omzetting in producten, terwijl ook het analyseren van de enzymatische kinetiek van de reactie.
Deze methode kan helpen bij het ontcijferen van de stappen in DNA-streng uitwisseling en onthult de molecuul rollen van verschillende eiwitten die betrokken zijn bij combinatie tijdens reparatie. Met deze techniek kunnen we dna-strenguitwisseling in real time monitoren zonder verstoring van de reactie en de operatiekamer gebruiken om de kinetiek van elke reactiestap te bepalen. Met enkele kleine aanpassingen kan deze techniek worden toegepast om de activiteiten van gezuiverde recombinatie-eiwitten afkomstig van andere soorten, zoals zoogdieren en planten, te bestuderen.
Het aantonen van de procedure zal Kentaro Ito zijn, een Post Doc uit mijn laboratorium. Om te beginnen bereidt u de reactiebuffer A volgens het tekstprotocol voor. Voeg vervolgens 36-nanomole 16FA-oligonucleotide toe aan de buffer voor de DNA-koppelingstest.
Incubeer het mengsel op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg RAD-51 eiwit met een uiteindelijke concentratie van 1,5 micro moedervlekken aan het mengsel en uitbroed het op 37 graden celsius gedurende vijf minuten. Voeg SWI5-SFR1 eiwit met een uiteindelijke concentratie van 0,15 micro moedervlekken aan het mengsel, en uitbroed het op 37 graden Celsius voor een extra vijf minuten.
Breng 1,5 milliliter van het mengsel in een 1,0 bij 1,0 cm kwarts cuvette met een magnetische roerder. Steek de cuvette in een spectrofluorometer en ga verder met het aanpassen van de temperatuurregelaar en de magnetische roerder. Nota van de verandering in fam fluorescentie emissie op 525 nanometer bij excitatie op 493 nanometer met een seconde intervallen gedurende 100 seconden.
Tot slot, met een spuit, injecteren ROX gelabeld dubbelstrenged DNA bij een uiteindelijke concentratie van 36 nano mollen in de cuvette. Noteert de verandering in fluorescentie emissie met een seconde intervallen gedurende 30 minuten. Om de fluorescentiespectra tussen de substraten en de eindproducten te vergelijken, voegt u elke cuvette met de 16 FA-oligonucleotiden met of zonder RAD-51 gedurende vijf minuten in een spectrofluorometer en incubbate bij 37 graden Celsius.
Vervolgens registreert u de FAM-fluorescentie-emissie op 500 tot 600 nanometer bij excitatie op 493 nanometer. Om het effect van RAD-51 op de fluorescentiespectra te testen, voegt u RAD-51 toe bij een uiteindelijke concentratie van 1,5 micromol. En het mengsel vijf minuten lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.
Tot slot, record de fluorescentie spectra van 500 tot 600 nanometer bij excitatie op 493 nanometer. De maximale FRET-efficiëntie wordt verkregen door de maximale vermindering van de fluorescentieintensiteit te meten wanneer alle enkelstrengs DNA-substraat in de koppelingstest wordt omgezet in dubbelstrengs DNA. Of door de maximale toename van de intensiteit te meten wanneer alle dubbelstrengs DNA-substraat in de verplaatsingstest wordt omgezet in enkelstrengs DNA.
In beide tests had de toevoeging van RAD-51-eiwit geen invloed op de fluorescentie-emissie van FAM, of de blusefficiëntie ervan door rotsen. De gevolgen van de spontane reacties tussen substraatA's en het verdere fotobleken zijn klein. Zoals blijkt uit de verwaarloosbare veranderingen in de emissie van FAM zonder RAD-51, vergeleken met de aanzienlijke veranderingen die met RAD-51 worden gezien.
Het toevoegen van het SWI5-SFR1 complex stimuleert sterk de koppelingsactiviteit van RAD-51. De koppelingsreactie wordt gesimuleerd met behulp van een driestappenmodel, bestaande uit de vorming van de eerste drie-strengen tussenliggende, overgang in de tweede tussenliggende, en het vrijgeven van de single-stranded DNA en de vorming van de hetero duplex. Een vergelijking van het driestappenmodel met een model in twee stappen geeft aan dat het driestappenmodel beter geschikt is voor het simuleren van DNA-koppeling, zonder of met het SWI5-SFR1-complex.
