Name: Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Leer een verbeterde methode voor de detectie van ubiquitinatieplaatsen in eiwitten via peptideverrijking en massaspectrometrie. Deze aanpak biedt grotere dekking van het ubiquitinoom voor onderzoek naar eiwitregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk maakt deel uit van het project "Proteins at Work", een programma van het Nederlands Proteomics Centrum gefinancierd door NWO in het kader van de Nationale Roadmap Grootschalige Onderzoeksfaciliteiten (projectnummer 184.032.201 ).

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierverzorging en -gebruik (EDC) van het Erasmus MC.
1. Bereiding van de monsters
<ol><li>Gekweekte cellen<ol>
<li>Selecteer een cellijn van belang (bijvoorbeeld HeLa- of osteosarcoom [U2OS]-cellen) en kweek de cellen in Dulbecco's Minimal Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine.</li>
		<li>Voor kwantitatieve proteomics experimenten, cultuurcellen in DMEM ontbreekt arginine en lysine. Het medium moet worden aangevuld met 10% gedialyseerd foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine en alanine-glutamine. Maak twee soorten media door conventionele lysine en arginine ('Light' Medium) of lysine-8 (13C6; 15N2) en arginine-10 (13C6; 15N4) ('Heavy' Medium), respectievelijk.</li>
		<li>Kweekbatches van cellen in Light Medium (d.w.z. ongelabeld) en Heavy Medium (d.w.z. gelabeld, SILAC) voor ten minste zes verdubbelingen voor uitbreiding en behandeling om ervoor te zorgen dat alle eiwitten in de Heavy Medium-cultuur zijn gelabeld met zware stabiele isotoop Aminozuren.</li>
		<li>Behandel de cellen 8 uur met 10 μM van de proteasoomremmer bortezomib of een gelijkwaardig volume DMSO als een mock behandeling. Was de cellen met PBS, scheiden ze met behulp van 1% trypsine / EDTA, en pellet de cellen.</li>
		<li>Lyse de celpellet van één 150 cm2 kweekplaat per geteste toestand in 2 mL ijskoud 50 mM Tris-HCl (pH = 8,2) met 0,5% natriumdeoxycholaat (DOC). Kook het lysaat op 95 °C gedurende 5 min en sonicaat gedurende 10 min (instelling "H" voor de sonicator vermeld in de Tabel van materialen) op 4 °C. We raden het gebruik van deubiquitinase-remmers zoals N-ethylmaleimide (NEM) niet aan, omdat dit ongewenste eiwitmodificaties kan introduceren die de identificatie van peptiden kunnen bemoeilijken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In vivo muishersenweefsel<ol>
<li>Bij het gebruik van in vivo weefsel, lyse het weefsel in een ijskoude buffer met 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 12 mM natrium DOC, en 12 mM natrium N-lauroylsarcosinaat17. Sonicate het lysaat gedurende 10 min (instelling "H" voor de sonicator vermeld in de Table of Materials) bij 4 °C en kook het lysaat gedurende 5 min bij 95 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantitate de totale eiwithoeveelheid met behulp van een colorimetrische absorptie BCA eiwit test kit. De totale hoeveelheid eiwit moet ten minste enkele milligram voor een succesvolle diGly peptide immunoneerslag (IP). Voor SILAC-experimenten mengen de lichte en zware gelabelde eiwitten in een 1:1-verhouding op basis van de totale eiwithoeveelheid.</li>
	<li>Verminder alle eiwitten met 5 mM 1,4-dithiothreitol gedurende 30 min bij 50 °C en alkylaat ze vervolgens met 10 mM iodoacetamide gedurende 15 min in het donker. Voer eiwitvertering uit met Lys-C (1:200 enzym-substraatverhouding) gedurende 4 uur, gevolgd door 's nachts spijsvertering met trypsine (1:50 enzym-substraat verhouding) bij 30 °C of bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Voeg trifluorazijnzuur (TFA) toe aan het verteerd monster tot een eindconcentratie van 0,5% en centrifugeer het monster op 10.000 x g gedurende 10 min om alle wasmiddel neer te slaan en te verwijderen. Verzamel de supernatant met de peptiden voor de daaropvolgende fractionering.</li>
