Een Protocol voor transcraniale Photobiomodulation therapie bij muizen

Het algemene doel van het volgende experimentele protocol, is het uitvoeren van een transcraniële fotobiomodulatietherapie met behulp van lage niveaus van rode laser bij muizen. Dit wordt bereikt door het directe contact van de lasersonde op het muishoofd. Als eerste stap, om de laserlichttransmissie te evalueren, ontleed je voorzichtig het hersenweefsel uit de schedel.

En meet dan de overgedragen lichtkracht door de schedel plus de hoofdhuid en een millimeter schijfje van het hersenweefsel. In de therapiesectie u rechtstreeks contact opnemen met de punt van de lasersonde op de hoofdhuid in de bregma. Deze ruimtelijke leren en geheugen functies worden geëvalueerd door Barnes doolhof taak.

Vervolgens worden hippocampale ATP-niveaus bepaald door de spectrofotometrische methode. Laser transmissie gegevens tonen aan dat ongeveer 1% van antecedent licht op het hoofdhuidoppervlak bereikte een millimeter diepte van het corticale oppervlak. De resultaten van de Barnes doolhof taak tonen een verbetering van het ruimtelijk geheugen in de oude muizen na twee weken van de transcraniële rode laser behandeling.

Ook suggereren de resultaten een verhoogde hippocampale ATP-niveaus in de met laser behandelde oude muizen. Transcraniële fotobiomodulatie is een niet-invasieve therapeutische benadering voor de behandeling van een breed scala aan neurologische en psychiatrische aandoeningen en voor het verbeteren van een gezonde hersenfunctie. Er wordt zelfs aangenomen dat fotobiomodulatietherapie fotodissociatie van het stikstofmonoxide veroorzaakt uit de cytochrome c oxidase in de mitochondriën.

Deze op hun beurt toenemende mitrochondrile elektronentransport, wat uiteindelijk leidt tot een toename van de ATP-productie. Deze methode is een veilige en kosteneffectieve licht-levering aanpak die wordt uitgevoerd door straling van het hoofd met behulp van externe lichtbronnen, waaronder lasers en lichtgevende diodes. Bijna alle transcraniële fotobiomodulatie procedures worden toegepast met rood op nabij-infrarood licht op golflengte van 600 tot 1100 nanometer, een vermogen variërend van een tot 500 milliwatt, en de fluence variërend van een tot 20 joule per centimeter vierkant.

In een diep verdoofde muis, zorgvuldig ontleden het hersenweefsel uit de schedel. Ten eerste, fix het intacte hersenweefsel op een agarose gel en bereiden alle benodigde materialen, waaronder natriumchloride en lijm. Dan, verspreid een dunne laag lijm op het oppervlak van het vibratome montage blok.

Bevestig voorzichtig het agaroseblok en pas de positie aan. Even overeenkomen met het vibratome blad aan de bovenste oppervlakte van het blok, en neem de teller waarde. Vul de vibratome tank met ijskoude normale zoutoplossing.

Pas de snelheid en trillingsfrequentie van het vibratome aan en verander de teller op de juiste waarde voor het verkrijgen van een plakdikte van een millimeter. Zet de vibratome en de druk op de startknop en snijd de hersenen transversaal in een segment met een dikte van een millimeter. Voeg eerst een druppel water toe op het optische glasoppervlak.

Leg vervolgens de hersenschijf op het glas. Voeg de druppel water op, en zorgvuldig plaats de tweede optische glas. Houd er rekening mee dat een druppel water moet worden toegevoegd aan het monster en de glazen grenzen om weefseldrogen en ook lichtverstrooiing van ruwe oppervlakken te voorkomen.

Breng monsters naar het optische laboratorium. Stel de optische apparaten in en schakel de vermogensmeter in. Draag een bril voor de ogenbescherming voordat u met het laserapparaat gaat werken.

Zet de laser aan en laat de straal op de spiegel richten om de straal naar het actieve gebied van de fotodiode te leiden. Plaats eerst twee lege optische glazen op het oppervlak van de vermogensmeter en lees de uitgezonden lichtkracht van het beeldscherm. Verwijder de lege glazen en plaats het hersenmonster voorzichtig op het oppervlak van de vermogensmeter, richt de bundel op het respectievelijke gebied van het weefsel en lees de overgedragen kracht.

Plaats deze keer een leeg optisch glas op het oppervlak van de vermogensmeter en lees de uitgezonden lichtkracht. Verwijder vervolgens het lege glas en plaats een optisch glas met verse schedel en gescalpeerd weefsel op het oppervlak van de vermogensmeter. Richt de straal op de bregma en lees de overgebrachte kracht.

Ten slotte schakelt u het laserapparaat en de vermogensmeter uit. Therapie sectie van het huidige protocol omvat de toepassing van de klasse 3B laser instrumenten en dit vereist een goede opleiding en veiligheid richtlijnen. Om de dieren aan te passen aan de nieuwe omgeving, breng muizen uit hun kooien naar de therapiekamer ongeveer 20 minuten voor aanvang van de behandeling.

Plaats eerst de stekker van het laserapparaat in een elektrische beschermer. Bedek de punt van de lasersonde met een transparante nylon film om krassen op het sondeoppervlak te voorkomen. Sluit de lasersonde voorzichtig aan op het kanaal van het apparaat.

