Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

Dit protocol maakt gebruik van CRISPR-Cas9 om knock-out- of knock-inlijnen te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en efficiënt te volgen vooral voor beginnende onderzoekers. Voor celdoorgang behandel u 's nachts gekweekte cellen met twee milliliters van 0,25% trypsine EDTA per plaat bij 37 graden Celsius gedurende twee minuten.

Wanneer de cellen van de plaatbodems zijn opgeheven, neutraliseert u de enzymatische reactie met twee milliliter celkweekmedium en breng de celsuspensie over naar een conische buis. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in vijf milliliter van verse cel cultuur medium voor het tellen. Dan zaad 1,8 keer 10 tot de vijfde cellen in een put van een 24-well weefsel cultuur plaat voor 's nachts cultuur op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Voor de transfectie van de cellen moet, volgens het experimentele ontwerp en de instructies van de fabrikant, een passend volume van de transfectiemix met de juiste concentratie CRISPR-plasmid worden toegevoegd aan het juiste volume van het transfectiereagemiddel. Na het uitbroeden van de transfectie mix bij kamertemperatuur voor de aanbevolen periode, voeg de oplossing aan de cellen in een druppel-wise manier. Draai vervolgens voorzichtig de plaat om te mengen en plaats de plaat in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met 5%kooldioxide.

Voeg aan het einde van de transfectie 150 microliters trypsin-EDTA toe om de cellen te scheiden zoals net is aangetoond en verzamel de losgemaakte cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in 2%foetale runderserum in PBS en filter de cellen door een 30 micrometer mesh zeef in een vijf milliliter fluorescentie-geactiveerde celsorteren, of FACS buis. Gebruik vervolgens de niet-doorgesneden cellen om een negatieve controlepoort op de stroomcytometer in te stellen en de doorgesneden cellen te sorteren op basis van de fluorescerende marker op de CRISPR-plasmide die voor de doorfectie wordt gebruikt in een buis met 100 microliters celkweekmedium.

Wanneer alle transfected cellen zijn verzameld, pellet de cellen door centrifugatie op maximale snelheid en resuspend de pellet in 300 microliters van celkweek medium. Zaad 200 microliter cellen in een put van een 24-well weefsel kweekplaat en laat de cellen om te herstellen voor een paar dagen in een 37 graden Celsius incubator. Pellet de resterende 100 microliters van gesorteerde cellen op maximale snelheid gedurende vijf minuten en haal het genomische DNA uit de resulterende pellet volgens de standaard DNA-extractieprotocollen.

Voeg vervolgens 10 microliter polymerase kettingreactiebuffer, een microliter deoxynucleotidemix, 2,5 microliter van door de gebruiker gedefinieerde reverse primer, 0,5 microliter DNA polymerase, twee tot vijf microliter van de geëxtraheerde genomic DNA-sjabloon en genoeg dubbel gedestilleerd water toe om de reactie naar een uiteindelijk volume van 50 microliter te brengen. Voer het mengsel op een thermische cycler en los de reactie op een 2%agarose gel met behulp van 1X TAE buffer volgens de standaard protocollen. Gebruik een schone, scherpe scalpel om de polymerase keten reageren product accijns en zuiveren van het DNA met behulp van een gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.

Meet de concentratie van het product met behulp van een spectrofotometer op 260 nanometer absorptie. Bereid een testmix met 200 nanogram van het geïsoleerde DNA, twee microliters van T7 endonuclease I reactiebuffer en genoeg dubbel gedestilleerd water om het uiteindelijke volume van het mengsel op 19 microliter te brengen. Reanneal het polymerase kettingreactieproduct in een thermische cycler op de aangegeven parameters en meng vijf eenheden T7 endonuclease I met het gereannealeerde product voor een 50 minuten durende incubatie bij 37 graden Celsius.

Los aan het einde van de incubatie het verteerde DNA op een 2,5%agarosegel op met behulp van 1X TAE-buffer en beeld de gel op een geschikt gelbeeldvormingssysteem. Open de gelafbeelding in ImageJ en teken een rechthoekig vak rond de band zo dicht mogelijk bij de grens. Klik op Analyseren en Metingen instellen, controleer of het gebied, de gemiddelde grijze waarde en de opties voor geïntegreerde dichtheid zijn ingeschakeld.

Klik op OK en selecteer Analyseren en Meten. De gemiddelde, of ruwe intensiteit dichtheid waarde, is indicatief voor de band intensiteit. Wanneer de cultuur-transfected cellen beginnen steeds vloeiend, los ze met trypsin-EDTA, zoals aangetoond, en zaad van de cellen schaars in een 100 millimeter weefsel cultuur schotel om voldoende ruimte voor individuele kolonies om te groeien voordat de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator.

Wanneer de kolonies beginnen te vormen, gebruik dan een microscoop met een 4 X vergroting om de individuele kolonies te halen voor overdracht in individuele putten van een 24-bron plaat met 500 microliter van celcultuur medium per goed. Zorg ervoor dat uw tip niet de omliggende kolonies raakt om te voorkomen dat het mengen van kolonies binnen individuele putten of kies uit een gebied van schaarse kolonie groei. Wanneer alle klonen zijn geplukt, plaats de plaat in de celcultuur incubator totdat de culturen worden confluent.

Omdat onverteerde plasmiden supergerold zijn, lopen ze meestal sneller dan hun gelinelineiseerde tegenhangers. Om te bepalen of de oligonucleotiden met succes zijn gekloond in de CRISPR plasmid backbone, wordt kolonie PCR uitgevoerd en worden de positieve klonen ingeënt voordat de plasmiden worden geëxtraheerd en verzonden voor Sanger sequencing. Het fluorescerende signaal kan gemakkelijk worden gevisualiseerd onder een microscoop bij een succesvolle levering van de plasmiden, waardoor de doorfecteerde cellen kunnen worden gesorteerd op stroomcytometrie.

Een T7 endonuclease I test wordt uitgevoerd om de decolleté efficiëntie van het genomische DNA te controleren, zoals berekend op basis van de intensiteit van de banden waargenomen op een agarose gel. Bovendien, als een homo-gestuurde reparatie-gebaseerde experiment is ontworpen om een beperking site op te nemen op de doel locus, een beperking fragment lengte polymorfisme test kan worden uitgevoerd met een overeenkomstige beperking enzym. Om verder te valideren dat een eiwitcompederend gen met succes is geïnactiveerd, kan een westerse vlek worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen gericht eiwit aanwezig is.

Het sorteren van de cellen na transfectie elimineert de cellen zonder opgenomen plasmiden, waardoor het percentage cellen dat in latere stadia wordt gescreend, toeneemt als een knock-out- of knock-in gen. Met de ontwikkeling van deze techniek zijn we nu in staat om knock-out cellijnen te produceren om de genfunctie en knock-in cellijnen te bestuderen om specifieke ziekten te modelleren om hun mechanisme te begrijpen.