</ol>2. Offline peptide fractionatie
<ol><li>Gebruik hoge pH reverse-phase (RP) C18 chromatografie met polymere stationaire fase materiaal (300 Å, 50 μM; zie Tabel van materialen) geladen in een lege kolom cartridge om de tryptische peptiden fractioneren. De stationaire fasebedgrootte moet worden aangepast aan de hoeveelheid eiwitvergister die moet worden gefractioneerd. Bereid een lege kolomcartridge van 6 mL (zie Materiaaltabel)gevuld met 0,5 g stationair fasemateriaal voor ~ 10 mg eiwitvertering. De eiwitsamenvatting tot stationaire faseverhouding moet ongeveer 1:50 (w/w) zijn.</li>
	<li>Laad de peptiden op de voorbereide kolom en was de kolom met ongeveer 10 kolomvolumes van 0,1% TFA, gevolgd door ongeveer 10 kolomvolumes van H2O.</li>
	<li>Maak de peptiden los in drie fracties met 10 kolomvolumes van 10 mM ammoniumformaatoplossing (pH = 10) met respectievelijk 7%, 13,5% en 50% acetonitril (AcN). Lyophilize alle fracties tot volledigheid.</li>
	<li>Gebruik ubiquitine rest motief (K-ε-GG) antilichamen geconjugeerd om eiwit A agarose kralen voor de immunoverrijking van diGly peptiden. Omdat de exacte hoeveelheid antilichamen per partij kralen eigendomsinformatie is en niet openbaar wordt gemaakt door de fabrikant, wordt aanbevolen om dezelfde definitie te gebruiken voor een partij kralen als de fabrikant doet om verwarring te voorkomen. Was een partij van deze kralen 2x met PBS en splits de kraal drijfmest in zes gelijke fracties. Zie figuur 1 voor een gedetailleerd experimenteel schema.</li>
	<li>Los de drie peptidefracties op die verzameld zijn in stap 2.3 in 1,4 mL van een buffer bestaande uit 50 mM MOPS, 10 mM natriumfosfaat en 50 mM NaCl (pH = 7,2) en draai het puin naar beneden.</li>
	<li>Voeg de supernatanten van de fracties toe aan de diGly antilichaamkralen en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C op een rotator-eenheid. Draai de kralen naar beneden en breng de supernatant over op een verse partij antilichaamkralen en incubeer opnieuw voor 2 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Bewaar de supernatants voor de daaropvolgende wereldwijde proteome (GP) analyse.</li>
	<li>Breng de kralen van elke fractie over in een 200 μL pipettip uitgerust met een GF/F filterplug om de kralen te behouden. Doe de pipettip met de kralen in een microcentrifugebuis van 1,5 mL, uitgerust met een centrifugetipadapter. Was de kralen 3x met 200 μL ijskoude IAP buffer en vervolgens 3x met 200 μL ijskoude milliQ H2O. Draai de kolom op 200 x g voor elke wasstap, maar zorg ervoor dat de kolom niet droog loopt. Los de peptiden af met 2 cycli van 50 μL van 0,15% TFA.</li>
	<li>Desalt de peptiden met behulp van een C18 fase tip (in wezen een 200 μL pipet tip met twee C18 schijven) en droog ze tot volledigheid met behulp van vacuüm centrifugatie.</li>
</ol>3. Nanoflow LC-MS/MS
<ol><li>Voer LC-MS/MS experimenten uit op een gevoelige massaspectrometer gekoppeld aan een nanoflow LC-systeem.</li>
	<li>Gebruik een in-house verpakte 50 cm omgekeerde-fase kolom met een 75 μm binnendiameter verpakt met CSH130 hars (3,5 μm, 130 Å) en los de peptiden met een gradiënt van 2−28% (AcN, 0,1% FA) over 120 min bij 300 nL/min. Alternatief, gebruik commercieel beschikbare LC kolommen met vergelijkbare eigenschappen. Houd de kolom op 50 °C met behulp van een kolomoven, bijvoorbeeld (zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Voer de massaspectrometrieanalyse uit.<ol>