Draag een bril voor de ogenbescherming voordat u met het laserapparaat gaat werken. Zet het laserapparaat aan en wacht een paar seconden op de opwarming. Pas na het observeren van het laserklare teken op het apparaatpaneel de behandelingsparameters aan, inclusief de bestralingstijd en de werkingsmodus.

Bepaal voordat u met de behandeling begint het gemiddelde laservermogen door contact op te nemen met de punt van de sonde met het actieve gebied van de vermogensmeter op het apparaat. In het huidige protocol wordt de lasersonde op de bregmazone geplaatst, die ongeveer drie millimeter rostral is naar een lijn die tussen de voorste basis van de oren wordt getrokken. Om directe straling naar de ogen van het dier te voorkomen, plaats eerst het puntje van de lasersonde op het hoofd, zet vervolgens de laser aan en houd de sonde stabiel vast tot de voltooiing van de bestraling.

Schakel vervolgens het laserapparaat uit en koppel de sonde los van het apparaat. Reinig de lasersonde aan het einde van de procedure met een geschikte optische reiniger. De ruimtelijke leer- en geheugentaak wordt uitgevoerd in een Barnes doolhof.

Ten eerste, plaats de niet voer teken aan de buitenkant van de taak kamer deur. Bevestig visuele ruimtelijke signalen aan de omtrekmuren. Plaats een videocamera boven het doolhofplatform.

Reinig het oppervlak van het doolhofplatform met 70% ethanol om ongewenste reuksignalen te verwijderen. Voeg een kleine hoeveelheid beddengoed uit de kooi van het dier in de escape box om te dienen als een reuk cue. Voordat u met de taak begint, plaatst u elke muis in de nieuwe kooi en breng u de kooi over naar de Barnes doolhofkamer.

Om te wennen, laat het dier te blijven in de kamer voor 30 minuten voorafgaand aan de taak. Haal vervolgens de muis uit zijn kooi en plaats het dier voorzichtig in de ontsnappingsdoos en laat het daar een minuut blijven. Na een minuut, verwijder voorzichtig de muis uit de ontsnappingsdoos, plaats het dier in het midden van de arena, en zet de startkamer op.

Na een periode van tien seconden, til de startkamer en laat het dier om de arena te verkennen voor drie minuten. Rustig naar de computer ruimte, draag oorbeschermers, en leiden tot een negatieve auditieve stimulus bestaande uit een luide witte ruis. Begin vervolgens met het filmen en observeer het gedrag van dieren op de computermonitor.

Houd er rekening mee dat een zwart doolhof moet worden gebruikt voor het testen van witte muizen. Ook moet een zwarte mat worden geplaatst onder het doolhof in de zaak tracking systeem software moet worden gebruikt. Stel het videotrackingsoftwareprogramma in en haal de parameters van belang uit de opgenomen video's.

Voor een biochemische beoordeling ontleden hippocampusweefsels, homogeniseren ze in een monsterbuffer, centrifugeren en vervolgens de ATP-niveaus beoordelen met behulp van de spectrofotometrische methode. De 660 nanometer laser licht transmissie door de schedel plus hoofdhuid van de oude muizen was ongeveer 16%Ook de waarde van ongeveer 10%werd gemeten als een laser overdracht door middel van een plakje van een millimeter van oude hersenweefsel. Er waren geen statistisch significante verschillen in het logboek van de motorische activiteit in de open veldtest tussen alle experimentele groepen.

Gegevens van Barnes doolhof taak bleek dat de latentie tijden van de oude controle dieren zijn uiteraard langer dan die van de jonge controlegroep op de derde en vierde dag van de training. Echter, de rode laser behandeling aanzienlijk verminderd de latentie tijd op dag vier. In de prop proef sessie, oude controle dieren besteden aanzienlijk kortere tijden in het doel kwadrant in vergelijking met de jonge controledieren.

Echter, de laser-behandelde oude muizen brachten aanzienlijk langere tijden in de doelkwadranten in vergelijking met oude controle muizen. De hippocampal bioenergetica gegevens blijkt een afname van atp niveaus in de oude controle dieren. Aan de andere kant verhoogt de rode laserbehandeling de gemiddelde ATP-inhoud in de hippocampus van de oude muizen aanzienlijk.

We beschreven het protocol voor laboratorium het uitvoeren van een transcraniële fotobiomudulatie therapie procedure bij muizen. Ons protocol kan worden aangepast aan alle andere proefdieren die vaak worden gebruikt in de translationele neurowetenschappen gebied, zoals konijn, hond, aap, et cetera. Op basis van ons onderzoek kunnen lage niveaus van rood licht hippocampale disfunctie in de verouderde hersenen herstellen door de ATP-productie te stimuleren, wat wordt weerspiegeld in een verbeterde ruimtelijke geheugenfunctie.

In deze methode, gebaseerd op welke hersengebieden worden uitgevoerd door pathologie, moeten verschillende fysieke en behandelingsparameters, waaronder bestralingstijd, behandelingsinterval, toegepaste uitstraling en fluence, optimaal worden aangepast om betere resultaten te bereiken. Transcraniële fotobiomodulatie therapie wordt voorgesteld als een veelbelovende aanpak voor het verbeteren van de hersenen metabolisme en cognitieve verbetering die een potentiële strategie voor de leeftijd-gerelateerde cognitieve achteruitgang en neurodegeneratieve ziekten zou kunnen zijn.