De berekende evenwichtsconstante van elke reactiestap, met of zonder SWI5-SFR1, toont aan dat het SWI5-SFR1 complex de vorming van de eerste drie-strengentussengang niet stimuleert, maar sterk de overgang tussen de twee drie-strengentussenproducten en het vrijkomen van SS DNA stimuleert. Het is van essentieel belang na te gaan of elke partij gezuiverd eiwit vrij is van nuclease en helicasebesmetting.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor real-time observatie van DNA-strenguitwisselingsreacties gemedieerd door Rad51 met behulp van fluorescentie resonantie energie overdracht. De techniek maakt het mogelijk om reactie-intermediaten te detecteren en enzymatische kinetica te analyseren zonder de reactie te verstoren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Moleculair Biologie
- Genetica
Achtergrond
- DNA-strenguitwisseling is een cruciaal proces in DNA-reparatie.
- Rad51 speelt een belangrijke rol in homologe recombinatie.
- Inzicht in de kinetica van deze reactie kan inzicht geven in DNA-reparatiemechanismen.
- Real-time monitoringtechnieken verbeteren de studie van deze complexe biochemische processen.
Doel van het onderzoek
- Om een systeem te ontwikkelen voor het observeren van DNA-strenguitwisseling in real time.
- Om de rollen van verschillende eiwitten in de reactie te analyseren.
- Om de kinetica van elke stap in het DNA-strenguitwisselingsproces te bepalen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van reactiebuffer en oligonucleotiden voor DNA-paarstellingsassays.
- Incubatie van RAD-51 en SWI5-SFR1 eiwitten met DNA-substraten.
- Gebruik van een spectrofluorometer om fluorescentie veranderingen te monitoren.
- Analyse van reactie-intermediaten en producten door middel van fluorescentie emissiemetingen.
Belangrijkste resultaten
- De toevoeging van SWI5-SFR1 stimuleert de paarstellingsactiviteit van RAD-51 significant.
- Een drie-staps model past beter bij de DNA-paarstelling simulatie vergeleken met een twee-staps model.
- De studie levert kwantitatieve gegevens over de kinetica van DNA-strenguitwisseling.
- Fluorescentiemetingen wezen op minimale effecten van spontane reacties.
Conclusies
- De ontwikkelde methode maakt gedetailleerde kinetische analyse van DNA-strenguitwisseling mogelijk.
- SWI5-SFR1 verhoogt de efficiëntie van RAD-51 in DNA-paarstelling.
- Deze techniek kan worden aangepast voor het bestuderen van recombinatie-eiwitten van verschillende soorten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Real-time observation of DNA strand exchange mediated by Rad51 provides a quantitative framework for evaluating recombination protein function, supporting target validation in DNA repair pathways. The FRET-based assay enables kinetic de-risking of mechanistic hypotheses by resolving transient intermediates, informing lead identification for modulators of homologous recombination. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking protein activity to functional DNA repair outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Rad51-mediated strand exchange to validate therapeutic targets in DNA repair pathways.
- Operational Value: Resolves formation and maturation of three-strand DNA intermediates, clarifying mechanism of action for accessory proteins like Swi5-Sfr1.
- Predictive Value: Supports three-step kinetic modeling that improves confidence in target engagement and pathway modulation predictions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts to measure strand exchange kinetics under varying protein conditions.
- Operational Value: Establishes a homogeneous, solution-based assay format compatible with spectrofluorometric detection for compound screening.
- Assay Readiness: Enables real-time monitoring without reaction disruption, supporting dose-response and time-course analyses for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Facilitates cross-species comparison of recombination protein activity, supporting extrapolation from model systems to human homologs.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes effects of accessory proteins on specific reaction steps, reducing ambiguity in mechanism-based biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Provides a standardized method to assess functional conservation of Rad51 regulators across species, informing target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where kinetic profiling of DNA repair proteins informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how Swi5-Sfr1 stimulates intermediate maturation and ssDNA release in Rad51-mediated strand exchange.
- Screening: Delivers reproducible, real-time FRET signals that enable comparison of inhibitor or activator effects on reaction kinetics.
- Analytics: Provides step-resolved rate constants and equilibrium constants that allow quantitative comparison of protein variants or conditions.
- Translational Research: Enables assessment of evolutionary conservation by applying the assay to recombination proteins from mammals and plants.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing recombinase activity, reducing redundant assay development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving transient intermediates and defining rate-limiting steps.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible kinetic data through real-time fluorescence monitoring in a cuvette-based format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying how accessory proteins modulate specific steps of strand exchange, reducing mechanistic uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets based on quantitative kinetic profiles and evolutionary conservation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence spectroscopy, and kinetic data analysis.
- Dependent on access to a temperature-controlled spectrofluorometer with magnetic stirring and syringe injection capability.
- Necessitates standardized protein preparation to exclude nuclease and helicase contaminants that could confound reaction interpretation.
- Requires optimization of oligonucleotide labeling and concentration for each target species to ensure detectable FRET signals.
- Limited to in vitro systems; does not capture chromatin or nuclear context effects present in vivo.