<li>De massaspectrometer moet worden bediend in de DDA-modus (data-dependent acquisition). MS1-massaspectra moeten worden verzameld bij hoge resolutie (bijvoorbeeld 120.000), met een automatische versterkingscontrole (AGC) doelinstelling van 4E5 en een maximale injectietijd van 50 ms in het geval van een Orbitrap massaspectrometer.</li>
		<li>Voer eerst de massaspectrometrieanalyse uit in de modus "Hoogste intensiteit eerst". Op deze manier wordt de meest intense ionen eerst geselecteerd voor fragmentatie, dan de op een na hoogste, enzovoort, met behulp van de topsnelheid methode met een totale cyclustijd van 3 s. Voer vervolgens een tweede ronde DDA MS-analyse uit in de modus "Laagste intensiteit eerst", zodat de minst intense ionen eerst worden geselecteerd, vervolgens de op één na laagste, enzovoort. Deze strategie zorgt voor een optimale detectie van zeer lage abundancy peptiden.</li>
		<li>Filter de voorloperionen op basis van hun ladingstoestanden (2-7 ladingen) en monoisotopische piektoewijzing. Sluit eerder ondervraagde precursoren dynamisch uit voor 60 s. Isoleer peptideprecursoren met een quadrupole massafilter ingesteld op een breedte van 1,6.</li>
		<li>Verzamel MS2-spectra in de ionenval bij een AGC van 7E3 met een maximale injectietijd van 50 ms en HCD-botsenergie van 30%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Gegevensanalyse
<ol><li>Analyseer de massaspectrometrie ruwe bestanden met behulp van een geschikte zoekmachine, zoals de vrij beschikbare MaxQuant software suite op basis van de Andromeda zoekmachine18,19. Selecteer in MaxQuant de standaardinstellingen met een paar aanpassingen die hieronder worden weergegeven. Stel de enzymspecificiteit in op trypsine, met het maximum aantal gemiste decolletés verhoogd tot drie. Stel lysine met een diGly restant (+114.04 Da), oxidatie van methionine en N-terminal acetylatie als variabele modificaties, en stel carbamidomethylatie van cysteïne als een vaste modificatie.</li>
	<li>Voer databasezoekopdrachten uit op een FASTA-bestand met eiwitsequenties die zijn gedownload van bijvoorbeeld de Uniprot-repository<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">(https://www.uniprot.org/downloads)</a>in combinatie met een lokmiddel en een standaard database met veelvoorkomende verontreinigingen die automatisch wordt geleverd door MaxQuant. Stel de false discovery rate (FDR) in op 1% en stel de minimumscore in voor gewijzigde (diGly) peptiden op 40 (standaardwaarde). Uitsluit peptiden die zijn geïdentificeerd met een C-terminal diGly gemodificeerd lysineresidu uit verdere analyse.</li>
	<li>Voor de kwantitatieve analyse van SILAC-experimentbestanden stelt u de veelheid in op "2" en herhaalt u stap 4.2.</li>
	<li>Voer alle downstream analyses uit (bijvoorbeeld statistieken, genontologieanalyses) met de Perseus module20 van de MaxQuant softwaresuite.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Het hier beschreven protocol werd toegepast op monsters uit verschillende biologische bronnen, zoals gekweekte cellen en in vivo weefsel. In alle gevallen identificeerden we duizenden diGly peptiden, op voorwaarde dat de totale eiwitinput hoeveelheid ten minste 1 mg was. De verrijking met behulp van specifieke antilichamen is zeer efficiënt, gezien het feit dat slechts maximaal 100-150 zeer lage overvloedige diGly peptiden werden geïdentificeerd uit hele cellysaten als er geen verrijkingsprocedures voor ubiquitineerde ei...

De vervoeging van ubiquitine aan eiwitten markeert ze voor afbraak door het proteasoom en is een cruciaal proces in proteostase. De C-terminalcarboxylgroep van ubiquitine vormt een isopeptide band met de lysine ε-aminogroep van het doeleiwit1,2. Bovendien kan ubiquitine worden bevestigd aan andere ubiquitinemodules, wat resulteert in de vorming van homogene (d.w.z. K48 of K11) of vertakte (d.w.z. heterogene of gemengde) polyubiquitinestructuren1,3. De meest bekende functie van ubiquitine is zijn rol in proteasomale afbraak, bemiddeld door K48-gebonden polyubiquitine. Het is echter duidelijk geworden dat zowel mono- als polyubiquitinatie ook een rol spelen in vele processen die onafhankelijk zijn van afbraak door het proteasoom. K63-gebonden ketens hebben bijvoorbeeld niet-degradatieve rollen in intracellulaire handel, lysosomale afbraak, kinase signalering, en de DNA-schaderespons4,5. De andere zes koppelingstypen zijn minder overvloedig en hun rollen zijn nog steeds grotendeels raadselachtig, hoewel de eerste aanwijzingen over hun functies in de cel in opkomst zijn, grotendeels vanwege de ontwikkeling van nieuwe instrumenten om koppelingsspecifieke detectie mogelijk te maken6,7.
Massaspectrometrie is uitgegroeid tot een onmisbaar instrument voor proteomen analyses en tegenwoordig duizenden verschillende eiwitten uit vrijwel elke biologische bron kan worden geïdentificeerd in een enkel experiment. Een extra laag van complexiteit wordt gepresenteerd door posttranslationele modificaties (PTMs) van eiwitten (bijvoorbeeld fosforylatie, methylatie, acetylatie en ubiquitinatie) die eiwitactiviteit kunnen moduleren. Grootschalige identificatie van PTM-dragende eiwitten is ook mogelijk gemaakt door ontwikkelingen op het gebied van massaspectrometrie. De relatief lage stoimaginetry van peptiden met PTM's in vergelijking met hun ongewijzigde tegenhangers vormt een technische uitdaging en biochemische verrijkingsstappen zijn over het algemeen noodzakelijk voorafgaand aan de massaspectrometrieanalyse. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende specifieke verrijkingsmethoden ontwikkeld voor de analyse van PtM's.
Vanwege de veelzijdige rollen van eiwitubiquitinatie in de cel, is er een grote vraag naar de ontwikkeling van analytische methoden voor de detectie van ubiquitinatiesites op eiwitten8. De toepassing van massaspectrometrische methoden heeft geleid tot een explosie van het aantal geïdentificeerde ubiquitinatieplaatsen in fruitvlieg-, muizen-, menselijke en gisteiwitten9,10,1111,12,13,14. Een belangrijke stap werd gepresenteerd door de ontwikkeling van op immunoneerslag gebaseerde verrijkingsstrategieën op peptideniveau met behulp van antilichamen gericht tegen het K-ε-GG-restmotief (ook wel 'diglycine' of 'diGly' genoemd). Deze diGly peptiden worden geproduceerd bij de vertering van ubiquitineerde eiwitten met trypsine als protease15,16.
Hier presenteren we een geoptimaliseerde workflow om te verrijken voor diGly peptiden met behulp van immunozuivering en daaropvolgende detectie door Orbitrap massaspectrometrie. Met behulp van een combinatie van verschillende wijzigingen van bestaande workflows, vooral in de monstervoorbereidings- en massaspectrometriestadia, kunnen we nu routinematig meer dan 23.000 diGly peptiden identificeren uit een enkel monster van HeLa-cellen die met een proteasoom worden behandeld remmer en ~ 10.000 uit onbehandelde HeLa-cellen. We hebben dit protocol toegepast op lysaten van zowel ongelabelde als stabiele isotopenetikettering met aminozuren in celkweek (SILAC) met het label HeLa-cellen en op endogene monsters zoals hersenweefsel.
Deze workflow vormt een waardevolle aanvulling op het repertoire van tools voor de analyse van ubiquitinatiesites om de diepe ubiquitinomen te ontdekken. Het volgende protocol beschrijft alle stappen van de werkstroom in detail.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td><td>Supelco</td><td>66883-U</td><td>product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr><tr><td>Ammonium formate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 resin, 3,5 μm, 130 Å</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F filter plug</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lysine, Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>NanoLC oven</td><td>MPI design, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge</td><td>Waters</td><td>WAT036790</td><td>Verwijder de tC18-stof uit de cartridge voordat u de cartridge vult met PLRP-S</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, TPCK Treated</td><td>ThermoFisher</td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

De posttranslationele modificatie van eiwitten door de kleine eiwitubiquitine is betrokken bij vele cellulaire gebeurtenissen. Na tryptische vertering van ubiquitinated eiwitten, peptiden met een diglycine rest geconjugeerd aan de epsilon aminogroep van lysine ('K-ε-diglycine' of gewoon 'diGly') kan worden gebruikt om de oorspronkelijke modificatie site terug te volgen. Efficiënte immunozuivering van diGly peptiden in combinatie met gevoelige detectie door massaspectrometrie heeft geresulteerd in een enorme toename van het aantal ubiquitinatiesites dat up-to-date is geïdentificeerd. We hebben verschillende verbeteringen aangebracht in deze workflow, waaronder offline hoge pH reverse-phase fractionatie van peptiden voorafgaand aan de verrijkingsprocedure, en de opname van meer geavanceerde peptide fragmentatie-instellingen in de ionenroutering multipole. Ook, efficiënter opruimen van het monster met behulp van een filter-gebaseerde plug om de antilichaam kralen te behouden resulteert in een grotere specificiteit voor diGly peptiden. Deze verbeteringen resulteren in de routinedetectie van meer dan 23.000 diGly peptiden uit menselijke cervicale kankercellen (HeLa) cellysaten bij proteasoomremming in de cel. We tonen de werkzaamheid van deze strategie voor diepgaande analyse van de ubiquitinomenprofielen van verschillende celtypen en van in vivo monsters, zoals hersenweefsel. Deze studie presenteert een originele aanvulling op de toolbox voor eiwitubiquitinatie analyse om de diepe cellulaire ubiquitinomen te ontdekken.

Ubiquitineerde eiwitten laten een 114.04 Da diglycine rest op de doel lysine residu wanneer de eiwitten worden verteerd met trypsine. Het massaverschil veroorzaakt door dit motief werd gebruikt om ondubbelzinnig te herkennen de site van alomtegenwoordigheid in een massaspectrometrie experiment. De strategie die we hier beschrijven is een state-of-the-art methode voor de verrijking en daaropvolgende identificatie van diGly peptiden door nanoflow LC-MS/MS (Figuur 1</str...

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

De post translationele modificatie van eiwitten door het kleine eiwit ubiquitine is betrokken bij vele gebeurtenissen in de cel. Deze studie presenteert een originele toevoeging aan de gereedschapskist voor eiwit alomtegenwoordigheid analyse. We gebruiken verrijkingstechnieken en massaspectrometrie om de diepe ubiquitinome te ontdekken.We hebben verschillende verbeteringen aangebracht in de analyse van diGly peptiden die afkomstig zijn van alomtegenwoordige eiwitten. Deze omvatten ruwe peptide fractionatie voorafgaand aan verrijking, en de toepassing van meer geavanceerde peptide fragmentatie instellingen in de Orbitrap. Totaal resulteert dit in een grotere dekking van ubiquitinome.Verschillende aspecten van het protocol zijn moeilijk in woorden te beschrijven. Visualisatie van enkele van de belangrijkste stappen is essentieel om deze analyses door verschillende operatoren in een ander lab te kunnen herhalen. De procedure zal worden aangetoond door Karel Bezstarosti, die een senior technicus in mijn lab.Begin met het voorbereiden van gekweekte cellen of muis hersenweefsel voor het experiment. Als u met cellen werkt, lyse de celpellet van een 150 centimeter kwadraat kweekplaat in twee milliliter ijskoud, 50 millimolar Tris HCL met 0,5% natriumdeoxycholaat. Kook het lysaat vijf minuten op 95 graden Celsius.Dan sonicate het op vier graden Celsius voor 10 minuten. Bij gebruik van in vivo muis hersenweefsel, lyse het in een ijskoude buffer met 100 millimolar Tris HCL, 12 millimolar natrium deoxycholaat en 12 millimolar natrium N-lauroylsarcosinaat. Sonicate de lysate gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.Kook het dan vijf minuten op 95 graden Celsius. Vervolgens kwantificeren de totale eiwithoeveelheid met behulp van een calorimetrische absorptie BCA eiwit test kit, die ten minste enkele milligram voor succesvolle diGly peptide immunoprecipitatie moet zijn. Meng voor SILAC-experimenten de lichte en zware gelabelde eiwitten in een één-op-één verhouding op basis van de totale eiwithoeveelheid.Verlaag alle eiwitten met vijf millimolar DTT gedurende 30 minuten bij 50 graden Celsius. En vervolgens alkylate ze met 10 millimolar iodoacetamide gedurende 15 minuten in het donker. Voer vervolgens gedurende vier uur eiwitvertering uit met Lys-C.En trypsine spijsvertering 's nachts op 30 graden Celsius, of bij kamertemperatuur. Op de volgende dag, verdeel het monster in twee twee milliliter Eppendorf buizen en voeg TFA aan het verteerde monster aan een uiteindelijke concentratie van 0,5%Centrifuge het op 10,000 keer G gedurende 10 minuten te precipiëren en verwijder alle wasmiddel. Verzamel het peptide met supernatant voor latere fractionatie.Gebruik hoge pH-reverse phase C18 chromatografie om de tryptische peptiden te fractioneren. Bereid een lege zes milliliter kolom cartridge gevuld met 0,5 gram stationaire fase materiaal voor ongeveer 10 milligram eiwit verteren. Laad de peptiden op de voorbereide kolom en was deze met ongeveer 10 volumes van 0,1%TFA, gevolgd door 10 volumes water.Elute de peptiden in drie fracties met behulp van 10 kolom volumes van 10 millimolar ammonium formate met zeven, 13,5 en 50% acetonitril, respectievelijk. Dan, litholyse alle fracties. Een partij van ubiquitine restmotief antilichamen geconjugeerd met eiwit A agarose kraal drijfmest is verdeeld in zes gelijke fracties.Los de drie peptidefracties op volgens de handschriftrichtingen en draai het puin naar beneden. Voeg de supernatants van de drie fracties toe aan de kraaldrijfmest terwijl de andere drie fracties op ijs blijven. En broed ze twee uur lang uit bij vier graden Celsius op een rotator unit.Draai dan de kralen naar beneden. Breng de supernatant over naar een verse partij kralen. En herhaal de incubatie met de resterende drie kraaldrijfmestfracties.Bewaar de supernatants voor de volgende wereldwijde proteomeanalyse. En breng de kralen naar 200 microliter pipet tips uitgerust met een GFF filter plug. Doe de tips in 1,5 milliliter buizen uitgerust met een centrifugepuntadapter en was de kralen drie keer met 200 microliters ijskoude IAP-buffer, gevolgd door drie wasbeurten met ijskoud gezuiverd water.Draai de kolommen op 200 keer G gedurende twee minuten tussen wasbeurten, zorg ervoor dat de kolom niet droog lopen. Na de laatste wasbeurt, elute de peptiden met twee cycli op 50 microliter van 0,15%TFA. Desalt de peptiden met een C18 stage tip en droog ze met vacuüm centrifugatie.Lc-MS/MS-experimenten uitvoeren op een gevoelige massaspectrometer gekoppeld aan een nanoflow LC-systeem. De kolom is ingesteld volgens manuscript aanwijzingen en bewaard op 50 graden Celsius. Bedien de massaspectrometer in de gegevensafhankelijke acquisitiemodus.Verzamel de MS1 massaspectra bij hoge resolutie met een geautomatiseerde gain controlled target instelling van 4E5 en een maximale injectietijd van 50 milliseconden. Voer de massaspectrometrieanalyse uit in de meest intense eerste modus, met behulp van de topsnelheidsmethode met een totale cyclustijd van drie seconden. Voer vervolgens een tweede ronde van DDA MS-analyse uit in de minst intense eerste modus, die zorgt voor een optimale detectie van peptiden met een lage overvloed.Filter de voorloper-ionen op basis van hun laadtoestanden en mono-isotopenpiekpiektoewijding. En sluit eerder ondervraagde precursoren dynamisch uit gedurende 60 seconden. Isoleer peptide precursoren met een viervoudige massafilter ingesteld op een breedte van 1,6 Thomson.Verzamel vervolgens MS2-spectra in de ionenval bij een geautomatiseerde gain control van 7E3 met een maximale injectietijd van 50 milliseconden en HCD-botsingsenergie van 30%Analyseer de massaspectrometrie raw-bestanden met behulp van een geschikte zoekmachine, zoals de vrij beschikbare MaxQuant-softwaresuite op basis van de Andromeda-zoekmachine. Open MaxQuant en selecteer de juiste onbewerkte gegevensbestanden. Stel het aantal processors in en klik op het tabblad groepsspecifieke parameters.Selecteer spijsvertering, en zorgen voor drie gemiste decolletés. Selecteer vervolgens wijzigingen en voeg diGly toe aan de variabele wijzigingen. Selecteer het tabblad Globale parameters en voeg de juiste eiwitsequentiedatabase toe.Laat de andere instellingen als standaard en druk op start om de database zoeken uit te voeren. Voor kwantitatieve analyse van SILAC-experimentbestanden stelt u de multipliciteit in op twee en selecteert u de zware aminozuurlabels. Wanneer de zoekopdracht is voltooid, importeert u de tekstbestanden in Perseus.Dit protocol werd gebruikt om alomtegenwoordigingsplaatsen in eiwitten uit gekweekte cellen en in vivo materiaal te identificeren door diGly peptiden te detecteren met nanoflow LC-MS/MS. Verschillende verbeteringen werden aangebracht aan het bestaande protocol dat resulteerde in hogere aantallen gedetecteerde diGly peptiden. Een ruwe fractionering in drie fracties werd uitgevoerd voorafgaand aan immunoprecipitatie.Een van de breuken bevat ubiquitine's eigen K48 gemodificeerd tryptisch diGly peptide, dat wordt gekenmerkt door een brede piek in het LC chromatogram. Bovendien werd het peptidefragmentatieregime aangepast om de LC-MS-runs te combineren met de hoogste eerste en laagste eerste fragmentatieregimes in de data-analyseprocedure, die meer dan 4.000 extra unieke diGly peptiden produceerde. Meer dan 23.000 diGly peptiden kunnen routinematig worden geïdentificeerd uit een enkel monster van HeLa-cellen behandeld met een proteasome remmer.Van alle diGly peptiden geïdentificeerd over drie biologische repliceren schermen, meer dan 9,000 aanwezig waren in alle drie, terwijl meer dan 17.000 aanwezig waren in ten minste twee van de drie replicaten. Het aantal peptide-identificaties is sterk afhankelijk van de hoeveelheid inputmateriaal. Afhankelijk van het uitgangsmateriaal kan een geschatte aantal geïdentificeerde diGly peptiden worden verwacht, maar deze getallen zijn slechts schattingen en zullen ook afhangen van het type massaspectrometer dat wordt gebruikt.Bij het uitvoeren van dit protocol, voorafgaande ervaring met massaspectrometrie gebaseerd proteomics methoden en de behandeling en analyse van minieme monsterhoeveelheden zou zeker voordelig zijn. De MaxQuant software kan worden vervangen door een andere database zoeken algoritme. Ook een ander type massaspectrometer kan worden gebruikt.De resultaten in termen van peptide identificaties kunnen enigszins verschillen, maar dit is typisch voor elke massa spectrometrie gebaseerde proteomics test. Ubiquitine is belangrijk in de uitvoering van gemedieerde eiwitdegradatie, maar speelt ook een rol in vele andere processen in de cel. Diepere kennis van ubiquitine als een post translationele wijziging is cruciaal om de functie ervan beter te begrijpen.

detection-protein-ubiquitination-sites-peptide-enrichment-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

In this video, we demonstrate antibody-based immunoprecipitation of phosphopeptides from a peptide mixture. The enriched phosphopeptides are vacuum concentrated and stored for downstream analysis.

Phosphopeptide Enrichment: An Antibody-based Immunoprecipitation Technique to Separate Specific Phosphorylated Peptides from Complex Peptide Mixtures

This video describes a method to extract and purify ubiquitinylated peptides containing remnant di-glycine peptides from a complex peptide mixture. The presented method may help in identifying original ubiquitination sites in the protein.

Immunoaffinity Based Extraction of Ubiquitinylated Peptides: A Technique to Selectively Extract Ubiquitin Tagged Peptides from Purified Peptide Fractions

Dit protocol beschrijft een procedure om uitpakken en verrijken van phosphopeptides van prostaatkanker cellijnen of weefsels voor een analyse van de phosphoproteome via massa spectrometrie gebaseerde proteomics.

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Leer een verbeterde methode voor de detectie van ubiquitinatieplaatsen in eiwitten via peptideverrijking en massaspectrometrie. Deze aanpak biedt grotere dekking van het ubiquitinoom voor onderzoek naar eiwitregulatie.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Meer video's verkennen